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用于识别非酒精性脂肪肝病中血栓反应蛋白1的医疗决策支持平台 通过 免疫浸润分析

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DOI：

10.3791/67328

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2024年8月30日

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1Department of Geriatric Cardiology, General Hospital of Southern Theater Command, 2Guangzhou Key Laboratory of Cardiac Rehabilitation, 3Branch of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 4The First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 5Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Cardiovascular Department/The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 6Department of Electronics & Communication Engineering, Mepco Schlenk Engineering College, 7Department of Teleinformatics Engineering, Federal University of Ceará

本文内容

摘要

本研究通过共表达基因探讨了非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）与心肌梗死（MI）之间的关系，鉴定出血小板反应蛋白1（THBS1）可作为生物标志物。免疫浸润分析显示，CD8+ T细胞和中性粒细胞是关键因素，THBS1在NAFLD和MI的诊断中具有潜在应用价值。

摘要

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）是两种具有高发病率和高死亡率的主要健康负担。本研究旨在探索共表达基因，以阐明NAFLD与MI之间的关联，并利用生物信息学和机器学习方法识别NAFLD相关MI的潜在关键生物标志物。研究进行了功能富集分析，构建了共蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络图，并采用支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）和最小绝对收缩与选择算子（LASSO）技术，鉴定出一个差异表达基因——血小板反应蛋白1（Thrombospondin 1, THBS1）。THBS1在区分NAFLD患者（AUC = 0.981）和MI患者（AUC = 0.900）方面表现出优异性能。免疫浸润分析显示，NAFLD和MI患者的CD8+ T细胞水平显著降低，而中性粒细胞水平升高。CD8+ T细胞和中性粒细胞在区分NAFLD/MI患者与健康对照者方面具有有效性。相关性分析表明，在NAFLD和MI患者中，THBS1与CCR（趋化因子受体）、MHC类别（主要组织相容性复合体类别）、中性粒细胞、旁炎症（parainflammation）及Tfh（滤泡辅助性T细胞）呈正相关，而与CD8+ T细胞、细胞溶解活性及TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）呈负相关。THBS1作为一种新型生物标志物，在区分NAFLD/MI患者与健康对照者方面展现出潜力。研究结果提示，CD8+ T细胞和中性粒细胞可作为区分NAFLD/MI患者与健康个体的炎症免疫特征。

引言

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种重大的公共卫生问题，其患病率为25%-30%1。已有报道指出，NAFLD在糖尿病患者中的患病率较高2。然而，NAFLD在非糖尿病患者中的意义尚不明确。研究表明，NAFLD在动脉粥样硬化的发病机制中发挥着独立作用3,4。此外，一项荟萃分析显示，NAFLD与冠状动脉钙化、内皮功能障碍及动脉粥样硬化密切相关，并已成为独立的心血管危险因素5。NAFLD与心血管疾病之间的关联仍需进一步研究。

心肌梗死（MI）是一种危及全球患者及其家庭健康的灾难性疾病，并带来沉重的经济负担6. 心肌梗死（MI）也是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者死亡的主要原因之一。一项发表于 英国医学杂志 已表明，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者发生心肌梗死的风险是非NAFLD患者的1.17倍7,8一些研究已鉴定出与非酒精性脂肪性肝病相关心肌损伤相关的分子通路，包括炎症、氧化应激和脂质代谢。9,10,11然而，NAFLD 与 MI 之间关联的潜在机制仍不明确。鉴定与 NAFLD 和 MI 预后相关的新生物标志物至关重要。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的患病率不断上升，影响着广泛的人群，凸显出一个重要的公共卫生问题，尤其是考虑到其与糖尿病的关联。然而，NAFLD对非糖尿病患者的影响仍缺乏充分认识。NAFLD已被证实参与动脉粥样硬化的发病机制，并被公认为独立的心血管危险因素，与冠状动脉钙化、内皮功能障碍及动脉粥样硬化密切相关。尽管存在这些关联，NAFLD与心肌梗死（MI）等心血管疾病之间的确切作用机制仍需进一步阐明。心肌梗死是全球主要的死亡原因之一，带来显著的经济负担。NAFLD患者发生心肌梗死的风险明显高于无NAFLD者，突显出深入理解这些疾病之间分子通路的必要性。尽管已有研究提示炎症、氧化应激和脂质代谢紊乱可能是潜在的促成因素，但其确切机制尚不明确。目前迫切需要鉴定新的生物标志物，以增进对NAFLD相关心肌梗死预后评估和临床管理的理解。

因此，本研究从美国国家生物技术信息中心基因表达综合数据库（NCBI-GEO，参见材料表）下载了非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）的RNA微阵列数据集，以识别并分析NAFLD与MI之间差异表达基因（DEGs）的相互作用。采用富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图构建、支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）以及最小绝对收缩与选择算子（LASSO）算法来识别枢纽基因12,13,14,15,16,17,18,19。通过免疫浸润分析评估NAFLD和MI患者体内的免疫细胞情况。最终，整合上述方法以阐明NAFLD与MI之间的关联。图1展示了本研究遵循的设计流程。本研究结合生物信息学、机器学习和免疫浸润分析，旨在为新型医学决策支持平台的开发提供贡献。

本文的主要贡献包括：（1）共表达基因的鉴定：通过鉴定非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）与心肌梗死（MI）之间的共表达基因，揭示了这两种疾病之间的关联，深化了对二者分子机制联系的理解。（2）生物信息学与机器学习方法的应用：研究采用生物信息学和机器学习技术，包括支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）17 和最小绝对收缩与选择算子（LASSO）19，鉴定出差异表达基因 THBS1。THBS1 在区分 NAFLD 和 MI 患者与健康对照者方面表现出高判别效能。（3）免疫浸润分析：研究进行了免疫浸润分析，发现 NAFLD 和 MI 患者体内 CD8+ T 细胞水平显著降低，而中性粒细胞水平显著升高。（4）相关性分析：研究显示，THBS1 的表达与多种免疫因子呈正相关，包括趋化因子受体（CCR）、主要组织相容性复合体 I 类分子（MHC class I）、中性粒细胞、副炎症状态及滤泡辅助性 T 细胞（Tfh）；而与 CD8+ T 细胞、细胞溶解活性以及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）呈负相关。

方案

所使用的数据库、网页链接以及软件/程序包的详细信息列在材料表中。模拟参数见表1。

1. 获取RNA微阵列数据集

  1. 从 NCBI-GEO 数据库下载心肌梗死（MI）数据集 GSE66360。
  2. 从 NCBI-GEO 数据库下载非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）数据集 GSE89632。
  3. 确保下载的数据集包含 49 个 MI 样本、50 个健康对照样本（GSE66360），以及 39 个 NAFLD 样本和 24 个健康对照样本（GSE89632）。

2. 差异表达基因的鉴定

  1. 数据预处理与差异表达基因（DEG）鉴定
    1. 使用适当的 R 函数将数据集载入 RStudio 。
    2. 利用 R 软件包 limma 鉴定差异表达基因（DEGs）12，筛选阈值如下：P < 0.05 且 |log FC| > 1.5。
    3. 使用 R 软件包 pheatmap、ggplot2 和 Venn 生成热图和维恩图，用于可视化差异表达基因。
  2. 创建可视化图表
    1. 使用 pheatmap 生成差异表达基因的热图。
    2. 使用 ggplot2 绘制维恩图，展示非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）与心肌梗死（MI）之间差异表达基因的重叠情况。

3. 富集分析

  1. 进行 GO、KEGG 和 DO 富集分析
    1. 将差异表达基因（DEGs）载入 R 软件包 clusterProfiler13 中。
    2. 进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析，将差异表达基因分类至分子功能、生物过程和细胞组分。
    3. 执行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析，将差异表达基因映射到生化通路中。
    4. 利用疾病本体（Disease Ontology, DO）富集分析，将差异表达基因与特定临床状态相关联。

4. 通过构建蛋白质-蛋白质相互作用网络进行PPI分析

  1. 使用 STRING 在线平台14 构建共差异表达基因（co-DEGs）的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，置信度分数设为 0.4。
  2. 使用 Cytoscape15 可视化 PPI 网络。

5. 应用机器学习算法筛选候选枢纽差异表达基因

  1. 在 RStudio 中使用 SVM-RFE（支持向量机-递归特征消除）和 LASSO（最小绝对收缩与选择算子）回归算法来筛选最相关的差异表达基因16,17,18。
  2. 确保 SVM-RFE 迭代地对特征进行排序并逐个剔除，而 LASSO 回归19 通过正则化方法识别出稀疏的差异表达基因集合。

6. 用于评估诊断性能的 ROC 曲线构建

  1. 使用 RStudio 进行 ROC（受试者工作特征）曲线分析20。
  2. 计算关键共表达差异基因（co-DEGs）的曲线下面积（AUC）。

7. 免疫浸润分析以探索免疫浸润

  1. 使用 R 软件包 GSVA 和 GSEABase 对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）样本进行单样本基因集富集分析（ssGSEA），以分析其免疫浸润情况21。
  2. 比较 NAFLD 和 MI 样本与健康对照组之间各类免疫细胞的相对丰度。

8. 统计学分析

  1. 在 RStudio 中执行所有统计分析。
  2. 应用皮尔逊相关性分析来检测基因共表达模式。
  3. 以 P < 0.05 确保统计学显著性。
    注意：在开始本方案之前，请确保所有软件和 R 软件包均已正确安装并更新至最新版本。

结果

本研究提出的关键发现如下，涵盖了为阐明非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）潜在分子机制而开展的多种分析。

差异表达基因的鉴定
在GSE89632数据集中，鉴定出76个上调基因和20个下调基因作为非酒精性脂肪性肝病相关差异表达基因（NAFLD-DEGs）（图2B、D）；而在GSE66360数据集中，鉴定出118个上调基因和8个下调基因作为心肌梗死相关差异表达基因（MI-DEGs）（图2C、E）。随后，通过NAFLD-DEGs与MI-DEGs的交集分析获得共表达差异表达基因（co-DEGs），在co-DEGs中鉴定出13个上调的差异表达基因和1个下调的差异表达基因（图2A）。

鉴定非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）各自特有以及两者共有的差异表达基因（DEGs），有助于深入理解这些疾病的分子机制。明确与这两种疾病相关的独特及共有的基因表达模式，有助于阐明NAFLD和MI的病理生理过程，并可能发现潜在的治疗干预分子靶点。对共有的差异表达基因（co-DEGs）进一步研究，可能揭示介导这两种疾病相互作用的关键调控因子或信号通路，从而推动针对NAFLD和MI相关不良健康结局的靶向治疗策略的开发。

富集分析
GO 分析显示，NAFLD 差异表达基因（DEGs）主要富集于以下生物学过程（BP）：脂肪细胞分化、对脂多糖的响应以及多细胞生物体过程（p < 0.05，图 3A）。在细胞组分（CC）方面，NAFLD 差异表达基因主要与磷脂酰肌醇3-激酶复合物、分泌颗粒腔和细胞质囊泡腔相关（p < 0.05，图 3A）。在分子功能（MF）方面，关键功能包括磷脂酰肌醇-3-激酶调节活性、DNA结合转录激活活性（RNA聚合酶特异性）以及通用DNA结合转录激活活性（p < 0.05，图 3A）。

对于MI-DEGs，BP分析显示在白细胞趋化性、髓系白细胞活化和细胞趋化性方面富集（p < 0.05，图3B）。CC分析表明在三级颗粒、富含ficolin-1的颗粒以及分泌颗粒腔内显著富集（p < 0.05，图3B）。MF分析揭示了模式识别受体活性、RAGE受体结合以及免疫受体活性的富集（p < 0.05，图3B）。

KEGG 富集分析表明，NAFLD 差异表达基因（DEGs）在以下通路中显著富集：IL-17、AGE-RAGE、TNF、破骨细胞分化、疟疾、类风湿性关节炎、恰加斯病以及 JAK-STAT 信号通路（p < 0.05，图 3C）。MI 差异表达基因（DEGs）则在 IL-17、TNF、脂质代谢与动脉粥样硬化、Toll 样受体信号通路、C 型凝集素受体信号通路、军团菌病、类风湿性关节炎以及 NF-κB 信号通路中富集（p < 0.05，图 3D）。疾病本体（DO）富集分析显示，NAFLD 和 MI 的前三大差异表达基因均显著与动脉粥样硬化、动脉硬化性心血管疾病及动脉硬化相关（p < 0.05，图 3E-F）。

PPI 网络图分析
在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的 PPI 网络图中，共识别出 92 个节点和 250 条边，反映了与该疾病相关的蛋白质之间复杂的相互作用网络。类似地，在心肌梗死（MI）的 PPI 网络图中，共识别出 117 个节点和 587 条边，表明其分子图景具有更为复杂的网络特征。此外，在共表达差异基因（co-DEGs）的 PPI 网络图中，共识别出 14 个节点和 21 条边，突显了 NAFLD 与 MI 共享的蛋白质之间潜在的关键相互作用（图 4A-F）。

蛋白质-蛋白质相互作用网络对于构建和分析治疗靶点具有重要价值，并为理解非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）与心肌梗死（MI）分子层面的关联机制提供了关键见解。NAFLD与MI中观察到的独特网络拓扑结构，突显了这两种疾病所涉及的不同病理生理机制。此外，共表达差异基因（co-DEGs）之间共享连接的发现，提示可能存在介导MI与NAFLD相互作用的共同通路或调控网络。对这些连接的进一步研究有望揭示新的分子干预靶点，推动治疗策略的开发，从而为这些复杂疾病提供新的治疗选择。

候选枢纽差异表达基因（DEG）筛选
采用支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）算法17筛选潜在的关键差异表达基因，结果在GSE89632数据集中鉴定出6个基因，在GSE66360数据集中鉴定出4个基因（图5A、B）。同样地，使用LASSO算法19识别候选关键差异表达基因，在GSE89632数据集中获得4个基因，在GSE66360数据集中获得5个基因（图5C、D）。值得注意的是，维恩图显示了通过SVM-RFE、LASSO和共蛋白互作（co-PPI）网络分析共同鉴定出的枢纽差异表达基因（THBS1），突显了该基因在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）发病机制中的重要意义（图5F）。

这些先进的机器学习算法为识别与心肌梗死（MI）和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相关的关键差异表达基因（DEGs）提供了 robust 的框架，并对其作为治疗或诊断靶点的潜力提供了有价值的见解。通过多种分析技术鉴定出 THBS1 为枢纽基因，凸显了其在两种疾病分子通路中的重要性。进一步研究 THBS1 的功能意义及其在共蛋白质相互作用（co-PPI）网络中的相互作用，可能揭示 NAFLD 与 MI 之间关联的新机制，从而为靶向治疗和精准医学策略的开发奠定基础。

一个核心差异表达基因的诊断价值
在 NAFLD 和 MI 数据集中，通过 ROC 分析评估所鉴定的核心差异表达基因（hub DEGs）的诊断效能。如图6A、B所示，THBS1 表现出较高的区分能力，在 NAFLD 患者中的 AUC 为 0.981（95% CI：0.949–1.000），在 MI 患者中的 AUC 为 0.900（95% CI：0.834–0.956）。THBS1 作为诊断生物标志物的优异表现，凸显了其在区分 NAFLD、MI 与健康对照组方面的潜在应用价值。

这些结果表明，THBS1 可能作为疾病状态的有价值标志物，为临床医生提供一种用于风险评估和早期识别的有用工具。为了促进 THBS1 在临床实践中的应用，并改善患者的诊疗与管理，仍需开展进一步的验证研究，以确认其在不同患者群体和多种临床环境中的诊断准确性。

免疫浸润分析
采用ssGSEA分析NAFLD/MI组与对照组（CON）之间29个免疫相关基因的差异。与CON组相比，NAFLD组和MI组的免疫细胞浸润显著增加，尤其是CCR、MHC I类分子、中性粒细胞、副炎症反应及Tfh细胞（p < 0.05，图7A、B）。相反，NAFLD组和MI组中某些免疫细胞浸润水平较CON组明显降低，特别是CD8+ T细胞、细胞溶解活性以及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）（p < 0.05，图7C、D）。

这些结果表明，在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）中均存在免疫细胞浸润的失调，凸显了与这些疾病相关的复杂免疫学特征。所观察到的免疫细胞组成变化为理解这些疾病发生及病理生理过程中涉及的免疫学机制提供了重要见解。进一步阐明这些免疫学特征，可能揭示新的治疗干预靶点，并有助于根据NAFLD和MI患者的免疫学特征制定个体化治疗方案。

基因分析流程图；通过limma进行差异表达基因鉴定，KEGG，PPI，LASSO用于生物信息学研究中的验证。
图1：用于识别THBS1的医学决策支持系统的设计流程。 请点击此处查看此图的放大版本。

维恩图、火山图、热图；基因表达分析；生物信息学数据可视化。
图 2：维恩图、火山图和热图。（A）GSE89632 和 GSE66360 的维恩图。（B）GSE89632 中差异表达基因（DEGs）的火山图。（C）GSE66360 中差异表达基因（DEGs）的火山图。（D）GSE89632 中差异表达基因（DEGs）的热图。（E）GSE66360 中差异表达基因（DEGs）的热图。请点击此处查看该图的放大版本。

生物过程分析图表和环形图；统计数据显示，基因表达。
图3：差异表达基因（DEGs）的富集分析。（A）非酒精性脂肪性肝病（NALFD）相关差异表达基因在生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）中富集的前五个基因本体（GO）条目。（B）心肌梗死（MI）相关差异表达基因在BP、CC和MF中富集的前五个GO条目。（C）NALFD-DEGs在KEGG信号通路中显著富集的前八条通路。（D）MI-DEGs在KEGG信号通路中显著富集的前八条通路。（E）NALFD-DEGs在疾病本体（DO）中富集的前五个条目。（F）MI-DEGs在疾病本体（DO）中富集的前五个条目。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质相互作用网络图，展示基因相互作用和网络连接性分析。
图 4：蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图。（A）从 String 在线平台获取的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的 PPI 网络图。（B）通过 Cytoscape 获得的 NAFLD 的 PPI 网络图。（C）从 String 在线平台获取的心肌梗死（MI）的 PPI 网络图。（D）通过 Cytoscape 获得的 MI 的 PPI 网络图。（E）蛋白质相互作用的 PPI 网络图。（F）IL1B 和 FOS 的 PPI 网络图。请点击此处查看该图的放大版本。

数据挖掘方法中变量筛选的统计分析图与维恩图。
图 5：候选枢纽差异表达基因（DEG）筛选。（A）通过支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中获得的六个关键差异表达基因（DEG）。（B）通过SVM-RFE在心肌梗死（MI）中获得的四个关键差异表达基因（DEG）。（C）通过最小绝对收缩与选择算子（LASSO）在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）中获得的四个关键差异表达基因（DEG）。（D）通过LASSO在心肌梗死（MI）中获得的五个关键差异表达基因（DEG）。（E）维恩图中上述结果仅交集得到一个差异表达基因（DEG）。请点击此处查看该图的放大版本。

THBS1 ROC曲线分析，AUC=0.981/0.900，灵敏度 vs. 1-特异性，诊断性能图表。
图6：一个枢纽差异表达基因（DEGs）的诊断价值。 （A）NAFLD中的ROC曲线。（B）MI中的ROC曲线。请点击此处查看该图的放大版本。

分析基因表达和免疫细胞比例的数据集的小提琴图和相关性图表
图7：非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）中浸润性免疫细胞的分布，以及THBS1与浸润性免疫细胞之间的相关性。 （A）NAFLD中浸润性免疫细胞的分布。（B）MI中浸润性免疫细胞的分布。（C）NAFLD中THBS1与浸润性免疫细胞之间的相关性。（D）MI中THBS1与浸润性免疫细胞之间的相关性。请点击此处查看该图的放大版本。

缩写命名
AUC曲线下面积
BP生物过程
CC细胞组分
CON对照
DEG差异表达基因
DO疾病本体
GO基因本体
KEGG京都基因与基因组百科全书
LASSO最小绝对收缩与选择算子
MF分子功能
MI心肌梗死
NAFLD非酒精性脂肪性肝病
PPI蛋白质-蛋白质相互作用
ROC受试者工作特征曲线
ssGSEA单样本基因集富集分析
SVM-RFE支持向量机-递归特征消除
THBS1Thrombospondin 1

表1：实验中使用的模拟参数。

讨论

本研究中描述的方法对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）潜在分子机制的研究具有重要意义。通过鉴定如THBS1等关键生物标志物，所提出的方案为诊断和治疗干预提供了潜在靶点。该方法可拓展至其他涉及多条通路和免疫反应的复杂疾病，有助于发现新的生物标志物和治疗靶点。此外，生物信息学与机器学习技术的整合为个体化医学提供了灵活的框架，可根据个体的分子特征制定个性化的治疗策略。该方法还可适用于临床环境，通过靶向干预提高诊断准确性，改善患者预后。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）是两种具有高发病率和高死亡率的主要健康负担。NAFLD 的特征是脂质在肝脏中积聚1。越来越多的证据表明，NAFLD 不仅对心脏的结构完整性产生不利影响，还会影响其功能，尤其是在心肌梗死的背景下22,23,24。此外，已有强有力的证据表明 NAFLD 与动脉粥样硬化之间存在显著相关性。研究发现，非糖尿病 MI 患者中 NAFLD 的患病率和严重程度与冠状动脉疾病相关25。中至重度 NAFLD 已被证实是一个独立危险因素，可使多支冠状动脉病变的风险增加三倍4。然而，这些研究主要集中在 NAFLD 与 MI 之间的关系，导致 NAFLD 与动脉粥样硬化之间关联的潜在机制仍不明确。因此，探索这些机制对于预防 NAFLD 相关的心肌梗死至关重要。

本研究从 NCBI-GEO 获取了两组数据集。分析结果显示，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）与心肌梗死（MI）之间存在 13 个上调的差异表达基因（DEG）和 1 个下调的差异表达基因。随后进行了功能富集分析，构建了共表达蛋白互作网络（co-PPI）图谱，并采用两种机器学习算法筛选核心差异表达基因（hub DEG）。结果表明，THBS1 是一个对 NAFLD 和 MI 均具有优异诊断效能的新型生物标志物。支持向量机（Support Vector Machine, SVM）是一种广泛用于分类与回归的有监督机器学习技术17。递归特征消除（Recursive feature elimination, RFE）有助于从样本中筛选出最具显著性的基因。LASSO 回归算法19通过正则化方法提高预测准确性。结合这些算法与共表达差异基因（co-DEG），我们成功筛选出最优的差异表达基因。

基于两种机器学习算法及共表达差异表达基因（co-DEGs）的分析，血小板反应蛋白1（Thrombospondin 1，THBS1或TSP1）被鉴定为一个关键的诊断性枢纽差异表达基因。THBS1属于细胞外基质蛋白家族，最初在血小板中被发现，可响应凝血酶刺激而表达26多种细胞（包括内皮细胞、肝星状细胞和平滑肌细胞）均可产生并分泌 THBS1 至胞外空间27,28,29. THBS1 与 CD36 相互作用，CD36 是一种已知的配体30，并通过调控CD36发挥抗血管生成作用29,31，强调了其在心血管疾病中的重要作用。此外，THBS1 可通过与 CD47、转化生长因子-β 和整联蛋白等受体和蛋白质的相互作用，调控血管生成和血小板聚集32这表明 THBS1 可能在心肌梗死期间的血栓形成、易损斑块破裂以及随后的心室重构中发挥关键作用33,34,35.

此外，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生发展与循环中分泌蛋白的合成密切相关。发表在《EBioMedicine》上的一项关键研究表明，作为分泌蛋白的THBS1可作为NAFLD的一种新型生物标志物。该研究还发现，外源性给予THBS1可通过抑制脂质合成通路改善肝脏脂质沉积36。值得注意的是，CD36被鉴定为介导THBS1抗NAFLD作用的关键受体。此外，THBS1的一种肽类类似物ABT-526已被证实可抑制肝细胞中的脂质合成。这些发现为NAFLD的诊断与治疗提供了新的思路，并提示THBS1可能同时作为NAFLD和心肌梗死（MI）的新型生物标志物，有望成为一种快速、简便且易于获取的诊断工具。

近期证据表明，免疫-炎症反应在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）的进展中起着关键作用。主要特征包括细胞因子表达、免疫调节以及神经内分泌系统的激活。Wabitsch 等人证明，二甲双胍可通过抑制 NAFLD 小鼠中 CD8+ T 细胞的表达而发挥肝脏保护作用37。Dolejsi 等人报道，CD8+ T 细胞数量减少，并伴随心肌修复能力显著下降38。Qin 等人发现，中性粒细胞作为全身免疫-炎症指数的一部分，与 NAFLD 患者的尿白蛋白排泄相关39。Zhang 等人指出，中性粒细胞的浸润和脱颗粒参与了心肌梗死过程中的损伤与恢复阶段27。

与这些发现一致，本研究结果表明，在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）患者中，CCR、MHC I类分子、中性粒细胞、旁炎症反应及Tfh细胞的浸润增加，而CD8+ T细胞、细胞溶解活性和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）则较健康对照组减少。此外，相关性分析显示，在NAFLD和MI患者中，THBS1的表达与CCR、MHC I类分子、中性粒细胞、旁炎症反应及Tfh细胞呈正相关，而与CD8+ T细胞、细胞溶解活性和TIL呈负相关。这些结果提示，THBS1可能通过上调CCR、MHC I类分子、中性粒细胞、旁炎症反应及Tfh细胞，同时下调CD8+ T细胞、细胞溶解活性和TIL，参与NAFLD和MI发生与发展的免疫应答调控。然而，这些推测仍需进一步研究以明确THBS1在上述过程中的确切作用。

本研究旨在通过全面的生物信息学和机器学习方法，阐明非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）与心肌梗死（MI）之间的分子关联。研究结果在NAFLD中鉴定出96个差异表达基因（DEGs），在MI中鉴定出126个差异表达基因，其中14个基因在两种疾病中重叠。功能富集分析显示，这些差异表达基因参与了脂肪细胞分化、白细胞趋化、IL-17信号通路、TNF信号通路以及NF-κB信号通路等关键生物学过程和通路。这些结果凸显了炎症与代谢通路在NAFLD和MI中的复杂相互作用。通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，并结合机器学习分析（SVM-RFE和LASSO），鉴定出THBS1为关键枢纽基因。THBS1表现出优异的诊断效能，在NAFLD中的曲线下面积（AUC）为0.981，在MI中为0.900，提示其可能作为这两种疾病的可靠生物标志物。

此外，免疫浸润分析显示，与健康对照组相比，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）患者的免疫细胞谱存在显著差异。具体而言，NAFLD和MI患者中CCR、MHC I类分子、中性粒细胞、旁炎症反应以及滤泡辅助性T细胞（Tfh）的浸润增加，而CD8+ T细胞水平、细胞溶解活性以及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）则减少。这些免疫特征凸显了这两种疾病的炎症本质，并强调了THBS1在调节免疫反应中的作用。

本研究揭示了非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）与心肌梗死（MI）共同的分子机制，其中THBS1作为一种新的诊断生物标志物及潜在的治疗靶点脱颖而出。研究结果为未来针对这些相互关联疾病的靶向干预和个体化治疗策略奠定了基础。通过整合生物信息学、机器学习和免疫浸润分析，该研究推动了医学决策支持平台的开发，旨在改善NAFLD和MI的临床管理。

致谢

本研究由国家自然科学基金（编号 62271511、U21A200949）、南部战区总医院育才基金（2022NZC011）、广州市科技计划项目（2023A03J0170）、国家老年医学临床研究中心（NCRCG-PLAGH-2023006）以及广东省基础与应用基础研究基金（编号 2020A1515010288、2021A1515220101）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.6.1用于可视化蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络
MI 数据集 GSE66360（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）NCBI-GEO 数据库 -用于收集RNA微阵列数据集进行分析
R 包 clusterProfilerBioconductor -用于 GO、KEGG 和 DO 富集分析
R 包 ggplot2CRAN -用于创建维恩图及其他可视化图形
R 包 GSEABaseBioconductor -与 GSVA 联合用于基因集富集分析
R 包 GSVABioconductor -用于单样本基因集富集分析（ssGSEA）
R 包 limmaBioconductor -用于识别差异表达基因（DEGs）
R 包 pheatmapCRAN -用于生成热图
R 包 vennCRAN -用于创建维恩图
RNA 微阵列数据集（GSE66360，GSE89632）NCBI-GEO -公开可用的 RNA 微阵列数据集，用于分析
RStudioRStudio, PBCVersion 1.4.1717R 的集成开发环境
String 数据库STRING（www.string-db.org/） -用于构建 PPI 网络的在线工具

参考文献

  1. de Alwis, N. M. W., Day, C. P. Non-alcoholic fatty liver disease: The mist gradually clears. J Hepatol. 48 (Suppl), S104-S112 (2008).
  2. Adams, L. A., Anstee, Q. M., Tilg, H., Targher, G. Non-alcoholic fatty liver disease and its relationship with cardiovascular disease and other extrahepatic diseases. Gut. 66 (6), 1138-1153 (2017).
  3. Bhatia, L. S., Curzen, N. P., Calder, P. C., Byrne, C. D. Non-alcoholic fatty liver disease: A new and important cardiovascular risk factor. Eur Heart J. 33 (9), 1190-1200 (2012).
  4. Boddi, M., et al. Non-alcoholic fatty liver in non-diabetic patients with acute coronary syndromes. Eur J Clin Invest. 43 (4), 429-438 (2013).
  5. Oni, E. T., et al. A systematic review: Burden and severity of subclinical cardiovascular disease among those with non-alcoholic fatty liver; should we care. Atherosclerosis. 230 (2), 258-267 (2013).
  6. Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10070), 197-210 (2017).
  7. Stahl, E. P., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and the heart: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 73 (8), 948-963 (2019).
  8. Alexander, M., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and risk of incident acute myocardial infarction and stroke: findings from matched cohort study of 18 million European adults. BMJ. 367, 1934578X221093907(2019).
  9. Cobbina, E., Akhlaghi, F. Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-pathogenesis, classification, and effect on drug metabolizing enzymes and transporters. Drug Metab Rev. 49 (2), 197-211 (2017).
  10. Pawlak, M., Lefebvre, P., Staels, B. Molecular mechanism of PPARα action and its impact on lipid metabolism, inflammation and fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 62 (3), 720-733 (2015).
  11. Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update. Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).
  12. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43 (7), e47(2015).
  13. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  14. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2021: Customizable protein-protein networks, and functional characterization of user-uploaded gene/measurement sets. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D605-D612 (2021).
  15. Sriroopreddy, R., Sajeed, R., Raghuraman, P., Sudandiradoss, C. Differentially expressed gene (DEG) based protein-protein interaction (PPI) network identifies a spectrum of gene interactome, transcriptome and correlated miRNA in nondisjunction Down syndrome. Int J Biol Macromol. 122, 1080-1089 (2019).
  16. Engebretsen, S., Bohlin, J. Statistical predictions with glmnet. Clin Epigenetics. 11, 123(2019).
  17. Ma, H., Ding, F., Wang, Y. A novel multi-innovation gradient support vector machine regression method. ISA Trans. 130, 343-359 (2022).
  18. Han, Y., Huang, L., Zhou, F. A dynamic recursive feature elimination framework (dRFE) to further refine a set of OMIC biomarkers. Bioinformatics. 37 (12), 2183-2189 (2021).
  19. Colombani, C., et al. Application of Bayesian least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) and BayesCπ methods for genomic selection in French Holstein and Montbéliarde breeds. J Dairy Sci. 96 (2), 575-591 (2013).
  20. Gamper, M., et al. Gene expression profile of bladder tissue of patients with ulcerative interstitial cystitis. BMC Genomics. 10 (1), 1-17 (2009).
  21. Hänzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. GSVA: Gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 14, 1-15 (2013).
  22. Valbusa, F., et al. Non-alcoholic fatty liver disease and increased risk of all-cause mortality in elderly patients admitted for acute heart failure. Int J Cardiol. 265, 162-168 (2018).
  23. Zhang, Q., et al. Identification of hub biomarkers of myocardial infarction by single-cell sequencing, bioinformatics, and machine learning. Front Cardiovasc Med. 9, 939972(2022).
  24. Zhang, Q., et al. 7-Hydroxyflavone alleviates myocardial ischemia/reperfusion injury in rats by regulating inflammation. Molecules. 27 (17), 5371(2022).
  25. Zhang, Q., Guo, Y., Zhang, D. Network pharmacology integrated with molecular docking elucidates the mechanism of wuwei yuganzi san for the treatment of coronary heart disease. Nat Prod Commun. 17 (1), 1934578X221093907(2022).
  26. Baenziger, N. L., Brodie, G., Majerus, P. W. A thrombin-sensitive protein of human platelet membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 68 (2), 240-243 (1971).
  27. Zhang, N., Aiyasiding, X., Li, W. J., Liao, H. H., Tang, Q. Z. Neutrophil degranulation and myocardial infarction. Cell Commun Signal. 20 (1), 50(2022).
  28. Lawler, J. Thrombospondin-1 as an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. J Cell Mol Med. 6 (1), 1-12 (2002).
  29. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
  30. Asch, A. S., et al. Isolation of the thrombospondin membrane receptor. J Clin Invest. 79 (4), 1054-1061 (1987).
  31. Armstrong, L. C., Bornstein, P. Thrombospondins 1 and 2 function as inhibitors of angiogenesis. Matrix Biol. 22 (1), 63-71 (2003).
  32. Roberts, D. D., Isenberg, J. S. CD47 and thrombospondin-1 regulation of mitochondria, metabolism, and diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 321 (1), C201-C213 (2021).
  33. Emre, A., et al. Impact of non-alcoholic fatty liver disease on myocardial perfusion in non-diabetic patients undergoing primary percutaneous coronary intervention for ST-segment elevation myocardial infarction. Am J Cardiol. 116 (11), 1810-1814 (2015).
  34. Mouton, A. J., et al. Fibroblast polarization over the myocardial infarction time continuum shifts roles from inflammation to angiogenesis. Basic Res Cardiol. 114 (1), 1-16 (2019).
  35. Liu, Y., et al. Atherosclerotic conditions promote the packaging of functional microRNA-92a-3p into endothelial microvesicles. Circ Res. 124 (4), 575-587 (2019).
  36. Bai, J., et al. Thrombospondin 1 improves hepatic steatosis in diet-induced insulin-resistant mice and is associated with hepatic fat content in humans. EBioMedicine. 57 (1), 102-111 (2020).
  37. Wabitsch, S., et al. Metformin treatment rescues CD8+ T-cell response to immune checkpoint inhibitor therapy in mice with NAFLD. J Hepatol. 77 (4), 748-760 (2022).
  38. Dolejsi, T., et al. Adult T-cells impair neonatal cardiac regeneration. Eur Heart J. 43 (27), 2698-2709 (2022).
  39. Qin, Z., et al. Systemic immune-inflammation index is associated with increased urinary albumin excretion: a population-based study. Front Immunol. 13, 863640(2022).

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