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方法文章

用于识别非酒精性脂肪肝病中血栓反应蛋白1的医疗决策支持平台 通过 免疫浸润分析

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DOI：

10.3791/67328

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2024年8月30日

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1Department of Geriatric Cardiology, General Hospital of Southern Theater Command, 2Guangzhou Key Laboratory of Cardiac Rehabilitation, 3Branch of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 4The First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 5Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Cardiovascular Department/The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 6Department of Electronics & Communication Engineering, Mepco Schlenk Engineering College, 7Department of Teleinformatics Engineering, Federal University of Ceará

本文内容

摘要

本研究通过共表达基因探讨了非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）与心肌梗死（MI）之间的关系，鉴定出血小板反应蛋白1（THBS1）可作为生物标志物。免疫浸润分析显示，CD8+ T细胞和中性粒细胞是关键因素，THBS1在NAFLD和MI的诊断中具有潜在应用价值。

摘要

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）是两种具有高发病率和高死亡率的主要健康负担。本研究旨在探索共表达基因，以阐明NAFLD与MI之间的关联，并利用生物信息学和机器学习方法识别NAFLD相关MI的潜在关键生物标志物。研究进行了功能富集分析，构建了共蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络图，并采用支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）和最小绝对收缩与选择算子（LASSO）技术，鉴定出一个差异表达基因——血小板反应蛋白1（Thrombospondin 1, THBS1）。THBS1在区分NAFLD患者（AUC = 0.981）和MI患者（AUC = 0.900）方面表现出优异性能。免疫浸润分析显示，NAFLD和MI患者的CD8+ T细胞水平显著降低，而中性粒细胞水平升高。CD8+ T细胞和中性粒细胞在区分NAFLD/MI患者与健康对照者方面具有有效性。相关性分析表明，在NAFLD和MI患者中，THBS1与CCR（趋化因子受体）、MHC类别（主要组织相容性复合体类别）、中性粒细胞、旁炎症（parainflammation）及Tfh（滤泡辅助性T细胞）呈正相关，而与CD8+ T细胞、细胞溶解活性及TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）呈负相关。THBS1作为一种新型生物标志物，在区分NAFLD/MI患者与健康对照者方面展现出潜力。研究结果提示，CD8+ T细胞和中性粒细胞可作为区分NAFLD/MI患者与健康个体的炎症免疫特征。

引言

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种重大的公共卫生问题，其患病率为25%-30%1。已有报道指出，NAFLD在糖尿病患者中的患病率较高2。然而，NAFLD在非糖尿病患者中的意义尚不明确。研究表明，NAFLD在动脉粥样硬化的发病机制中发挥着独立作用3,4。此外，一项荟萃分析显示，NAFLD与冠状动脉钙化、内皮功能障碍及动脉粥样硬化密切相关，并已成为独立的心血管危险因素5。NAFLD与心血管疾病之间的关联仍需进一步研究。

心肌梗死（MI）是一种危及全球患者及其家庭健康的灾难性疾病，并带来沉重的经济负担6. 心肌梗死（MI）也是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者死亡的主要原因之一。一项发表于 英国医学杂志 已表明，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者发生心肌梗死的风险是非NAFLD患者的1.17倍7,8一些研究已鉴定出与非酒精性脂肪性肝病相关心肌损伤相关的分子通路，包括炎症、氧化应激和脂质代谢。9,10,11然而，NAFLD 与 MI 之间关联的潜在机制仍不明确。鉴定与 NAFLD 和 MI 预后相关的新生物标志物至关重要。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的患病率不断上升，影响着广泛的人群，凸显出一个重要的公共卫生问题，尤其是考虑到其与糖尿病的关联。然而，NAFLD对非糖尿病患者的影响仍缺乏充分认识。NAFLD已被证实参与动脉粥样硬化的发病机制，并被公认为独立的心血管危险因素，与冠状动脉钙化、内皮功能障碍及动脉粥样硬化密切相关。尽管存在这些关联，NAFLD与心肌梗死（MI）等心血管疾病之间的确切作用机制仍需进一步阐明。心肌梗死是全球主要的死亡原因之一，带来显著的经济负担。NAFLD患者发生心肌梗死的风险明显高于无NAFLD者，突显出深入理解这些疾病之间分子通路的必要性。尽管已有研究提示炎症、氧化应激和脂质代谢紊乱可能是潜在的促成因素，但其确切机制尚不明确。目前迫切需要鉴定新的生物标志物，以增进对NAFLD相关心肌梗死预后评估和临床管理的理解。

因此，本研究从美国国家生物技术信息中心基因表达综合数据库（NCBI-GEO，参见材料表）下载了非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）的RNA微阵列数据集，以识别并分析NAFLD与MI之间差异表达基因（DEGs）的相互作用。采用富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图构建、支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）以及最小绝对收缩与选择算子（LASSO）算法来识别枢纽基因12,13,14,15,16,17,18,19。通过免疫浸润分析评估NAFLD和MI患者体内的免疫细胞情况。最终，整合上述方法以阐明NAFLD与MI之间的关联。图1展示了本研究遵循的设计流程。本研究结合生物信息学、机器学习和免疫浸润分析，旨在为新型医学决策支持平台的开发提供贡献。

本文的主要贡献包括：（1）共表达基因的鉴定：通过鉴定非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）与心肌梗死（MI）之间的共表达基因，揭示了这两种疾病之间的关联，深化了对二者分子机制联系的理解。（2）生物信息学与机器学习方法的应用：研究采用生物信息学和机器学习技术，包括支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）17 和最小绝对收缩与选择算子（LASSO）19，鉴定出差异表达基因 THBS1。THBS1 在区分 NAFLD 和 MI 患者与健康对照者方面表现出高判别效能。（3）免疫浸润分析：研究进行了免疫浸润分析，发现 NAFLD 和 MI 患者体内 CD8+ T 细胞水平显著降低，而中性粒细胞水平显著升高。（4）相关性分析：研究显示，THBS1 的表达与多种免疫因子呈正相关，包括趋化因子受体（CCR）、主要组织相容性复合体 I 类分子（MHC class I）、中性粒细胞、副炎症状态及滤泡辅助性 T 细胞（Tfh）；而与 CD8+ T 细胞、细胞溶解活性以及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）呈负相关。

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方案

所使用的数据库、网页链接以及软件/程序包的详细信息列在材料表中。模拟参数见表1。

1. 获取RNA微阵列数据集

  1. 从 NCBI-GEO 数据库下载心肌梗死（MI）数据集 GSE66360。
  2. 从 NCBI-GEO 数据库下载非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）数据集 GSE89632。
  3. 确保下载的数据集包含 49 个 MI 样本、50 个健康对照样本（GSE66360），以及 39 个 NAFLD 样本和 24 个健康对照样本（GSE89632）。

2. 差异表达基因的鉴定

  1. 数据预处理与差异表达基因（DEG）鉴定
    1. 使用适当的 R 函数将数据集载入 RStudio 。
    2. 利用 R 软件包 limma 鉴定差异表达基因（DEGs）12，筛选阈值如下：P < 0.05 且 |log FC| > 1.5。
    3. 使用 R 软件包 pheatmap、ggplot2 和 Venn 生成热图和维恩图，用于可视化差异表达基因。
  2. 创建可视化图表
    1. 使用 pheatmap 生成差异表达基因的热图。
    2. 使用 ggplot2 绘制维恩图，展示非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）与心肌梗死（MI）之间差异表达基因的重叠情况。

3. 富集分析

  1. 进行 GO、KEGG 和 DO 富集分析
    1. 将差异表达基因（DEGs）载入 R 软件包 clusterProfiler13 中。
    2. 进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析，将差异表达基因分类至分子功能、生物过程和细胞组分。
    3. 执行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析，将差异表达基因映射到生化通路中。
    4. 利用疾病本体（Disease Ontology, DO）富集分析，将差异表达基因与特定临床状态相关联。

4. 通过构建蛋白质-蛋白质相互作用网络进行PPI分析

  1. 使用 STRING 在线平台14 构建共差异表达基因（co-DEGs）的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，置信度分数设为 0.4。
  2. 使用 Cytoscape15 可视化 PPI 网络。

5. 应用机器学习算法筛选候选枢纽差异表达基因

  1. 在 RStudio 中使用 SVM-RFE（支持向量机-递归特征消除）和 LASSO（最小绝对收缩与选择算子）回归算法来筛选最相关的差异表达基因16,17,18。
  2. 确保 SVM-RFE 迭代地对特征进行排序并逐个剔除，而 LASSO 回归19 通过正则化方法识别出稀疏的差异表达基因集合。

6. 用于评估诊断性能的 ROC 曲线构建

  1. 使用 RStudio 进行 ROC（受试者工作特征）曲线分析20。
  2. 计算关键共表达差异基因（co-DEGs）的曲线下面积（AUC）。

7. 免疫浸润分析以探索免疫浸润

  1. 使用 R 软件包 GSVA 和 GSEABase 对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）样本进行单样本基因集富集分析（ssGSEA），以分析其免疫浸润情况21。
  2. 比较 NAFLD 和 MI 样本与健康对照组之间各类免疫细胞的相对丰度。

8. 统计学分析

  1. 在 RStudio 中执行所有统计分析。
  2. 应用皮尔逊相关性分析来检测基因共表达模式。
  3. 以 P < 0.05 确保统计学显著性。
    注意：在开始本方案之前，请确保所有软件和 R 软件包均已正确安装并更新至最新版本。

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结果

本研究提出的关键发现如下，涵盖了为阐明非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）潜在分子机制而开展的多种分析。

差异表达基因的鉴定
在GSE89632数据集中，鉴定出76个上调基因和20个下调基因作为非酒精性脂肪性肝病相关差异表达基因（NAFLD-DEGs）（图2B、D）；而在GSE66360数据集中，鉴定出118个上调基因和8个下调基因作为心肌梗死相关差异表达基因（MI-DEGs）（图2C、E）。随后，通过NAFLD-DEGs与MI-DEGs的交集分析获得共表达差异表达基因（co-DEGs），在co-DEGs中鉴定出13个上调的差异表达基因和1个下调的差异表达基因（图2A）。

鉴定非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）各...

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讨论

本研究中描述的方法对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）潜在分子机制的研究具有重要意义。通过鉴定如THBS1等关键生物标志物，所提出的方案为诊断和治疗干预提供了潜在靶点。该方法可拓展至其他涉及多条通路和免疫反应的复杂疾病，有助于发现新的生物标志物和治疗靶点。此外，生物信息学与机器学习技术的整合为个体化医学提供了灵活的框架，可根据个体的分子特征制定个性化的治疗策略。该方法还可适用于临床环境，通过靶向干预提高诊断准确性，改善患者预后。

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和心肌梗死（MI）是两种具有高发病率和高死亡率的主要健康负担。NAFLD 的特征是脂质在肝脏中积聚1。越来越多的证据表明，NAFLD 不仅对心脏的结构完整性产生不利影响，还会影响其功能，尤其是在心肌梗死的背景下22,23,24。此外，已有强有力的证据表明 NAFLD 与动脉粥样...

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致谢

本研究由国家自然科学基金（编号 62271511、U21A200949）、南部战区总医院育才基金（2022NZC011）、广州市科技计划项目（2023A03J0170）、国家老年医学临床研究中心（NCRCG-PLAGH-2023006）以及广东省基础与应用基础研究基金（编号 2020A1515010288、2021A1515220101）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CytoscapeCytoscape ConsortiumVersion 3.6.1用于可视化蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络
MI 数据集 GSE66360（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）NCBI-GEO 数据库 -用于收集RNA微阵列数据集进行分析
R 包 clusterProfilerBioconductor -用于 GO、KEGG 和 DO 富集分析
R 包 ggplot2CRAN -用于创建维恩图及其他可视化图形
R 包 GSEABaseBioconductor -与 GSVA 联合用于基因集富集分析
R 包 GSVABioconductor -用于单样本基因集富集分析（ssGSEA）
R 包 limmaBioconductor -用于识别差异表达基因（DEGs）
R 包 pheatmapCRAN -用于生成热图
R 包 vennCRAN -用于创建维恩图
RNA 微阵列数据集（GSE66360，GSE89632）NCBI-GEO -公开可用的 RNA 微阵列数据集，用于分析
RStudioRStudio, PBCVersion 1.4.1717R 的集成开发环境
String 数据库STRING（www.string-db.org/） -用于构建 PPI 网络的在线工具

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