通过比色分析量化弹性蛋白酶活性的调节

Summary

该方案描述了一种比色测定方法的开发，用于确定化合物抑制或激活弹性蛋白酶活性的能力。

Abstract

弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，在弹性蛋白降解中起着重要作用。弹性蛋白是一种细胞外蛋白，有助于维持肺、皮肤和血管中的组织弹性。弹性蛋白酶活性的严格调节对于组织稳态至关重要，因为失调会导致肺气肿、皱纹和动脉粥样硬化等病理。一些化合物，例如天然存在的植物化学物质，已显示出治疗干预的潜力，并引起了极大的兴趣。阐明不同化合物对弹性蛋白酶的调节作用，无论是抑制性的还是刺激性的，对于开发针对弹性蛋白酶相关疾病的新型治疗和美容策略至关重要。一种广泛接受的测量弹性蛋白酶活性的方法是比色弹性蛋白酶测定。在该测定中，使用特异性底物分解弹性蛋白酶，释放出可检测的黄色化合物对硝基苯胺 （pNA）。产生的 pNA 量反映了样品中的弹性蛋白酶活性，可以通过比色法测量。该检测具有多种优势，包括简单、灵敏度高、结果快速以及适应各种研究需求。比色弹性蛋白酶测定仍然是研究化合物如何影响弹性蛋白酶活性的宝贵工具。由于其易用性和有效性，该检测是该领域研究的基石。

Introduction

弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，在分解弹性蛋白中起着至关重要的作用，弹性蛋白是一种为身体各种组织（包括肺、皮肤和血管）提供弹性的蛋白质。弹性蛋白酶活性受到严格调节以维持组织稳态，失调可导致病理和皮肤状况，如肺气肿、动脉粥样硬化和皮肤皱纹¹。

弹性蛋白酶有几种类型，每一种都有特定的特性和功能。中性粒细胞弹性蛋白酶由中性粒细胞产生，在免疫反应和炎症中很重要。这些酶可以降解多种细胞外蛋白，并与慢性炎症性疾病有关²。另一方面，胰腺弹性蛋白酶在小肠的蛋白质消化中发挥作用³。区分这些弹性蛋白酶对于开发针对不同疾病的特定疗法至关重要。

健康的弹性蛋白水平和调节弹性蛋白酶活性的途径有助于保持皮肤弹性并防止过早衰老。衰老、紫外线辐射、炎症、遗传易感性、环境污染物和营养等因素显着影响弹性蛋白酶⁴ 的活性和降解。一个新兴的兴趣领域是弹性因子的研究，弹性因子是由弹性蛋白酶降解弹性蛋白产生的生物活性片段。这些分子可以诱导显着的生物效应，包括炎症增加、弹性纤维钙化和脂质沉积等⁵.弹性因子可能会影响与弹性蛋白降解相关的疾病进展，并为新的治疗干预措施提供潜在靶点（图 1）。

一些化合物，如天然存在的植物化学物质，因其潜在的治疗和美容效果而受到广泛关注，包括它们调节弹性蛋白酶活性的能力⁶。例如，槲皮素是一种在苹果和洋葱中发现的类黄酮，已被证明可以有效抑制弹性蛋白酶活性，这有助于其抗炎和抗衰老作用⁷。姜黄素是姜黄中的生物活性化合物，是另一种经过充分研究的植物化学物质，具有弹性蛋白酶抑制作用，对皮肤老化和炎症具有保护作用⁸。此外，表没食子儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 是绿茶中的主要儿茶素，已显示出强大的弹性蛋白酶抑制活性，使其成为旨在保持皮肤弹性的护肤配方的宝贵化合物⁹。这些例子强调了植物化学物质作为天然弹性蛋白酶抑制剂的潜力，为开发新的治疗和化妆品奠定了基础。

目前，比色弹性蛋白酶测定是测量弹性蛋白酶活性 7,10,11,12,13 的广泛使用的方法。该测定依赖于酶将特定底物 N-琥珀酰基-（Ala）₃-硝基苯胺 （SANA） 水解为琥珀酰氨基酸和对硝基苯胺 （pNA） 的能力。pNA 是一种黄色发色团，使用分光光度计可在 410 nm 处轻松检测（图 2）。pNA 的产生速率与样品¹⁴ 中的弹性蛋白酶活性成正比。

该方法在各个研究领域都有广泛的应用。通过这种方法，研究人员可以快速鉴定化合物调节弹性蛋白酶活性的能力，研究弹性蛋白酶抑制剂的作用机制，并评估这些抑制剂在弹性蛋白酶相关疾病的细胞和动物模型中的疗效。此外，该测定可用于研究不同的抑制机制，例如竞争性或非竞争性抑制，提供有关天然或合成化合物如何调节弹性蛋白酶活性的宝贵信息。

与其他测量弹性蛋白酶活性的方法相比，弹性蛋白酶活性调节测定具有多项优势。它简单易行，需要最少的技术专业知识，并且可以在标准实验室环境中进行¹⁵。此外，该检测具有高度敏感性，可以检测弹性蛋白酶活性的微小变化。该分析提供快速和定量的结果，从而实现高效的数据分析。此外，它可以适应各种形式，包括高通量筛选和动力学研究¹⁶。

然而，该检测也存在一些局限性，例如底物特异性低（因为它对弹性蛋白酶具有特异性）以及易受样品中其他成分干扰，例如有色化合物或 pNA 水解抑制剂。因此，研究人员必须考虑这些局限性，并使用互补方法来全面研究弹性蛋白酶抑制剂作用的潜在机制¹⁷。

有弹性蛋白酶活性监测替代方法，例如酶谱法，它为识别和区分各种弹性蛋白酶亚型提供了极好的工具，这在研究不同弹性蛋白酶亚型对特定疾病过程的特定贡献时至关重要。然而，酶谱法是一种半定量技术，需要额外的可视化步骤;因此，与分光光度法相比，酶法对于高通量分析的效率较低¹⁸。荧光测定法对分光光度法的灵敏度更高，可提供更低的检测限。这允许对弹性蛋白酶活性和调节剂相互作用进行更灵敏的分析，从而提供更完整的酶促过程图片¹⁹。然而，荧光测定需要专门的仪器，并且可能容易受到生物样品中某些化合物的干扰。辐射测定具有极高的灵敏度，使其成为检测极低水平弹性蛋白酶活性的理想选择。然而，使用放射性材料需要专门的设备、严格的安全协议和适当的废物处理程序，这带来了后勤挑战和安全问题²⁰。免疫检测以其多功能性而著称，可用于直接测量弹性蛋白酶活性或量化弹性蛋白酶-抑制剂复合物，从而深入了解抑制剂的疗效。此外，与 SANA 方法不同，免疫测定可以适用于复杂的生物样品，例如组织匀浆。然而，开发和验证免疫测定可能非常耗时并且需要特异性抗体，这可能导致比更简单的分光光度法方法更高的成本²¹。

比色弹性蛋白酶活性调节测定是研究任何化合物修饰弹性蛋白酶活性能力的宝贵工具。由于其简单性、灵敏度和适应性，该方法被广泛用于各种研究环境。然而，研究人员必须考虑该测定的局限性，并使用互补方法来全面确定弹性蛋白酶抑制剂活性的潜在机制。

Protocol

用于本研究的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 制备 0.2 M Tris 碱反应缓冲液 （RB）

1. 使用分析天平称量相应的 Tris 碱。
2. 将 Tris 碱转移到烧杯中，并使用量筒加入去离子水。
3. 用磁力搅拌器搅拌溶液，直到 Tris 碱完全溶解。
4. 通过滴加 4 N HCl 将 pH 调节至 8.0。使用 pH 计监测 pH 值。
5. 达到所需的 pH 值后，将溶液转移至容量瓶中，并用去离子水填充至所需的体积标记。
6. 将缓冲液转移到贴有标签的储存瓶中，并在室温下储存直至使用。

2. 样品制备

1. 使用分析天平准确称量所需量的样品。对于这项研究，每个样品 1 毫克就足够了。
2. 将样品溶解在 RB 中至所需浓度。可以测试不同的样品浓度，1 mg/mL 是很好的参考。
3. 使用涡旋混合器确保样品完全溶解。
4. 将制备好的样品储存在冰上，直到准备好使用。
   注:如果样品具有可能干扰吸光度读数的强烈着色，请按照相同的程序制备颜色对照，但不在后续步骤中添加弹性蛋白酶。

3. 弹性蛋白酶的制备

1. 制备终浓度为 10 μg/mL 的弹性蛋白酶在 RB 中的工作溶液。使用以下公式计算所需的储备液体积:
   储备液体积 （μL） = 所需最终体积 （μL） x 所需最终浓度 （μg/mL）/储备液浓度 （μg/mL）
2. 将制备好的弹性蛋白酶溶液储存在冰上，直至准备好使用。
   注:考虑供应商提供的酶的比活性，该活性可能因批次而异。此外，冷冻后酶活性可能会降低;尽可能准备新鲜的溶液。

4. SANA 基材的制备

1. 通过将适量的 SANA 粉末溶解在 RB 中来制备 0.8 mM 的 SANA 溶液。使用以下公式:
   SANA 质量 （mg） = 所需最终体积 （μL） ×所需最终浓度 （mM） × 分子量 （mg/mmol）/1000
2. 将溶液避光保存，并在 4 °C 下储存直至使用。

5. 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 储备液的制备

1. 在异丙醇中制备 100 mM PMSF 储备液。
2. 将准备好的 PMSF 溶液储存在冰上，直到准备好使用。
   注:将 PMSF 溶液分装成更小的体积（例如，100 μL）并储存在 -20 °C 以避免冻融循环。

6. 设置检测

1. 在微量离心管中制备以下溶液，一式三份:
   1. 阴性对照:移液 800 μL RB。
   2. 载体对照:添加 600 μL RB 和 200 μL 用于溶解样品的溶剂。
   3. 阳性抑制对照:添加 24 μL PMSF 储备溶液和 776 μL RB。
   4. 异丙醇对照:添加 24 μL 异丙醇和 776 μL RB。
   5. 样品:吸取 200 μL 制备好的样品溶液，并加入 600 μL RB。
   6. 颜色对照（如果需要）:移取 200 μL 样品溶液并加入 800 μL RB。
2. 向每个试管中加入 100 μL 弹性蛋白酶溶液 （10 μg/mL），颜色对照除外。
3. 将所有试管在室温下孵育 20 分钟。
4. 向每个试管中加入 100 μL SANA 底物溶液 （0.8 mM），颜色对照除外。
5. 轻轻倒置试管数次，彻底混合溶液。将 300 μL 从每根试管中转移到 96 孔板中，确保每个样品重复测量三次。
6. 将 96 孔板放入设置为 410 nm 的酶标仪中。定期、每分钟、持续 20 分钟或直到信号稳定。将读数仪设置为在室温下测量。
   注意:如果读板器支持动力学测量，请对其进行编程以按设定的时间间隔自动获取读数。否则，在所需时间点手动记录吸光度。

7. 数据分析

1. 通过将阳性抑制对照 （PMSF） 设置为 100% 抑制，将阴性对照（仅 RB）设置为 0% 抑制来标准化结果。
2. 使用以下公式计算每个样品的抑制百分比:
   抑制 % = 100 - [（样品吸光度 - 载体对照吸光度 - 颜色控制吸光度）/（阴性对照吸光度 - 阳性对照吸光度 - 异丙醇对照吸光度）] × 100
3. 使用绘图软件绘制每种样品浓度的抑制百分比与样品浓度的关系图，以可视化抑制效果。

Results

一旦方案完成，就可以获得执行相关计算和量化样品调节弹性蛋白酶活性的能力所需的吸光度数据。 图 3 突出显示了具有不同对照和样品的孔的位置。对于有色样品，例如本例中使用的样品，有必要添加颜色控制以尽量减少分光光度干扰，因为颜色会干扰 pNA 在 410 nm 处的黄色测量。

一旦获得吸光度结果，计算出每个样品的抑制百分比，并根据对照对结果进行归一化，必须生成类似于 图 4 中的条形图。较高的抑制百分比值表明样品中的弹性蛋白酶抑制活性更强。接近 100% 的值表示对弹性蛋白酶的抑制较强，而接近 0% 的值表示对弹性蛋白酶的抑制较弱或没有抑制。负抑制值表示弹性蛋白酶激活。 图 4 中的图表显示，与阴性对照相比，在 0.5 mg/mL、0.75 mg/mL 和 1 mg/mL 的浓度下，弹性蛋白酶抑制活性较弱但显著。在 0.25 mg/mL 浓度下，未检测到显着的弹性蛋白酶抑制作用。

Discussion

在本方法中，使用比色法检查植物化学物质对弹性蛋白酶的调节作用。弹性蛋白酶是一种对弹性蛋白降解至关重要的丝氨酸蛋白酶，在维持各种器官的组织弹性方面起着重要作用。本研究中描述的比色弹性蛋白酶测定提供了一种简单、灵敏和快速的测量弹性蛋白酶活性的方法。

在这种情况下，研究人员专注于调节剂，例如植物提取物和纯植物化学物质，因为它们具有调节弹性蛋白酶活性的潜力;这些调节剂在天然治疗剂或化妆品剂的开发中显示出应用潜力²²。多项研究表明，各种植物提取物和植物化学物质，包括绿茶提取物²³;葡萄藤、石榴和茴香籽提取物²⁴;姜黄素²⁵;和几种多酚²⁶，例如原花青素。植物化学物质有望成为合成化学品的更安全替代品，并具有以下优点:植物化学物质在传统医学中安全使用的历史悠久，表明其安全性良好;与合成药物相比...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 孔细胞培养板	康宁公司	3599	平底带盖，聚苯乙烯
细胞成像 多功能微孔板检测仪	Agilent	BioTek Cytation 1	与 Gen5 软件配合使用
来自猪胰腺的弹性蛋白酶	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1;25,9 kDa
异丙醇 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0;C3H8O;60.10 g/mol
N-琥珀酰-（Ala）3-硝基苯胺	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6;C19H25N5O8 ;451.43 g/mol
pH 计	Hach Lange	sensION+ PH31	带磁力搅拌器和传感器支架
苯基甲磺酰氟	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6;C7H7FO2S;174,19 g/mol
Tris 用于分子生物学	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1;C4H11NO3;121,14 克/摩尔