通过比色分析定量弹性蛋白酶酶活性的调控

摘要

本方案描述了一种比色法测定化合物抑制或激活弹性蛋白酶活性能力的方法。

摘要

弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，在弹性蛋白的降解过程中发挥着关键作用。弹性蛋白是一种细胞外蛋白，有助于维持肺、皮肤和血管组织的弹性。弹性蛋白酶活性的严格调控对于组织稳态至关重要，因为其失调可能导致肺气肿、皱纹和动脉粥样硬化等病理状态。一些化合物，例如天然存在的植物化学物质，已显示出治疗干预的潜力，并引起了广泛关注。阐明不同化合物对弹性蛋白酶的调节作用（无论是抑制还是激活），对于开发针对弹性蛋白酶相关疾病的新型治疗和美容策略至关重要。目前广泛采用的一种检测弹性蛋白酶活性的方法是比色法弹性蛋白酶检测。该方法使用一种特异性底物被弹性蛋白酶降解，释放出一种可检测的黄色化合物——对硝基苯胺（pNA）。生成的pNA量反映了样品中弹性蛋白酶的活性，可通过比色法进行测定。该检测方法具有操作简便、灵敏度高、结果快速以及可适应多种研究需求等优点。比色法弹性蛋白酶检测仍是研究化合物如何影响弹性蛋白酶活性的重要工具。由于其操作简便且效果可靠，该检测方法已成为该领域研究的核心技术之一。

引言

弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，其在降解弹性蛋白中发挥关键作用。弹性蛋白是一种为肺、皮肤和血管等多种组织提供弹性的蛋白质。弹性蛋白酶的活性受到严格调控，以维持组织稳态，其失调可导致肺气肿、动脉粥样硬化和皮肤皱纹等病理及皮肤状况¹。

弹性蛋白酶有多种类型，每种都具有特定的特征和功能。中性粒细胞弹性蛋白酶由中性粒细胞产生，在免疫反应和炎症过程中起重要作用。这类酶能够降解多种细胞外蛋白，参与慢性炎症性疾病的发生发展²。而胰弹性蛋白酶则在小肠蛋白质消化过程中发挥作用³。区分这些不同类型的弹性蛋白酶对于开发针对不同疾病的特异性治疗策略至关重要。

弹性蛋白的正常水平及调控弹性蛋白酶活性的通路有助于维持皮肤弹性，防止过早老化。年龄增长、紫外线辐射、炎症、遗传易感性、环境污染物和营养等因素均显著影响弹性蛋白酶的活性及其降解过程⁴。近年来备受关注的一个研究领域是弹性蛋白降解片段（elastokines），即弹性蛋白酶降解弹性蛋白后产生的生物活性片段。这些分子可引发多种显著的生物学效应，包括加剧炎症反应、弹性纤维钙化以及脂质沉积等⁵。elastokines 可能影响与弹性蛋白降解相关疾病的发展进程，并为新型治疗干预提供潜在靶点（图1）。

一些化合物，例如天然存在的植物化学物，因其潜在的治疗和美容功效而受到广泛关注，其中包括调节弹性蛋白酶活性的能力⁶。例如，存在于苹果和洋葱中的类黄酮槲皮素（quercetin）已被证明能有效抑制弹性蛋白酶活性，这有助于其发挥抗炎和抗衰老作用⁷。姜黄素（curcumin）是姜黄中的一种生物活性成分，也是一种被广泛研究的植物化学物，具有抑制弹性蛋白酶的特性，可对皮肤老化和炎症提供保护作用⁸。此外，表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate, EGCG）是绿茶中的主要儿茶素，已显示出强效的弹性蛋白酶抑制活性，使其成为旨在维持皮肤弹性的护肤配方中的重要成分⁹。 这些实例凸显了植物化学物作为天然弹性蛋白酶抑制剂的潜力，为开发新的治疗和美容产品奠定了基础。

目前，比色法弹性蛋白酶检测是测量弹性蛋白酶活性的常用方法^{7,10,11,12,13}。该检测方法基于弹性蛋白酶水解特定底物 N-琥珀酰基-(Ala)₃-硝基苯胺（SANA）的能力，将其分解为琥珀酰氨基氨基酸和对硝基苯胺（pNA）。pNA 是一种呈黄色的发色团，可在 410 nm 波长下使用分光光度计轻松检测（图 2）。pNA 的生成速率与样品中的弹性蛋白酶活性成正比¹⁴。

该方法在多个研究领域具有广泛的应用。通过该方法，研究人员能够快速鉴定化合物对弹性蛋白酶活性的调节能力，探究弹性蛋白酶抑制剂的作用机制，并评估这些抑制剂在弹性蛋白酶相关疾病的细胞和动物模型中的有效性。此外，该检测还可用于研究不同的抑制机制，例如竞争性或非竞争性抑制，从而提供有关天然或合成化合物如何调节弹性蛋白酶活性的重要信息。

弹性蛋白酶活性调节检测法相较于其他测量弹性蛋白酶活性的方法具有多项优势。该方法操作简便，技术要求低，可在标准实验室条件下进行¹⁵。此外，该检测法灵敏度高，能够检测到弹性蛋白酶活性的微小变化。检测可快速获得定量结果，便于高效的数据分析。而且，该方法可适用于多种实验形式，包括高通量筛选和动力学研究¹⁶。

然而，该检测方法也存在一些局限性，例如底物特异性较低（因其仅针对弹性蛋白酶），以及容易受到样品中其他成分的干扰，如有色化合物或对对硝基苯胺（pNA）水解具有抑制作用的物质。因此，研究人员必须考虑这些局限性，并结合使用其他补充方法，以全面探究弹性蛋白酶抑制剂作用机制¹⁷。

存在多种弹性蛋白酶活性检测的替代方法。例如，酶谱法（zymography）是一种用于鉴定和区分不同弹性蛋白酶同工型的优良工具，在研究不同弹性蛋白酶亚型对特定疾病过程的具体贡献时具有重要意义。然而，酶谱法是一种半定量技术，且需要额外的显色步骤，因此与分光光度法相比，其在高通量分析中效率较低¹⁸。荧光测定法相较于分光光度法具有更高的灵敏度，可实现更低的检测限，从而更灵敏地分析弹性蛋白酶活性及其调节因子的相互作用，更全面地揭示酶促反应过程¹⁹。但荧光测定法需要专用仪器，且可能受到生物样本中某些化合物的干扰。放射性同位素测定法具有极高的灵敏度，适用于检测极低水平的弹性蛋白酶活性。然而，使用放射性物质需要配备专用设备、严格的安全部署以及规范的废物处理程序，带来操作上的复杂性和安全风险²⁰。免疫测定法因其多功能性而突出，既可直接测量弹性蛋白酶活性，也可定量检测弹性蛋白酶-抑制剂复合物，从而评估抑制剂的有效性。此外，免疫测定法可适用于组织匀浆等复杂生物样本，而SANA方法则不具备此优势。但免疫测定法的开发与验证过程耗时较长，且需要特异性抗体，可能导致成本高于简单的分光光度法²¹。

比色法弹性蛋白酶活性调节检测是一种用于研究任何化合物对弹性蛋白酶活性调节能力的重要工具。由于该方法具有操作简便、灵敏度高和适应性强等优点，已被广泛应用于各类研究领域。然而，研究人员必须考虑该检测方法的局限性，并结合其他互补性方法，以全面确定弹性蛋白酶抑制剂作用机制的细节。

方案

本研究所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 0.2 M Tris 碱反应缓冲液（RB）的配制

1. 使用分析天平称取相应的Tris碱。
2. 将Tris碱转移至烧杯中，并用量筒加入去离子水。
3. 用磁力搅拌器搅拌溶液，直至Tris碱完全溶解。
4. 逐滴加入4 N HCl，将pH调节至8.0。使用pH计监测pH值。
5. 达到目标pH值后，将溶液转移至容量瓶中，并用去离子水定容至刻度线。
6. 将缓冲液转移至贴有标签的储存瓶中，室温保存备用。

2. 样品制备

1. 使用分析天平准确称取所需量的样品。本研究中，每种样品取 1 mg 即可。
2. 将样品溶解于 RB 中，达到所需浓度。可测试不同样品浓度，其中 1 mg/mL 是一个良好的参考浓度。
3. 使用涡旋混合器确保样品完全溶解。
4. 将制备好的样品置于冰上保存，直至使用。
   注意：如果样品颜色较深，可能干扰吸光度读数，请按照相同步骤制备颜色对照，但在后续步骤中不添加弹性蛋白酶。

3. 弹性蛋白酶的制备

1. 在RB中配制终浓度为10 µg/mL的弹性蛋白酶工作液。使用以下公式计算所需储存液体积：
   储存液体积（µL）= 所需终体积（µL）× 所需终浓度（µg/mL）/ 储存液浓度（µg/mL）
2. 将配制好的弹性蛋白酶溶液置于冰上保存，待用。
   注意：应考虑供应商提供的酶的比活性，不同批次间可能存在差异。此外，酶活性在冻融后可能下降；建议尽可能新鲜配制溶液。

4. SANA 底物的制备

1. 通过将适量的 SANA 粉末溶解于 RB 中，配制 0.8 mM 的 SANA 溶液。使用以下公式：
   SANA 质量（mg）= 所需终体积（µL）× 所需终浓度（mM）× 分子量（mg/mmol）/1000
2. 避光保存该溶液，并于 4 °C 储存直至使用。

5. 苯甲基磺酰氟（PMSF）储备液的配制

1. 用异丙醇配制 100 mM 的 PMSF 储存液。
2. 将配制好的 PMSF 溶液置于冰上，待用。
   注意：将 PMSF 溶液分装成小份（例如 100 µL），于 -20 °C 保存，以避免反复冻融。

6. 建立检测方法

1. 在微量离心管中以三份重复的方式配制以下溶液：
   1. 阴性对照：移取 800 µL RB 溶液。
   2. 溶剂对照：加入 600 µL RB 溶液和 200 µL 用于溶解样品的溶剂。
   3. 阳性抑制对照：加入 24 µL PMSF 储备液和 776 µL RB 溶液。
   4. 异丙醇对照：加入 24 µL 异丙醇和 776 µL RB 溶液。
   5. 样品组：移取 200 µL 已配制的样品溶液，并加入 600 µL RB 溶液。
   6. 显色对照（如需要）：移取 200 µL 样品溶液，并加入 800 µL RB 溶液。
2. 除显色对照外，向每根试管中加入 100 µL 弹性蛋白酶溶液（10 µg/mL）。
3. 将所有试管在室温下孵育 20 分钟。
4. 除显色对照外，向每根试管中加入 100 µL SANA 底物溶液（0.8 mM）。
5. 通过轻轻翻转试管数次使溶液充分混匀。将每根试管中的 300 µL 溶液转移至 96 孔板中，确保每个样品设置三复孔。
6. 将 96 孔板放入设定波长为 410 nm 的酶标仪中。每隔 1 分钟测定一次吸光度，持续 20 分钟或直至信号稳定。设置酶标仪在室温下进行检测。
   注意：若酶标仪支持动力学检测模式，请设置为自动在预定时间间隔采集数据；否则需手动记录各时间点的吸光度值。

7. 数据分析

1. 将阳性抑制对照（PMSF）设为100%抑制率，阴性对照（仅RB）设为0%抑制率，对结果进行归一化处理。
2. 使用以下公式计算每个样本的抑制百分比：
   % 抑制率 = 100 - [（样本吸光度 - 溶剂对照吸光度 - 显色对照吸光度）/（阴性对照吸光度 - 阳性对照吸光度 - 异丙醇对照吸光度）] × 100
3. 使用绘图软件将每个样本浓度的抑制百分比对样本浓度作图，以直观展示其抑制效应。

结果

完成实验方案后，可获得进行相关计算所必需的吸光度数据，从而定量分析样品对弹性蛋白酶活性的调节能力。图3 标注了不同对照和样品所在孔的位置。对于有颜色的样品（如本示例中所使用的样品），必须设置颜色对照，以尽量减少分光光度干扰，因为样品颜色可能干扰在410 nm处对对硝基苯胺（pNA）黄色产物的测定。

获得吸光度结果后，已计算各样品的抑制率，并根据对照组对结果进行了归一化处理，需绘制出类似于图4的柱状图。较高的抑制率数值表明样品中弹性蛋白酶抑制活性较强。接近100%的数值提示对弹性蛋白酶有强效抑制作用，而接近0%的数值则表明抑制作用较弱或无抑制作用。负值的抑制率表示促进了弹性蛋白酶的活性。图4中的图表显示，在0.5 mg/mL、0.75 mg/mL和1 mg/mL浓度下，与阴性对照组相比，样品表现出虽弱但具有显著性的弹性蛋白酶抑制活性；而在0.25 mg/mL浓度下，未检测到显著的弹性蛋白酶抑制效应。

...

讨论

在本方法中，采用比色法检测植物化学物质对弹性蛋白酶的调节作用。弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，在弹性蛋白降解过程中起关键作用，对维持多种器官组织的弹性具有重要意义。本文所述的比色法弹性蛋白酶活性检测提供了一种简单、灵敏且快速的酶活性测定方法。

在此背景下，研究人员关注了多种调节剂（如植物提取物和纯植物化学成分）对弹性蛋白酶活性的调节潜力；这些调节剂在天然治疗剂或化妆品的开发中展现出应用前景²²。多项研究表明，多种植物提取物和植物化学成分具有此类作用，包括绿茶提取物²³、葡萄藤、石榴和茴香籽提取物²⁴、姜黄素²⁵以及多种多酚类物质²⁶（如原花青素）。植物化学成分作为合成化学品更安全的替代品具有广阔前景，并具备以下优势：植物化学成分在传统医学中具有长期安全使用的历史，表明其安全性良好；与合成药物相比，植物化学成分通常引起的不良反应更少

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔细胞培养板	Corning Incorporated	3599	平底带盖，聚苯乙烯材质
细胞成像多功能读板仪	Agilent	BioTek Cytation 1	与Gen5软件配合使用
猪胰弹性蛋白酶	Sigma-Aldrich	E7885	CAS 39445-21-1；25.9 kDa
异丙醇 99.5%	Fisher Scientific	AC184130010	CAS 67-63-0；C3H8O；60.10 g/mol
N-琥珀酰-(丙氨酰)3-硝基苯胺	Sigma-Aldrich	S4760	CAS 52299-14-6；C19H25N5O8；451.43 g/mol
pH计	Hach Lange	sensION+ PH31	配有磁力搅拌器和传感器支架
苯甲基磺酰氟	Sigma-Aldrich	P7626	CAS 329-98-6；C7H7FO2S；174.19 g/mol
分子生物学用Tris	PanReac AppliChem	A2264	CAS 77-86-1；C4H11NO3；121.14 g/mol