颅骨骨髓血管动态的活体纵向成像

摘要

活体显微镜技术可实现对组织再生和肿瘤发生等动态生物学过程的研究。颅骨骨髓是一种高度动态的组织，为研究造血作用和血管功能提供了重要线索。通过使用生物相容性3D打印头部固定植入物，可实现重复的纵向成像，从而加深我们对组织动态变化及肿瘤微环境的理解。

摘要

活体纵向荧光显微成像技术已成为研究动态生物学过程的关键方法，尤其在组织再生、肿瘤发生及治疗反应等领域具有重要意义。颅骨骨髓是一种高度动态的组织，其中造血命运与周围微环境密切相关，特化的血管会响应正常和病理状态下的造血活动。传统的固定组织成像仅能提供静态信息，往往限制了对这些过程的全面理解。

转基因动物（表达细胞特异性标记物）、活细胞示踪剂、成像设备的进步以及专用腔室的应用，已使活体显微镜技术成为研究动态生物学现象的关键工具。活体成像的一个应用是研究肿瘤血管行为及其治疗效应。一种新设计的3D打印钛合金头部固定植入物可稳定连接小鼠颅骨，适用于在多次成像过程中进行长期观察。

本方案可实现对颅骨骨髓中血管动态的时空分析，包括血管异质性的可视化与定量、血管与基质细胞及造血细胞相互作用的观察，以及血管功能参数的测量。此外，该技术还可利用双光子显微镜对已形成的血管网络进行可视化，并实现对治疗效应、干细胞动员以及化疗药物在体内的定位随时间变化的动态监测。总体而言，这种活体纵向成像方案为研究肿瘤血管行为和造血细胞动态提供了全面的平台，有助于深入理解调控这些生物学过程的复杂机制。

引言

颅骨骨髓（BM）的活体显微成像是一种强大且不可或缺的技术，用于研究骨髓微环境中的造血过程、组织微环境调控以及血管动态变化。该方法学的主要目的是实现对骨髓微环境中细胞行为、细胞间相互作用及空间组织结构的实时可视化与分析 体内通过结合荧光标记与先进的成像技术直接观察骨髓颅骨，研究人员能够阐明造血干细胞（HSCs）、基质细胞及其周围血管系统之间复杂的相互作用，从而为造血作用和免疫应答的调控机制提供关键见解。

活体显微成像技术的发展与应用源于传统组织学和离体（ex vivo）成像方法的局限性，这些传统方法往往无法捕捉细胞在组织内动态行为及其相互作用的真实情况。与静态成像技术不同，活体显微技术使研究人员能够实时观察细胞动态过程，从而在不牺牲实验动物的前提下，研究细胞迁移、增殖和分化等在其原生微环境中的长期生物学过程。此外，活体显微成像具有独特优势，可在体内（in vivo）研究功能性行为，例如血管功能（如灌注、通透性、缺氧状态），从而保持生理相关性，并避免组织固定和处理过程中可能引入的人为假象。该领域早期的开创性研究已充分证明了这一技术的巨大优势^1,2，而近年来更精细的技术改进进一步验证并拓展了这些发现^3,4,5，这些研究利用活体显微成像追踪了内源性造血干细胞（HSC）在骨髓（BM）微环境中的定位、迁移及其与血管系统的相互作用。此外，活体显微成像在阐明血液系统疾病（如白血病和骨髓衰竭综合征）的发病机制方面发挥了关键作用，为白血病细胞的运动特性^6,7、疾病相关的血管改变⁸以及药物反应机制⁹提供了新的见解。

颅骨骨髓（BM）的活体显微成像相较于其他骨组织位点具有多项优势。首先，颅骨内的骨髓相比于股骨或胫骨等较深部的骨骼更易于进行活体成像观察。这种可及性使得无需侵入性外科手术即可通过二次谐波成像（SHG）直接观察组织微环境，包括骨组织本身¹⁰。其次，颅骨相对较薄且具有半透明特性，有利于更好地观察骨髓微环境中细胞的动态行为。这种透明性使得无需进行骨组织减薄或透明化处理，即可利用双光子显微镜、共聚焦显微镜和光片显微镜实现高分辨率成像。颅骨为活体成像实验提供了稳定、平坦且刚性的平台，可最大限度减少组织运动伪影，并在长时间观察过程中保持成像条件的一致性。这种稳定性对于长期追踪细胞行为及其随时间变化的响应尤为有利。此外，由于实验动物间颅骨结构相对较小且空间位置明确，具有良好的可重复性。这种结构的一致性有助于不同实验组之间的比较，并支持对成像数据进行可靠的统计分析。

本文介绍一种通过活体双光子显微镜成像小鼠颅骨骨髓（BM）的方法，采用新开发的头部固定植入装置¹¹，该装置由生物相容性 Grade 23 钛合金（Ti6Al4V）3D 打印而成，配备由相同钛合金制成的专用且易于定位的硬质保护盖，可安全闭合伤口，避免感染或手术部位受损。该植入装置通过植入物支架将小鼠头部牢固、稳定地固定在显微镜载物台上，最大限度减少呼吸运动伪影，实现对同一区域的长期连续成像。文中提供了多色成像示例，展示骨髓微环境中的细胞与结构（SHG⁺ 骨表面；nestin-GFP⁺ 间充质细胞；cdh5-DSRED⁺、cdh5-GFP⁺ 或 pdgfb-GFP⁺ 内皮细胞）以及恶性造血细胞区室（tdTOMATO⁺ 急性髓系白血病细胞），同时使用荧光对比剂标记血管腔（dextran-TRITC）。在数小时至数天内测量的不同血管区域的血管参数，包括血管长度、直度、直径以及通透性，可为组织行为与健康状态提供重要信息。

方案

所有动物实验均在法国批准的伦理协议APAFIS#27215-2020041513522374 v6下进行 "法国高等教育、研究与创新部"

1. 用于3D打印的生物相容性钛制头部固定植入物的设计

注意：我们使用具有内置有限元分析（FEA）功能的参数化建模计算机辅助设计（CAD）软件（参见材料表）设计了一种生物相容性头部固定植入物。设计过程的主要输入包括小鼠颅骨的高分辨率解剖模型、显微镜物镜模型以及固定系统模型，这些共同决定了植入物的尺寸和构型。最终输出为与平台无关的网格文件，通常为 STL 或 STEP 格式，可兼容大多数 3D 打印软件。该文件格式可确保准确无误地将设计传输至 3D 打印机，实现精确的植入物制造。

1. 小鼠三维模型的制备
   1. 将已制备好的小鼠头骨放置于 体内在微型CT扫描仪中。
   2. 设置扫描参数以获得精细解剖结构的最佳分辨率：打开 控制面板 以及在 扫描条件 切片，选择一个视野（视野）。使用 实时观察 定义扫描体积。
      注意：探测器分辨率将决定视野（FOV），进而基于探测器分辨率确定体素大小。在较新的微型CT设备中， 5 mm 视野 通常对应于 5 µm 体素尺寸，10 mm 视野范围 到 10 µm 体素尺寸，25 mm 视野 到 21 µm 体素大小在该分辨率下，有限的视野可能需要进行多次扫描才能覆盖整个颅骨。多次扫描时，各扫描区域之间需要有重叠。
   3. 在成像软件中将多个高分辨率扫描图像拼接，以创建一个完整的颅骨综合模型。
   4. 将微计算机断层扫描（micro-CT）的DICOM文件导入分割软件（例如 3D Slicer、Amira、Avizo 或 Mimics），以分离颅骨。
   5. 采用基于阈值的分割方法将骨组织与周围结构分离，并对复杂或噪声区域进行手动调整以优化结果。
      1. 在 3D Slicer 中，首先导入 DICOM 文件并加载数据集，观察 CT 切片 轴向, 矢状，以及 冠状的 切片视图。
      2. 打开 片段编辑器r，点击 添加 创建新的分割 | 添加 创建一个新片段，该片段将进行阈值处理。
      3. 在 片段编辑器 面板，单击 阈值 效应。调节 下部 和 上部 调整阈值滑块（或输入数值），使待分割区域在切片视图中以红色高亮显示。此时，已生成经过阈值处理的三维分割区域。
   6. 要将分割后的颅骨导出为STL文件，需切换至 分割模块确保已选中阈值分割的区域。在 输出/输入模型 和 标签图 切片，设置 导出类型 到 模型。和 文件格式：STL. 单击 导出 按钮
      注意：STL 文件采用三角网格格式，用成千上万个三角形表示颅骨表面，以精细的细节还原解剖形态。
      1. 如有需要，按照以下步骤在 MeshLab 中进行拼接：
         1. 通过点击导入网格 文件 | 导入网格 并选择其中一个作为参考扫描。
         2. 使用以下扫描进行对齐 对齐工具 (滤光片 | 注册 | 对齐通过标记相应点并使用 过程.
         3. 通过点击合并对齐的扫描图像 滤镜 | 网格图层 | 拼合可见图层 与 仅合并可见图层 选项
   7. 清洁并修复网格，消除重复的顶点和三角形，以去除由噪声引起的三角形并填补任何意外的孔洞，从而获得光滑且连续的表面，具体步骤如下：
      1. 点击 滤镜 | 清理与修复 | 移除重复顶点.
      2. 点击 滤镜 | 清洁与修复 | 移除重复面.
      3. 点击 滤镜 | 清洁与修复 | 移除孤立碎片（按面数）. 指定一个阈值用于 最少面部数量 以保留（例如，将此阈值设低以去除小簇或噪声）。
      4. 点击 滤波器 | 重网格化、简化与重建 | 闭合孔洞.
   8. 对微计算机断层扫描（micro-CT）生成的初始STL文件进行网格简化，将其三角面数降至约10,000–30,000个，因为原始文件的三角面数过高，无法与CAD软件兼容。在细节丰富的区域，保留颅骨顶部较小的三角面，以确保植入物的精确贴合；在较为粗糙的区域，使用较大的三角面简化非关键区域，以减小文件大小并优化处理效率。
      注意：网格简化按区域进行，详见1.1.8.1-1.1.8.3。
      1. 使用 选择连通区域 在一个 区域选择工具 选择需要简化的区域。
      2. 使用 二次边折叠简化 在选定区域上设置参数。单击 滤波器 | 重网格化，简化 和 重建 | 简化：二次边折叠衰减设置 质量阈值 到 0.8，保留网格边界 到 是，保留拓扑结构 到 是，目标面孔数量：设置一个与之对应的目标数值 分辨率 需要。
      3. 根据需要重复操作，直至三角形总数减少至目标水平。然后，将简化后的模型保存为 STL 文件。
2. CAD模型中颅骨模型的制备
   1. 将STL格式的简化颅骨模型导入CAD软件中作为一个新零件或模型。根据软件功能，如有必要，确保导入的文件已正确转换为实体或曲面体。将模型保存为CAD软件的原生文件格式，以便进行后续修改，并确保与后续设计步骤的兼容性。
   2. 在该模型上标记前囟（Bregma）和后囟（Lambda）作为参考点，并建立前囟-后囟轴。
   3. 创建包含前囟-后囟轴的正中矢状面。
   4. 在正中面，创建一个与颅顶相切的轴，然后保存制备好的颅骨（补充图 S1).
   5. 创建一个新的装配体，以使前囟点与原点重合，正中矢状面与右侧面重合，并使颅顶轴线保持水平，然后插入已准备好的颅骨。
   6. 头部固定植入物将在装配体中直接设计，以确保与制备好的颅骨模型完美贴合。为此，需在装配体中将植入物创建为一个新零件。首先，导航至 插入 | 组件 | 新部件 在CAD软件中，当系统提示时，选择颅骨表面或组件的顶面作为参考，以定位和固定新零件。
      1. 在颅骨上创建一组等间距的平面（间距为 2 mm）。在每个平面上创建一个草图，并在每个草图上绘制一条距离颅骨顶部表面 0.2 mm 上方、呈九点对称样条形式的 0.2 mm 偏移投影曲线。补充图 S2).
      2. 使用这些样条曲线创建扫掠曲面 颅骨极限表面确保该表面光滑无任何缺陷，用于植入体结构的构建。
3. 颅骨上可观测表面的定义
   注意：根据三维模型，确定颅骨顶部最适合进行三维观察的最平坦区域。该区域经过仔细选择，以确保双光子显微镜物镜的最佳通路，同时兼顾颅骨的生物学完整性和结构完整性。该区域的界定可采用立体定位坐标，以前囟点（Bregma）作为坐标系的原点。
   1. 在颅骨平面绘制草图，从前后向（AP）+6.5 至 -2 处创建一个宽度为 6 mm（在 AP 0.0 处）的梨形样条。这将作为 可观察表面轮廓 (补充图 S3).
      注意：显微镜物镜相对于颅骨上先前定义的可观察表面进行虚拟定位。此步骤涉及确定物镜的尺寸和形状所带来的空间限制，确保植入物设计满足显微镜的使用要求。
   2. 将显微镜物镜模型垂直插入装置中。将其焦点约束在与颅骨骨面平行的一个平面上，并定义 显微镜物镜的包围体积.
   3. 通过沿可观测表面轮廓扫描物镜来创建体积。
   4. 在定义的观测表面周围创建一个观察窗口，确保显微镜物镜能够无障碍接近。
      注意：观察窗为环形结构，具有保留浸液和作为支撑结构以确保保护盖正确闭合的次要功能。
   5. 在颅骨平面创建草图，并复制可观察的表面轮廓。
   6. 创建一个厚度为0.5 mm的平行轮廓。将该双层轮廓向上拉伸0.9 mm，向下以4°拔模角拉伸至颅骨限定表面（Skull Limit Surface）。
4. 定义接合部、尾部和燕尾结构。
   1. 在颅骨平面创建草图，绘制一个厚度为0.5 mm的C形结构，连接至观察窗，并以4°拔模角向下拉伸2 mm至颅骨表面限界表面补充图 S4).
   2. 在颅骨平面创建一个示意图，并用厚度为0.4 mm的矩形径向填充该区域，矩形之间间距为1 mm。
   3. 以与观察窗相同的方式挤出。
   4. 根据可用空间，利用颅骨固定来制作植入物的尾部。
      1. 创建一个与粘接结构相切的横截面，以及另一个在其后方12.5 mm处的横截面。
      2. 在这些平面上绘制矩形。在两者之间扫掠生成一个锥体，使其与水平方向的夹角分别约为20°和37°。
      3. 在尾部靠近粘接结构处加工一个M1.6螺纹孔。
      4. 在尾端绘制草图并画出燕尾轮廓。
      5. 将此轮廓延伸 8 mm。
5. 验证物镜无干扰
   1. 检查整个植入物设计，包括观察窗和燕尾结构，以确保其与显微镜物镜之间不存在机械干涉。检查是否存在与步骤1.3.3中所创建空间发生冲突的情况。
      注意：此验证步骤对于确保物镜能够按要求无阻碍地定位和移动至关重要。
6. 移除植入物尾部不必要的材料，以减轻重量并减少动物可能的不适。
   1. 在中位面上创建一个草图，并在其上绘制三角形切口，通过从尾部主体进行拉伸操作，形成桁架结构。
   2. 在垂直平面重复上述操作。
7. 通过有限元法（FEM）模拟验证最大位移，以分析种植体在不同条件下的力学性能。
   注意：该模拟有助于预测植入物在使用过程中的最大位移和应力，从而确保其可靠性。
   1. 启用 CAD 软件的仿真附加模块。
   2. 在 模拟工具栏，创建一个 新静态研究. 导航至 模拟 标签（如果可见）或前往 模拟 | 研究. 在 研究 对话框中，选择 静态 作为 研究类型. 点击 好的 以创建新的研究（补充图 S5).
      注意：此类研究适用于分析种植体在使用过程中预期承受的静态载荷下的变形与应力。
   3. 选择与实际植入物成分（Ti6Al4V）相匹配的植入材料。
   4. 定义固定约束以模拟植入物与燕尾固定装置接触的附着点。定义 dovetail的顶面 作为 固定的.
   5. 定义 底面垂直载荷 植入物的。设定 1 N 垂直力.
   6. 生成网格。在预期会出现高应力或大变形的区域细化网格（补充图 S6）。为此，请右键单击研究树中的网格元素，然后选择 创建网格… 在 网格 对话框中，调整 网格密度 通过滑块或激活 网格控制框 独立设置最大和最小单元尺寸。单击 好的 以生成网格。
      注意：软件会为研究自动生成初始网格，但为了获得更精确的结果，可对网格进行细化，选择更精细的网格，特别是在对种植体稳定性至关重要的区域（如观察窗）。在这些区域使用更精细的网格可提高模拟的准确性，更好地捕捉局部应力集中。
   7. 启动静态分析，以计算种植体上的位移、应力和应变分布。
   8. 分析结果。检查位移图以确定变形最大的区域。该图显示了植入物在施加载荷下的变形程度，突出显示可能存在过度移动风险的区域。确保观察窗口内的变形不超过3微米。
8. 最后，设计一个保护盖，用于在不使用时保护观察窗。该盖子可防止暴露的骨骼受到环境污染物和物理损伤。

2. 小鼠处理、麻醉及头部植入物的手术植入

注意：此处可使用雄性或雌性、7至12周龄的C57BL/6小鼠或转基因小鼠，如图所示。为诱导白血病细胞在骨髓（BM）中定植，需在成像前2-3周通过静脉注射接种Horton等¹²所述方法制备的白血病细胞。为确保创口健康，必须采用无菌操作技术。

1. 在超净台内准备好无菌手术器械（钝头剪刀和镊子）、剃毛器以及耗材，包括眼用凝胶、生理盐水、消毒剂、牙科水泥、吸水棉签和清洁纸巾。开启 bead 灭菌器。
2. 将小鼠放入麻醉诱导舱中，通入 3-4% 异氟烷与空气中的氧气混合气体。当动物完全麻醉后（通过检测翻正反射消失以及呼吸加深变慢来确认），将异氟烷气流切换至麻醉面罩的鼻罩，并将异氟烷浓度降低至 1.5-2%。在手术前 30 分钟皮下注射镇痛药物（Buprenorphine，0.01 mg/kg）。
3. 将小鼠置于 37 °C 的加热垫上，并持续观察其呼吸频率。可选：对于具有病理表型的小鼠，可添加保温毯以在整个麻醉过程中维持正常体温。
4. 在手术前 30 分钟皮下注射镇痛药物（Buprecare，0.01 mg/kg）。
5. 使用电动剃刀剃除小鼠头部的毛发。
6. 在小鼠眼睛上滴加一滴眼用凝胶，以防止麻醉期间角膜干燥，注意避免凝胶滴落至头皮区域。
7. 清洁小鼠头部，清除手术区域残留的毛发。用浸有消毒剂的棉片擦拭头皮顶部。务必彻底清除所有毛发，以避免成像伪影及伤口感染风险。
8. 使用先前经高压灭菌处理的镊子和剪刀。若需重复使用，每次使用前应将其放入 bead 灭菌器中至少灭菌 30 秒。在头皮中央区域做一小切口，暴露颅骨中缝。沿中缝确定成像区域的正确长度和宽度。小心移除该部分头皮，用镊子提起两耳之间的皮肤，在头后部做一小切口。提起皮肤，将剪刀置于皮下，沿成像区域外缘仔细剪开。
9. 清除颅骨与头皮之间的结缔组织。用蘸有无菌 PBS 的棉签轻轻擦拭暴露的颅骨表面。迅速进行头固定装置与小鼠颅骨的粘附操作，以避免颅骨长时间暴露（<10 分钟）。
10. 根据制造商说明，在培养皿中调配适量牙科水泥形成糊状，并迅速将其涂抹于头固定装置的底部。
11. 将头固定装置准确放置在暴露的颅骨上，注意避免牙科水泥进入成像区域，然后等待其固化。
12. 待牙科水泥固化后（通常在 3-5 分钟内），向成像腔内加入数滴 37 °C 的 PBS，以保持颅骨湿润。

使用双光子显微镜进行成像

1. 开始手术前，打开激光器并预热以使其稳定。打开显微镜并启动采集软件。选择合适的物镜（本实验使用 25x/0.95 WATER 浸液物镜）。
2. 使用固定式直立显微镜支架，确保有足够的空间放置带加热垫的兽用光学平台，且整个装置可随 xy 载物台整体移动。使用坚固的铝制光学平台作为基座，用于固定头部植入件和立体定位面罩。将与异氟烷注入和排出相关的柔性软管及其连接器连接至显微镜笼内的面罩。
3. 设置快速扫描的采集参数：格式 512 x 512 像素；速度 600 Hz；和缩放倍数 1。
4. 将激光波长调至 880 nm，以便使用相同的激发波长检测 SHG、GFP 和 tdTOMATO 信号。
5. 在激活 NDD 探测器之前，关闭室内灯光并正确关闭显微镜支架周围的屏蔽箱。定义光谱检测通道：PMT1 用于检测SHG [388 - 431 nm]；HyD2 用于GFP [485 - 548 nm]；HyD3 用于tdTOMATO [551 - 645 nm]。将偏移量 保持为0。
6. 创建一个新的项目数据集，并根据具体实验重命名。
7. 一旦头部固定植入物通过骨水泥固化确认牢固附着于小鼠颅骨，即开启通向显微镜立体定位面罩的异氟烷气流。
8. 迅速将小鼠移至显微镜下。一只手抬起小鼠鼻部，同时小心地将小鼠门齿插入面罩中，以确保异氟烷可通过鼻腔进入。
9. 一手固定小鼠，另一只手轻轻将头部固定植入物的燕尾部分滑入固定夹具中，并通过旋紧螺丝旋钮半圈将其锁紧。
10. 插入预先涂有水性凝胶的直肠探针以监测体温，并向小鼠眼睛滴加眼用滴剂。
11. 用大量水性凝胶或 PBS 填充头部成像腔室，并降低水浸物镜使其完全浸入，以获得最佳的双光子激发信号激发与检测效果。
12. 移动 x-y 载物台和 z 轴驱动器，将焦点对准支架瘢痕中的中央骨组织。
    注意：可方便地使用显微镜目镜配合金属卤化物灯作为光源，并通过三通道激发-发射滤光片进行过滤。由于缺乏光学切片能力，无法获得清晰图像；但经过练习后，颅骨中央区域较易识别。
13. 在识别出由骨表面和中央静脉标记的组织后，关闭金属卤化物灯并关闭显微镜笼窗，以保护 HyD 探测器并允许红外（IR）激光通过。
14. 将PMT/SHG 增益 设为850 V（其线性工作范围），并将HyD 增益 设为100%。逐步增加 IR 激光功率，直至三个通道中信号最弱的通道获得动态范围为 200 灰阶（使用 8 位探测器动态）的图像。若发射信号差异过大或出现饱和，可通过使用"下限"查找表（LUT）模式降低其他探测器的增益。
    注意：在本实验中，激光功率 为30% 即可在所有通道中获得足够对比度。
15. 在采集软件中，寻找由骨表面（SHG）包裹的 BM 小室区域（GFP⁺, tdTOMATO⁺）。
16. 为寻找不同 ROI，激活LAS NAVIGATOR 功能，并使用螺旋模式 对整个区域进行概览成像。当采集面积足够大时停止采集。保存该概览图像并合并后重命名：该图像将作为纵向成像的参考图像。
    注意：注意避免生成过大的螺旋轨迹，以防装置支架与物镜发生碰撞。
17. 通过点击单幅图像图标记录若干 ROI 位置，并在任务列表中为每个位置重命名。截取屏幕图像，以显示各 ROI 相对于先前保存的概览图的位置。
    注意：该截图对于在纵向成像中重新定位 ROI 至关重要，因为本实验所用软件版本不支持调用该组位置信息。
18. 为采集 z-stack 三维图像，选择z-stack 模式，将步长 设为3 µm，并取消勾选所有区域使用相同堆栈大小选项。选择第一个位置，定义其顶部 和底部 位置，检查 z 轴步长，然后点击重新定义堆栈。位置列表中该位置名称旁将出现一个立方体图标。对所有不同 ROI 的位置重复此步骤。
19. 按下采集 按钮，并将图像（三个通道的 z-stacks，约 50 层）保存至指定文件夹。此步骤标记为实验的 T_ctrl；检查采集参数是否正确（三个通道均获得适当动态范围，尽可能避免信号饱和，并确认完整循环的采集时间）。
20. 为测量动态特征（本例为血管通透性），进行时间序列成像。
    1. 在本系统中，三个探测器可同时采集三个通道；若实验需要第四通道（本例为 Dextran 监测），则激活顺序模式 并添加第二个采集序列。将 IR 激光波长调至820 nm，以激发 Dextran Cy5 荧光团。将HyD2 检测范围更改为 [650 - 744 nm]，并关闭其他探测器。选择堆栈间采集模式。
       注意：默认情况下，第二个采集序列的参数与序列 1 相同。
    2. 在开始时间序列采集前，先运行所有位置的采集，确保总记录时间不超过 3 分钟（需考虑顺序模式的额外耗时），这是检测葡聚糖渗漏所需的最短时间。
    3. 在注射葡聚糖前，将采集模式 改为xyzt。在t 模块中，将时间间隔 设为3 min，持续时间 设为 1 小时。
21. 静脉注射 100 µL 的 70 KDa-TRITC 葡聚糖（或 500 KDa-Cy5 葡聚糖），每只小鼠 3 mg，并立即开始采集。
22. 采集完成后，将数据集保存至指定文件夹。
    注意：在执行上述多个步骤期间，应频繁监测小鼠的呼吸频率和体温，并根据需要调整异氟烷流量。理想情况下，体温、心电图（ECG）和呼吸频率应被记录并作为实验元数据保存。

4. 小鼠恢复

1. 成像结束后，在采集软件中关闭 HyDs 探测器，并打开小鼠加热箱（37 °C）。打开显微镜笼体，抬起物镜，从小鼠体内取出直肠探头。接着，轻轻将头固定植入物的燕尾部分从固定夹持器中滑出，将小鼠从显微镜的立体定位面罩转移至加热垫上的手术面罩。
2. 关闭显微镜下方的异氟烷麻醉机 ，并关闭加热垫。
3. 使用无菌棉签轻轻清除小鼠颅骨上的水性凝胶或 PBS。
4. 如前所述¹³，添加 Intrasite 凝胶以维持成像间隔期间颅骨的湿润。
5. 使用专用盖片封闭头颅植入物的成像区域，并用螺钉小心固定。
6. 将小鼠放入 37 °C 的加热箱中，等待其苏醒。随后将小鼠送回动物饲养设施，安置于含有水凝胶和丰富环境材料的清洁笼具中。每日监测动物状况，观察是否存在疼痛或感染迹象，如有则每日给予布托啡诺（Buprecare）。为保持颅骨湿润，每周更换两次 Intrasite 凝胶。
   注意：应选择较高的笼具，配备纸板遮蔽屋和筑巢材料，并确保将小鼠单独饲养在各自的笼子中。

5. 纵向采集

注意：可在接下来的几天内再次对小鼠进行成像。但需确保每周成像次数不超过三次，以避免反复麻醉可能引起的不良影响，如眼睛干涩、过度疲劳，以及呼吸困难和低体温。

1. 对于已安装头部固定装置的小鼠进行重新成像时，遵循步骤 2.2，并在小鼠眼睛上放置少量眼用凝胶，以防止操作过程中眼睛干燥。
2. 按照第 3 节至步骤 3.16，获取概览图像。
   注意：使用钛金属头部植入物时，无需调整固定装置的高度或角度，即可非常方便地定位到感兴趣的整体区域。
3. 如有需要，使用打开图像和对齐模块对先前和新获取的图像进行重新对齐。
4. 打开步骤 3.17 中的屏幕截图图像，以在原始位置标记相应点位。
   注意：当预期存在表达 GFP 的血管及相关细胞发生重塑时，使用 SHG 对比模式尤为有用。
5. 以与步骤 3.18–3.22 中所述相同的方式采集 z 轴层扫图像和时间序列图像。

6. 血管参数定量分析

1. 血管参数
   1. 要在 IMARIS 中打开软件生成的图像（.lif 文件），首先使用文件转换器将其转换为 ".ims" 格式。用 IMARIS 打开 ".ims" 文件，检查元数据（X、Y、Z 尺度），并选择 Filament 模块。选择 跳过自动创建，手动编辑。
   2. 为在生成纤维结构时获得更好的可视化效果，请转到 设置（树叶图标），在 样式 中选择 线条，并将 像素数量 保持默认值（1）。勾选 显示分支，包括 起始点、分支点 和 末端点。取消勾选 显示棘突。
   3. 在 绘制（画笔图标）下，选择 方法：AutoPath；直径设为 5 µm，并选择与血管相关的通道源（本例中为 TRITC-Dextran）。最后，勾选 自动中心 和 自动直径。
   4. 通过使用 Shift + 右键单击 选择分支的 起始点，并使用 Shift + 左键单击 选择分支的 终点，开始绘制纤维结构。
      注：起始点显示为浅蓝色，分支点为红色或深蓝色，末端点为绿色。
   5. 在绘制过程中，使用鼠标滚轮调节纤维结构的直径。
   6. 若要连接两个具有不同末端点的纤维结构，请在两者之间创建一个新的起始点，并将其分别连接至各末端点。
      注：因此，分支点处将出现绿色的末端点。
   7. 完成血管树的构建后，返回 设置，确认起始点、分支点和末端点的数量正确。选择 圆锥 以可视化直径，并检查其外观。
   8. 若某纤维结构的直径（或连接）显示不正确，请转到 编辑（铅笔图标），右键单击选择要删除的纤维结构，然后点击 删除。使用鼠标滚轮调整直径后重新绘制该纤维结构。
   9. 要提取所有生成的统计学数据并保存，请点击 统计 图标 | 将所有统计数据导出到文件（屏幕底部的多个软盘图标）。
      注：为避免纳入任何与血管无关的异常纤维结构，统计分析中仅包含长度超过 20 µm 的纤维结构。
2. 通透性量化
   注：要在 IMARIS 中打开软件生成的图像（.lif 文件），首先使用文件转换器将其转换为 ".ims" 格式。
   1. 为将注射葡聚糖前后采集的图像合并至同一时间序列，请进入 Surpass 模式，点击第一张图像（T_ctrl，注射葡聚糖前）和延时图像（时间点 1，60 分钟）以打开它们，并通过点击 编辑 和 添加时间点 进行合并。
      注：为校正可能存在的三维漂移，请使用 Fiji 与 IMARIS 之间的桥接功能，执行步骤 6.2.2–6.2.7。在 Fiji 中安装以下插件："IMARIS_Bridge96.jar" 和 "IMARISBridgeUtils.jar"。使用 "StackReg Pluging"（Fiji 中已内置）执行三维漂移配准。若无需校正，请直接进入步骤 6.2.8。
   2. 为进行三维漂移校正，请点击 插件 | IMARIS | 从 IMARIS 获取图像，在 Fiji 中打开以桥接来自 IMARIS 的图像。
   3. 在 Fiji 中，选择 插件 | 配准 | 校正 3D 漂移。
   4. 在出现的新窗口中，选择合适的 配准通道。
      注：本例中为 Nestin-GFP，但也可选择任何能标记固定物体且信噪比较高的通道。
   5. 为增强对微小漂移的检测，请选择 多时间尺度计算、亚像素漂移校正 和 增强图像边缘，其余设置保持默认。
   6. 为将校正后的图像桥接回 IMARIS，请选中图像并点击 插件 | IMARIS | 图像发送至 IMARIS。
   7. 点击 文件 | 另存为，将其保存至相应文件夹。
   8. 为可视化所有采集的通道，请点击 编辑 | 显示调整。选择 葡聚糖通道 和 时间点 1（屏幕底部的 第 2 帧）。
   9. 通过勾选 添加新表面 复选框（蓝色对象），在 时间点 1 创建定义 血管腔 的新表面。
   10. 在 表面 1 中，进入 属性，取消勾选 算法设置 中的所有参数。点击 下一步（蓝色箭头）。
   11. 在 源通道 下选择 血管通道（本例中为葡聚糖），并勾选 平滑 和 背景减除。其余参数保持默认。点击 下一步（蓝色箭头）。
   12. 根据表面在厚度和阳性区域覆盖范围上的显示效果，调整 阈值。点击下一步（蓝色箭头）。
   13. 使用默认的 体素数量 滤除非特异性表面（主要是小点状结构）。点击 最后一步（绿色箭头）。
   14. 如有必要，通过点击 设置参数 中的 编辑（铅笔图标）继续手动调整表面。要删除某个对象，左键单击选中后点击 删除。若要删除的对象与另一对象相连，请在两者之间按 Shift + 左键单击，然后选择 切割表面 以断开连接。根据需要重复此步骤。
   15. 最后，使用 选择模式（右侧靶心图标）并按 Ctrl + 滚轮 恢复所有对象。当所有对象均被选中后，左键单击并点击 合并。
   16. 为生成参考表面，将此表面复制到其他时间点。选择整体表面，点击 复制，并将其重命名为 血管内。
   17. 选择 血管内 表面，点击 复制到所有时间点。
   18. 分割葡聚糖信号以区分血管内（IN）和血管外（OUT）区域。为创建所有时间点的 IN 通道，请点击表面 血管内 | 编辑（铅笔按钮）| 遮罩全部。
   19. 在 通道选择 中，选择相应通道并勾选 应用遮罩前复制通道。在 遮罩设置 中，仅勾选 表面外部体素设为 0 的恒定内外值。最后，同时勾选 应用于所有时间点。
   20. 在 显示调整 中，默认会创建一个名为 masked 的新通道。将其重命名为 IN。
   21. 为创建所有时间点的 OUT 通道，请重复步骤 6.2.18–6.2.20，但选择 将表面内部体素设为 0。将此新通道重命名为 OUT。
   22. 为提取统计学数据，请点击 统计图标 | 将所有统计数据导出到文件（屏幕底部的多个软盘图标）。
   23. 为分析通透性，对每个时间点，将 血管外通道的强度总和 除以 血管内通道的强度总和。

结果

在 图1 和 图2，图示为钛合金头固定植入物的CAD模型，该植入物置于扫描得到的小鼠颅骨上，设计上贴合颅骨解剖结构，具有轻量化和生物相容性，能够牢固固定于显微镜载物台上，确保细胞水平的稳定性。通过遵循本逐步操作方案，可将植入物稳定地固定于小鼠颅骨，并利用其燕尾结构牢固连接至显微镜支架，提供平坦的成像区域，便于液体保留及长时间活体观察。植入物可加装盖板以减少伤口损伤或感染风险，实现对同一组织区域连续数周的重复成像。小鼠苏醒后佩戴头部植入物可自由行走、进食并维持正常活动节律。

图3展示了颅骨骨髓血管系统的平铺扫描图像，其由异质性的毛细血管组成，包括小动脉、过渡型毛细血管和窦状毛细血管。这些血管嵌入复杂的组织微环境中，与骨表面及血管周围间充质细胞紧密接触。在白血病发展过程中，可在骨髓微环境中检测到单个孤立的白血病细胞，这些细胞紧邻血管分布；随着时间推移，其植入程度逐渐增加，在疾病晚期阶段充满整个颅骨。

图4 展示了如何利用本实验方案获得的图像提供可量化的数据，并可通过统计学方法进行分析。我们展示了如何使用IMARIS的filament工具对血管进行分割，并测量血管片段的长度和直径，以及其直度。此外，还可评估这些参数之间的相关性。

图5 显示了急性髓系白血病（AML）进展过程中第4、7和10天颅骨骨髓（BM）两个不同位置的纵向成像结果，其中第10天时通过流式细胞术检测显示骨髓中白血病细胞的植入率约为50%（未展示）。我们可以观察到原有血管的尺寸发生了显著重塑，同时在与局部骨质丢失相关的特定区域出现了新血管的形成。

最后，在图6中，我们展示了如何通过延时成像将血管通透性作为动态参数进行测量，以显示不同血管屏障随时间保留荧光染料的能力。

图1设计与制备一种基于钛的生物相容性头部固定装置 (A) 植入物的组成部分 原位：1 观察环，2 粘接结构，3 稳定锚，4 尾部，5 榫槽，6 螺纹孔，7 前囟。B) 头部植入物与固定装置的连接：8 固定体，9 夹具，10 偏心杠杆，11 结构，12 显微镜物镜。C) 通过有限元模拟（FEM）分析植入物在载荷下的变形，当施加0.04 N力时，最大位移为0.23 µm。D保护盖及其螺钉 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：小鼠活体成像前的准备。（A）成像前手术暴露头部植入物及成像区域的视图。（B）头部植入物牢固地固定在小鼠颅骨上。（C）小鼠清醒状态下置于恢复笼中，头部植入物盖子已关闭。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：颅骨血管系统的活体成像。 （A）通过cdh5-DSRED标记的颅骨血管系统的平铺扫描z投影图像。（B）对所示区域进行放大，以描述由箭头指示的不同类型血管：红色箭头指示小动脉，橙色箭头指示过渡型毛细血管，黄色箭头指示窦状毛细血管。（i）和（ii）为X µm厚组织的z投影图像；（iii）为单层切片图像。（C）骨髓血管多个视野的单层切片图像，显示骨表面（SHG信号）、血管周围细胞（nes-GFP⁺）以及血管腔（dextran-TRITC标记）。（D）与急性髓系白血病（AML）进展相关的血管微环境。分别为AML发展早期（上图）和晚期（下图）的代表性切片图像。MLL-AF9白血病细胞用tdTOMATO标记（红色箭头），血管用pdgfb-GFP标记（绿色箭头），骨表面通过SHG信号显示，巨噬细胞呈黄色（自发荧光，黄色星号）。比例尺 = 200 µm（A），40 µm（B、D下图），50 µm（C）。缩写：BM = 骨髓；GFP = 绿色荧光蛋白；AML = 急性髓系白血病；EC = 内皮细胞。请点击此处查看该图的高清版本。

图4血管参数定量分析 (A通过 IMARIS 测量血管参数 丝状工具 在用TRITC-葡聚糖标记的骨髓血管的代表性z轴投影中。显示了线条和锥形示意图。B) 图像中血管参数的量化 A. (C) 血管参数之间的相关性，显示血管直度与长度呈负相关（Spearman r = -3523；p < 0.0001；R² = 0.2102）与直径（正相关；Spearman r = 0.4110；p < 0.0001；R² = 0.1299）。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

图5：颅骨骨髓在急性髓系白血病（AML）发展过程中两个不同位置的纵向成像。 血管内皮细胞标记为cdh5-GFP，骨表面通过二次谐波成像（SHG）显示，巨噬细胞呈黄色（自发荧光）。图中显示了原有血管的重塑（红色箭头）和新血管的形成（黄色箭头）。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

图6：血管通透性。（A）通过 IMARIS 表面工具 测量血管通透性的示意图。（B）同一区域在1小时内纵向成像的Z轴投影。（C）如图 A 所示区域内血管通透性的定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图 S1：制备好的颅骨。 在正中平面上，创建一个与颅顶相切的轴，然后保存制备好的颅骨。 请点击此处下载该文件。

补充图 S2：间距为 2 mm 的平面图。如何在颅骨范围内创建一组等距平面（间距为 2 mm）。请点击此处下载该文件。

补充图 S3：可见表面轮廓。 在颅骨平面上绘制草图，并从前后方向（AP）+6.5 至 -2 处创建一个宽 6 mm（在 AP 0.0 处）的梨形样条。请点击此处下载该文件。

补充图 S4：观察窗。在颅骨平面上绘制草图，并绘制一个厚度为 0.5 mm 的 C 形结构，连接至观察窗。请点击此处下载该文件。

补充图 S5：单击“新建研究”。 导航至 仿真 选项卡（如果可见），或进入 仿真 | 研究。在 研究 对话框中，选择 静态 作为 研究类型。单击 确定 以创建新研究。请点击此处下载此文件。

补充图 S6：右键单击以创建网格。 在预期应力或变形较大的区域细化网格。 请点击此处下载该文件。

讨论

活体显微成像技术的主要优势在于能够在其原生环境中实时捕捉动态的细胞过程，克服了传统组织学和 离体 成像方法。通过采用本方案所述的先进成像技术结合荧光标记直接观察颅骨骨髓，研究人员不仅能够研究血管功能参数^8,14，还包括白血病细胞的植入和迁移等纵向过程^6,15增殖和代谢活性^16,17 保持生理相关性，并避免与组织固定和处理相关的假象。

与其它骨组织成像部位相比，颅骨骨髓活体成像具有多项优势：易于操作、颅骨透明有利于在不损伤骨组织的情况下实现更清晰的可视化、颅骨结构稳定可最大限度减少组织运动伪影，且在不同实验动物间具有良好的可重复性，便于不同实验组之间的比较。此外，动物可在成像后恢复并进行纵向重复成像，从而减少单个研究所需的动物数量。值得注意的是，已有研究发现不同小鼠品系在颅骨血管生长模式及随之发生的成骨过程方面存在品系特异性差异¹⁸，因此在为特定小鼠品系设计成像植入装置时，必须考虑这一因素，以确保理想的解剖兼容性并准确到达目标成像区域。

另一个需要提及的重要问题是，颅骨骨髓（calvarial BM）在血管和造血特性方面可能与其他骨骼存在差异，这一问题在近年来才开始受到关注。最新研究表明，不同骨骼具有局部特异性的功能，颅骨骨髓在造血作用、骨结构与血管结构及功能方面均与其他骨骼存在差异^{19,20,21,22,23}，且对神经系统疾病的反应也有所不同²⁴。在将特定颅骨研究结果推广之前，这些差异需要进一步研究并予以充分考虑。

成像植入物的设计与构建是本实验设置中的关键步骤，始于材料的选择。生物相容性植入物在生物医学研究中发挥着关键作用，可支持多种应用，涵盖组织工程、再生医学到药物递送系统等领域 体内 监测设备。用于活体成像的颅骨植入物材料选择至关重要。理想的材料应具备优异的生物相容性、适合维持最小形变和整体稳定性的力学性能，以及能够在不引发炎症的情况下与颅骨整合的能力。钛因其在动物体内具有良好的耐受性，与生物组织接触时不会诱发不良反应，同时具有抗腐蚀性，即使暴露于体液或实验溶液中也能确保长期稳定性，因而成为理想选择。此外，其较高的机械强度使其具有抗变形和抗断裂能力。尽管强度高，钛的密度相对较低，可制成轻量化的活体成像设备，从而减轻对实验动物和研究人员的负担。最后，钛在加工方面具有高度可塑性，可根据特定实验需求（如尺寸、形状和功能）定制活体成像设备。

本文中，我们利用具有内置有限元分析（FEA）功能的参数化建模CAD软件（特别是SolidWorks）设计了一种生物相容性的头部固定植入物。该方法可对植入物的结构和空间需求进行精确的迭代调整，从而确保其解剖相容性与机械强度。FreeCAD等免费替代软件也提供类似的建模与仿真功能。设计过程的主要输入包括小鼠颅骨的高分辨率解剖模型、显微镜物镜模型以及固定系统模型，这些共同决定了植入物的尺寸与构型。最终输出为一种平台无关的网格文件，通常为STL或STEP格式，可兼容大多数3D打印软件。

第一步是利用高分辨率成像技术（如活体微计算机断层扫描（in vivo micro-CT））获取小鼠头部的详细解剖特征。该方法能够提供最高的解剖细节和精度，可捕捉颅骨的微观结构。对已制备的无软组织颅骨进行3D扫描也是一种可选方案。该方法采用激光或结构光扫描仪，通常应用于已清理软组织的颅骨，可精确获取表面轮廓，但在内部结构细节方面不如micro-CT。此外，也可从开源出版物和数据库²⁵或DigiMorph {https://www.digimorph.org/specimens/Mus_musculus/}下载解剖模型。尽管这种方式较为便捷，但这些模型可能缺乏特定标本的细节，因此通常需要根据研究中具体动物的实际情况进行调整，例如按实际前囟-后囟距离（Bregma-Lambda distance）进行比例缩放。所获取的数据随后用于构建小鼠颅骨的精确三维模型，作为植入物设计的基础模板。

为了将植入物固定在颅骨上，设计了一种粘接结构，用于覆盖观察窗未占据的颅骨表面。该结构必须提供牢固的附着点，同时避开关键的解剖结构。粘接结构设有多个开口，以确保粘合剂通过扩散在植入物下方充分聚合。此外，粘接结构的侧壁具有微小的拔模角度，使粘合剂能够牢固地锚定在这些倾斜的壁面上。植入物的尾部从主体延伸至固定系统，其设计至关重要，可在观察过程中实现植入物的对齐与稳定，其结构需考虑小鼠头部的可用空间及解剖学限制。最后，植入物设计中集成了燕尾槽结构，便于植入物与固定系统之间的快速安装与拆卸。该设计提升了植入物在重复观察过程中的实用性与操作便捷性。燕尾槽结构可实现可重复的精确定位，便于在多次成像过程中对观察组织进行便捷取回与复位。

考虑采用颅骨骨髓活体显微成像的研究人员应仔细评估其研究目标和实验需求，以确定该方法是否适用于其研究。尽管活体显微成像可提供关于造血作用、组织微环境调控及血管动态的无与伦比的洞察 在体，它也存在一定的技术挑战和局限性。研究人员应通过精心设计实验、优化成像参数以及使用适当的对照措施来应对这些挑战。此外，研究人员还需考虑专用成像设备的可及性、荧光标记技术的专业知识，以及图像分析所需的计算资源。总体而言，颅骨骨髓的活体显微成像在推动我们对造血作用和血管生物学的理解方面具有巨大潜力，为观察骨髓微环境中发生的动态过程提供了独特的窗口。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amira	赛默飞世尔科技™
麻醉			异氟烷 2% 至 3%
麻醉面罩（动物检测）	Minerve
麻醉机	Minerve
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze	杰克逊实验室	MGI:3809523
CalvariaVue	Ymetry	https://ymetry.com/site/head-fixion-implants/44-mouse-head-fixation-implant-for-calvaria.html
牙科水泥	Kemdent	SUN527
Dextran 500 kDa-Cy5	Tebu-bio	DX500-S5-1	3 mg/只
70 kDa 葡聚糖-TRITC	Sigma	T1162	3 mg/只小鼠
消毒剂	MP-Labo	Dermidine-60ml
电动剃须刀	七叶树属	伊西斯
眼用凝胶	Ocry-gel	10g
Fiji	https://imagej.net/software/fiji/downloads	v 17 5月30日
Fiji 插件用于与 Imaris 连接	https://imagej.net/software/fiji/downloads	Imaris_Bridge96.jar；ImarisBridgeUtils.jar
加热箱	日期和	Thermacage
手术用加热垫	Minerve
成像加热垫 &和直肠探头	F. Haer
Imaris v9.6.0	Oxford Instruments
Intrasite 凝胶	Chinoxia	2390766
LAS AF 软件	Leica	LAS X 3.5.7.23225
药物			布托啡诺，0.01 mg/kg
目标物镜 HCX IRAPO L 25x/0.95 水镜	Leica	506374
磷酸盐缓冲液（1× PBS）	Sigma	P4417	高压灭菌器灭菌
SP8 DIVE FALCON 多光子显微镜	Leica
立体毒性掩膜	Minerve	1201261
灭菌珠	Sigma	Z742555
手术器械	莫里亚	4877A; 2183
保温毯	SECURIMED	11006
拭子/组织			高压灭菌器灭菌
1 mL 26 G 注射器	BD Plastipak	305501
温度控制器	F. Haer	40-90-5D-02
Tg(Nes-EGFP)33Enik 小鼠	杰克逊实验室	MGI:5523870
Tg(Pdgfb-icre/ERT2)1Frut 小鼠	杰克逊实验室	MGI:3793852
Tg(Cdh5-cre/ERT2)1Rha 小鼠	杰克逊实验室	MGI:3848982
超声耦合剂	帕克实验室	Aquasonic 100