我们提出了一种优化的扫描电子显微镜实验方案，用于观察包含植物和真菌生物量以及微生物群和生物膜的高度异质且脆弱的样品。该方案可用于描述微生物群空间结构的维度特征。
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本文内容
摘要
摘要
在宏观生态系统中，例如雨林或珊瑚礁，生物体的空间定位是我们理解群落生态学的基础。同样，在微生物世界中，微尺度生态系统也远非生物与栖息地的随机均质混合。获取微生物的空间分布对于理解微生物群的功能与生态至关重要，因为共存的物种更有可能相互作用并影响彼此的生理状态。
真菌种植蚂蚁群落的核心是一个跨界的微生物生态系统，这些蚂蚁培养担子菌门真菌作为营养来源。切叶蚁采集多种底物（主要为植物来源），由所培养的真菌代谢这些底物并形成一种海绵状结构，即"微生物园"，其功能类似于体外消化系统。该“微生物园”由真菌菌丝交织而成，菌丝通过代谢底物不断生长，从而为具有特征性且已适应的微生物群落创造生态位并使其定殖。目前认为，这些微生物群落在底物降解和真菌生长过程中发挥重要作用，但其空间组织结构仍有待阐明。
本文中，我们描述了如何利用扫描电子显微镜（SEM）以前所未有的细节研究不同培菌系统中培菌蚁的微生物群落及生物膜的空间结构。SEM成像已提供了微生物群落空间结构与组织方式的详细描述。SEM结果显示，微生物群落通常以生物膜形式聚集，这是培菌系统中微生物生态景观中普遍存在的结构。我们展示了用于固定、脱水、干燥、溅射镀膜以及成像这类复杂群落的实验方案。这些方案经过优化，可处理包含植物和真菌生物量以及微生物群落和生物膜的脆弱且异质的样品。
引言
生态系统由特定地理区域（即环境）内通过各种过程相互关联的生物组成。生物随时间与环境相互作用，从而形成复杂且异质的空间格局。空间格局决定生态多样性与稳定性，并最终影响生态系统的功能1,2,3,4。在湿地、稀树草原、珊瑚礁和干旱生态系统等大尺度生态系统中，空间格局与资源的流动和浓度密切相关。空间异质性和空间格局有助于资源优化，使得生态系统比均质系统更具恢复力2。群落生态学中生物的空间定位基础同样适用于微生物世界。
微生物生态系统并非生物体在微生境中随机且均匀混合的状态，而是呈现出定义其大部分功能的空间格局5,6,7从温诺格拉斯基柱到环境及宿主相关微生物群落，这些生态系统在空间上呈异质性分布，其空间排布会引发不同的表型响应。共存物种更有可能相互作用并影响彼此的生理状态。因此，群落的空间结构相较于其组成 本身，界定生态系统属性和生态位5
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方案
1. 野外蜂群采样
注意：采集蚂蚁种群时，须确保已获得当地法律法规要求的所有许可后方可进行采集。在本研究中，采集许可证编号 #74585 由巴西奇科·门德斯生物多样性保护研究所（Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade, ICMBio）签发。若样本来源于实验室种群，请直接进入第 2 节。
- 找到并标记蚁群位置。在蚁巢周围挖掘一条沟槽，直至暴露菌圃室（图2A）。
注意：某些切叶蚁物种可能将巢穴建于落叶层下或腐烂的树干内部。在此类情况下，应小心翻动落叶层或谨慎劈开树干以采集样本。有关多种切叶蚁物种的巢穴定位、样本采集及活体蚁群维持的详细信息，请参见 Sosa-Calvo 等人46。 - 从侧面打开菌圃室，以防止土壤掉落至菌圃表面。根据菌圃大小，使用昆虫镊子、勺子或厨房滤网小心采集菌圃样本。
注意：采集前务必对工具进行灭菌处理。采集切叶蚁菌圃时，应佩戴厚实的织物手套，以防止（或至少减轻）工蚁叮咬。对于其他切叶蚁物种，佩戴织物手套为可选操作。 - 将菌圃样本转移至洁净的塑料容器中，容器内需铺有一层石膏以调节菌圃湿度。转移菌圃及工蚁后，将容器密封，防止样本干燥。将菌圃样本储存于23–25 °C条件下，直至进....
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结果
本文介绍了一种简化的可视化方法，用于观察切叶蚁菌园及废弃物样本中的组分，如菌丝、基质、微生物群落和生物膜。扫描电镜（SEM）技术加深了我们对菌园和废弃物如何支撑微生物群落结构模式的理解。图3）。在切叶菌圃中，菌丝是覆盖基质表面部分区域的树枝状结构。由于菌丝通常对脱水和破裂极为敏感，操作者可依据菌丝的形态来评估样品制备的效果。此现象亦见于先前的研究中32,33,45，菌丝呈管状；完整、管状的菌丝表明样品制备有效（图3A 和 图 4C）。当菌丝呈带状时，这种扁平化可能是该技术造成的人工假象（图4C).
植物基质表面可通过角质层和表皮.......
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讨论
扫描电子显微镜（SEM）利用电子束扫描样品，生成放大的图像，从而以高分辨率观察三维微结构。由于SEM在高真空条件下运行，因此需要从样品中去除99%以上（或高达99%以上）的水分。在SEM真空腔内，部分水合的样品可能发生脱水和塌陷，并导致电子散射。为了实现SEM的高分辨率成像，样品制备应包括去除水分的同时尽可能减少体积和形态变化的步骤，以及进行镀层处理以防止成像过程中产生电荷积累55,56,57。
首先，通过交联样品中的蛋白质和核酸对其进行化学固定，该过程可通过多种技术实现。一种广泛使用的方法是将戊二醛和甲醛（或聚甲醛）加入缓冲液中，例如哌嗪-1,4-二[2-乙磺酸]（PIPES）；N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）；磷酸盐缓冲盐水（PBS）；或二甲胂酸钠。化学固定可增强样品的稳定性，从而在干燥过程中保持其结构。根据样品性质，可能需要进行二次固定.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢圣保罗州研究资助基金会 (FAPESP) 提供的资金支持（项目编号 #2019/03746-0）。MOB 感谢 FAPESP （项目编号 2021/08013-0）和巴西高等教育人员提升协调办公室（CAPES）——资助代码 001 提供的博士奖学金。AR 还感谢国家科学技术发展委员会（CNPq） 提供的研究奖学金（#305269/2018）。作者感谢 Marcia Regina de Moura Aouada 和 Antonio Teruyoshi Yabuki 在样品制备预实验中的帮助，感谢 Renato Barbosa Salaroli 提供的技术支持，以及 Enzo Sorrentino 在摄影拍摄中的协助。本研究在遗传资源获取授权 # SISGen AA39A6D 下开展。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 mL 离心管 | Axygen | MCT-200-C-BRA | 固定并脱水样本 |
| 无水氯化钙 | 默克 | C4901 | CaCl2 无水以配制 Karnovsky’固定剂 |
| 临界点干燥仪 | Leica | EM CPD 300 | 用于临界点干燥 |
| 双面碳导电胶带，12 毫米（宽）× 5 米（长） | 电子显微镜科学公司 | 77819-12 | 用于样品封片 |
| 昆虫镊 | 无特定供应商 | 处理园艺样品 | |
| 乙醇（=ethanol），纯品（≥99.5%) | Sigma-Aldrich | 459836 | 用于脱水 |
| 镊子 | 无特定供应商 | 处理园艺样品 | |
| 玻璃烧杯 | 无特定供应商 | 用于脱水 | |
| 玻璃培养皿 | 无特定供应商 | 处理园艺样品 | |
| 玻璃移液管 | 无特定供应商 | 固定并脱水样本 | |
| 戊二醛（水相电子显微镜级戊二醛，25%） | 电子显微镜科学公司 | 16220 | 制备卡诺夫斯基固定液’固定剂 |
| 金靶 | Ted Pella, Inc. | 8071 | 镀金溅射处理 |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 320331 | 用于调节溶液的pH值 |
| 图像编辑器 | Photoshop | 任何版本 | 调整图像 |
| 多聚甲醛（多聚甲醛20%水溶液，电子显微镜级） | 电子显微镜科学公司 | 15713 | 制备卡诺夫斯基固定液’固定剂 |
| 丙烯容器 | 无特定供应商 | 用于维持活体蚂蚁群落 | |
| 扫描电子显微镜 | JEOL | IT300 SEM | 用于样品成像 |
| 二甲胂酸钠三水合物 | Sigma-Aldrich | C0250 | 用于配制卡考基酸钠缓冲液 |
| 刮勺 | 无特定供应商 | 处理园艺样品 | |
| 直径15毫米、高10毫米的标本容器 | Ted Pella, Inc. | 4591 | 用于临界点干燥 |
| 溅射镀膜仪 | Baltec | SCD 050 | 镀金 |
| 支架（铝制底座，平头针）12.7 mm × 8 mm | 电子显微镜科学公司 | 75520 | 用于样本封片 |
参考文献
- Turner, M. G. Landscape ecology: the effect of pattern on process. Annu Rev Ecol Evol Syst. 20 (1), 171-197 (1989).
- Rietkerk, M., Van de Koppel, J. Regular pattern formation in real ecosystems. Trends Ecol Evol. 23 (3), 169-175 (2008).
- Schmitz, O. J.
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重印与许可
