切叶蚁菌圃的微生物群落：通过扫描电子显微镜可视化微生物景观

摘要

我们提出了一种优化的扫描电子显微镜实验方案，用于观察包含植物和真菌生物量以及微生物群和生物膜的高度异质且脆弱的样品。该方案可用于描述微生物群空间结构的维度特征。

摘要

在宏观生态系统中，例如雨林或珊瑚礁，生物体的空间定位是我们理解群落生态学的基础。同样，在微生物世界中，微尺度生态系统也远非生物与栖息地的随机均质混合。获取微生物的空间分布对于理解微生物群的功能与生态至关重要，因为共存的物种更有可能相互作用并影响彼此的生理状态。

真菌种植蚂蚁群落的核心是一个跨界的微生物生态系统，这些蚂蚁培养担子菌门真菌作为营养来源。切叶蚁采集多种底物（主要为植物来源），由所培养的真菌代谢这些底物并形成一种海绵状结构，即"微生物园"，其功能类似于体外消化系统。该“微生物园”由真菌菌丝交织而成，菌丝通过代谢底物不断生长，从而为具有特征性且已适应的微生物群落创造生态位并使其定殖。目前认为，这些微生物群落在底物降解和真菌生长过程中发挥重要作用，但其空间组织结构仍有待阐明。

本文中，我们描述了如何利用扫描电子显微镜（SEM）以前所未有的细节研究不同培菌系统中培菌蚁的微生物群落及生物膜的空间结构。SEM成像已提供了微生物群落空间结构与组织方式的详细描述。SEM结果显示，微生物群落通常以生物膜形式聚集，这是培菌系统中微生物生态景观中普遍存在的结构。我们展示了用于固定、脱水、干燥、溅射镀膜以及成像这类复杂群落的实验方案。这些方案经过优化，可处理包含植物和真菌生物量以及微生物群落和生物膜的脆弱且异质的样品。

引言

生态系统由特定地理区域（即环境）内通过各种过程相互关联的生物组成。生物随时间与环境相互作用，从而形成复杂且异质的空间格局。空间格局决定生态多样性与稳定性，并最终影响生态系统的功能^1,2,3,4。在湿地、稀树草原、珊瑚礁和干旱生态系统等大尺度生态系统中，空间格局与资源的流动和浓度密切相关。空间异质性和空间格局有助于资源优化，使生态系统比均质系统更具恢复力²。群落生态学以生物的空间定位为基础，这一概念同样适用于微生物世界。

微生物生态系统并非生物体在微生境中随机且均匀混合的集合，而是呈现出定义其大部分功能的空间格局^5,6,7从温诺格拉斯基柱到环境及宿主相关的微生物群落，这些生态系统在空间上呈异质性分布，其空间排布会引发不同的表型响应。共存物种更有可能相互作用并影响彼此的生理状态。因此，群落的空间结构相较于其组成 本身，界定生态系统属性和生态位^5,7,8以这些概念为例，空间分布模式的变化似乎与牙菌斑、龋齿和牙龈疾病的病理进展相关。^9,10炎症性肠病¹¹，囊性纤维化肺部感染，慢性伤口感染^12,13结直肠癌和腺瘤¹⁴.

在微生物生物地理学（研究微生物多样性在时空尺度上的分布格局）的范畴内，理解微生物生态系统的空间分布模式对其认知具有重要意义^{6,13,15,16,17}我们研究了迷人切叶蚁（attine ant）所培育的真菌园这一昆虫构建的微生物生态系统中的空间格局，该生态系统位于其核心膜翅目：蚁科：切叶蚁亚科：收获蚁族：收获蚁亚族）菌落。这里存在着一个以担子菌门（Basidiomycete）真菌为核心的“微生物园”，该真菌属于某族 小脆柄菇亚科（担子菌门：蘑菇科） 或在科内 小菇科 (担子菌门：伞菌目)^{18,19,20,21,22}。菌圃是由菌丝交织形成的海绵状结构，通过代谢蚂蚁采集的以植物为主的基质而生长图 1根据不同的切叶蚁属，这些物质可能包括：干燥的植物部分、昆虫粪便和尸体、 freshly cut leaves、种子以及花部结构^23,24类似于外部的植食性动物消化道，菌圃通过酶解和化学作用将难降解的聚合物转化为易利用的营养物质，为蚂蚁提供必需氨基酸、脂质和可溶性糖^{21,25,26,27,28}.

对切叶蚁属Atta和Acromyrmex的菌圃进行的超微结构、酶学和转录组学分析表明，这些环境构成了一个连续的底物降解梯度和营养斑块^{26,29,30,31,32}。菌圃的较年轻区域通常颜色较深，这是由于新近被切割并掺入的底物尚未完全降解。这些新添加的底物通常从边缘开始被定植，而这些边缘是由工蚁切割并接种了菌丝团的。菌丝从切割边缘向外辐射扩展，覆盖在底物表面^29,32,33。随着底物降解的进行，菌丝丰度逐渐增加，形成白色且代谢活跃的区域^30,31,32。较老的区域底物降解程度更高，并含有丰富的微生物群落^29,32，通常呈现褐色色调且湿度较高。工蚁会移除这些区域的碎片，并将其归入废物堆中，同时也会将有害于真菌共生体的底物运送至此^34,35,36。尽管废物堆在物理上与菌圃分离，但其仍是底物持续降解和养分循环的重要场所，由其中丰富的微生物群落驱动^{29,32,37,38,39}。

主要由微生物群组成的 肠杆菌属，克雷伯氏菌属，泛菌属，假单胞菌属 和 粘质沙雷氏菌，也栖息于菌圃中，似乎被多种刺叶蚁真菌种植系统所共有。这些微生物携带可能补充真菌代谢的代谢通路，因而可能参与菌圃的生理响应过程^{40,41,42,43,44}宏基因组数据不仅表明微生物群的存在^41,42，但对切叶蚁菌圃的扫描电子显微镜（SEM）分析显示，植物基质上主要为杆状细菌³²尽管从整个菌圃中分离出了细菌（包括纤维素降解菌株），但细菌仅在菌圃较老的区域、废物堆以及由创始蚁后携带的初始菌团中被观察到。^29,32也不确定微生物群是否能够形成生物膜 体内 （即在花园和废弃物中），这与其代谢能力相符⁴² 并观察 体外⁴⁴.

本研究采用扫描电子显微镜（SEM）进一步解析菌群在菌圃不同区域的空间分布，详细描述菌群与基质以及菌群与菌丝之间的物理相互作用。SEM 具有较大的焦深，可提供高分辨率的三维微观结构图像，从而实现对菌圃菌群空间格局的深入分析。本文详细阐述了对这类异质性高且脆弱的真菌基质样品进行固定、脱水、干燥、溅射镀膜及成像的步骤。通过省去四氧化锇（OsO₄）的后固定步骤并缩短脱水时间，我们对用于菌圃和废弃物样品 SEM 分析的前处理方案^32,33,45 进行了简化。该优化后的方案能够有效保持菌丝的结构特征以及菌群和生物膜的空间组织结构，亦可应用于其他脆弱的微生物生态系统和生物膜的研究。

图1：切叶蚁的微生物园。该“园”是一种海绵状结构，由菌丝交织形成的网状物构成，通过代谢蚂蚁带入的以植物为主的基质而生长。园中还栖息着微生物群，其编码的代谢通路可能补充真菌的代谢功能。宏基因组数据和先前的扫描电子显微镜分析已表明其存在，但我们对其空间组织结构以及与基质和真菌菌丝之间的物理相互作用了解甚少。我们采用扫描电镜（SEM）揭示微生物群及生物膜的空间组织与分布模式。图中示意图由Mariana Barcoto绘制（微生物园和微生物群改编自Barcoto和Rodrigues⁹⁴），照片由Mariana Barcoto和Enzo Sorrentino拍摄。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 野外蜂群采样

注意：采集蚂蚁种群时，须确保已获得当地法律法规要求的所有许可后方可进行采集。在本研究中，采集许可证号 #74585 由巴西奇科·门德斯生物多样性保护研究所（Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade, ICMBio）签发。若样本来源于实验室种群，请直接进入第 2 节。

1. 找到并标记蚁群位置。在蚁巢周围挖掘一条沟槽，直至暴露菌圃室（图2A）。
   注意：某些切叶蚁物种可能将巢穴建于落叶层下或腐烂的树干内部。在此类情况下，应小心翻动落叶层或谨慎劈开树干以采集样本。有关多种切叶蚁物种的巢穴定位、样本采集及活体蚁群维持的详细信息，请参见 Sosa-Calvo 等人⁴⁶。
2. 从侧面打开菌圃室，以防止土壤掉落至菌圃表面。根据菌圃大小，使用昆虫镊子、勺子或厨房滤网小心采集菌圃样本。
   注意：采集前务必对工具进行灭菌处理。采集切叶蚁菌圃时，应佩戴厚实的织物手套，以防止（或至少减轻）工蚁叮咬。对于其他切叶蚁物种，佩戴织物手套为可选。
3. 将菌圃样本转移至洁净的塑料容器中，容器内需铺有一层石膏以调节菌圃湿度。转移菌圃及工蚁后，将容器密封，防止样本干燥。将菌圃样本储存于23–25 °C条件下，直至进行后续处理。
4. 用先前挖出的土壤将沟槽填回。

图2：样品制备流程图。（A）野外蚁群取样。（B）样品处理。（C）样品制备的基本原理与操作流程：1. 固定：增强并保持样品结构完整性。2. 脱水：用乙醇置换样品中的水分。3. 临界点干燥：以液态CO₂ 置换乙醇并使其蒸发。4. 贴片：将样品固定于载台上以供分析。5. 喷金镀膜：防止样品充电。6. 成像。插图与照片由 Mariana Barcoto 制作。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 试剂

注意：请记住，以下溶液应预先配制。

1. 配制 0.2 M 的二甲胂酸钠缓冲液。将 42.8 g 二甲胂酸钠溶解于 800 mL 蒸馏水中，搅拌至完全溶解，并使 pH 稳定在 7.2（如需要，可用盐酸调节 pH）。用蒸馏水定容至 1 L。4 °C 下保存（约 1 个月）。
   注意：戊二醛和多聚甲醛具有毒性，操作时应在通风橱内进行。接触此类试剂时，务必全程佩戴腈类手套和防护眼镜。
2. 配制 Karnovsky 固定液（改良自 Karnovsky）⁴⁷。取 25 mL 0.2 M 二甲胂酸钠缓冲液，加入 10 mL 25% 戊二醛水溶液和 10 mL 20% 多聚甲醛水溶液，混匀。再加入 1 mL 0.1 M 氯化钙（CaCl₂），用蒸馏水定容至 100 mL。4 °C 下保存（最多 1 个月）。
   注意：Karnovsky 固定液吸入后有害，可能引起皮肤和眼睛刺激。避免吸入蒸气，仅在户外或通风良好的区域使用。操作该溶液时，务必全程佩戴腈类手套和防护眼镜。
3. 使用无水乙醇（分析纯），用蒸馏水配制 30%、50%、70% 和 90% 的乙醇溶液；同时需要 100% 乙醇。

3. 样品固定

注意：固定剂可硬化并保存样本，维持其形态学特征。醛类（如多聚甲醛和戊二醛）属于非凝固性交联型固定剂，可在蛋白质和核酸内部及其之间诱导形成交联结构⁴⁸。

1. 使用昆虫学镊子从花园样本中移除工蚁、卵、蛹和幼虫（图2B）。将不超过5 mm³的花园碎片分离出来，并加入2 mL离心管中（图2C）。
2. 向含有样本的离心管中，用巴斯德玻璃移液管加入约1 mL卡诺夫斯基固定液（确保样本完全被覆盖）。轻轻振荡混合，以促进样本充分浸润，并在4 °C下孵育至少24小时，之后再继续样本处理（图2C.1）。
   注意：若后续脱水步骤无法在固定后立即进行，可在本步骤暂停实验流程，样本可在4 °C下保存约1年。
   建议使用巴斯德玻璃移液管，因其材质惰性，且后续更易于清洗重复使用。花园材料具有高度疏水性，容易漂浮在固定液表面，通常需要长达5分钟才能完全浸入固定液中。请确保固定液体积足以覆盖所有花园碎片，因为液体渗入样本孔隙后体积会减少。我们通过实验观察到，当样本完全浸润变湿后，其组分（特别是脆弱的真菌菌丝体）在进一步混合时易发生破碎。因此，建议尽可能避免剧烈震荡样本。

4. 样品脱水

注意：乙醇洗涤系列通过逐步用乙醇置换样品中的水分。为避免对这类精细样品造成过度损伤或塌陷，必须从低浓度的乙醇溶液开始（见下文）⁴⁹。

1. 使用玻璃移液管完全去除卡诺夫斯基固定液，注意不要破坏样本（图 2C.1）。
   注意：将卡诺夫斯基固定液弃置于正确标记的有毒化学残留物处理容器中。
2. 去除固定液后，立即加入 1 mL 30% 乙醇，注意不要破坏样本，并在室温下孵育 10 分钟（图 2C.2）。
   注意：样本必须始终浸泡在溶液中。在逐步乙醇洗涤过程中，应迅速更换溶液。当样本失去多孔结构并在管底聚集时，1 mL 乙醇通常足以覆盖样本（当样本体积不超过 5 mm³ 时）。但如果样本未被完全覆盖，请添加乙醇直至完全浸没样本。
3. 使用玻璃移液管完全去除 30% 乙醇，注意不要破坏样本。将 30% 乙醇妥善弃置。
   注意：在整个逐步乙醇洗涤过程中，均应将乙醇弃置于正确标记的有毒化学残留物处理容器中。
4. 加入 1 mL 50% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 50% 乙醇，注意不要破坏样本。将 50% 乙醇妥善弃置。
5. 加入 1 mL 70% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 70% 乙醇，注意不要破坏样本。将 70% 乙醇妥善弃置。
   注意：在 70% 乙醇洗涤步骤中，如需暂停操作，可将样本管置于 4 °C 过夜保存，以便材料不立即进行后续处理。
6. 加入 1 mL 90% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 90% 乙醇，注意不要破坏样本。将 90% 乙醇妥善弃置。
7. 加入 1 mL 100% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 100% 乙醇，注意不要破坏样本。将 100% 乙醇妥善弃置。
8. 使用镊子和/或刮刀，小心地将样本转移至临界点干燥仪（CPD）的样品容器中，容器上应贴有预先用纸和铅笔书写的样本标识标签。为防止样本干燥，此转移操作应在盛有 100% 乙醇并加盖的培养皿中进行，将容器置于其中。
9. 盖上容器盖，将其浸入装有足量 100% 乙醇的刻度玻璃烧杯中，乙醇应足以淹没容器。盖上烧杯，在室温下孵育 10 分钟；然后将 100% 乙醇妥善弃置。
10. 将样品容器转移至另一个装有足量 100% 乙醇的刻度玻璃烧杯中，乙醇应足以淹没容器。盖上烧杯，在室温下孵育 10 分钟；然后将样品容器转移至临界点干燥仪。
    注意：完成洗涤步骤后，玻璃移液管和烧杯应使用蒸馏水充分冲洗，冲洗后的残液应弃置于正确标记的有毒化学残留物处理容器中。冲洗后，玻璃器皿可用中性洗涤剂清洗，再用自来水冲洗，并自然晾干。

5. 临界点干燥

注意：临界点干燥仪将样品中的乙醇置换为液态二氧化碳（CO₂），然后在较高温度和压力下使二氧化碳从样品中蒸发。请遵循仪器制造商提供的相关操作说明。

1. 打开设备。
2. 打开腔室，将样品容器放入其中，并加入100%乙醇直至完全浸没容器，然后关闭腔室。
3. 启动冷却 选项，等待温度降至10 °C。
4. 打开CO₂气瓶阀门，并启动搅拌 选项。
5. 启动通入CO₂ 选项，同时持续观察腔室，确认CO₂填充程度。当腔室接近充满时，关闭通入CO₂选项，启动置换 选项，并保持开启状态，直至腔室内仅保留足以覆盖容器的CO₂量。确保容器始终被CO₂覆盖（即在所有CO₂逸出腔室前关闭置换 选项）。重复步骤5.5共6次。
6. 最后一次启动通入CO₂选项，将腔室填充至容器被完全覆盖。
7. 启动加热 选项，关闭搅拌 选项，并关闭CO₂气瓶阀门。
8. 待温度升至35 °C后，启动排气 选项。
   注：当温度升至约30 °C时，腔室内压力达到70–80 bar，达到临界点，此时液相消失。
9. 当腔室压力降至1 bar时，表明所有气体已排出。打开腔室并取出容器。
10. 关闭设备。

6. 封片

1. 准备扫描电镜样品台（即铝制样品 stub；图 2C.4）。
   1. 用一片铝箔包裹样品台，仅覆盖顶部，以便在分析后清洁样品台。
   2. 在样品台底部写上样品编号/代码，以确保能够识别放置在顶部的样品。
   3. 用双面碳导电胶带覆盖样品台的上部表面，并将样品台放入样品 holder 中。
2. 打开样品容器的盖子，使用镊子和刮刀小心地将干燥的样品转移至玻璃培养皿中。
   注意：临界点干燥的类器官容易发生团聚，形成高度致密的样品，应小心将其分离成不超过 1 mm³ 大小的碎片。
3. 小心地将碎片放置在覆盖胶带的样品台粘性表面上。一旦类器官碎片接触到胶带，就很难再移动或重新调整位置，因此需避免将其放置在不需要的位置或方向上。每个样品台最多放置九个碎片。
4. 对每个样品重复步骤 6.2 和 6.3。

7. 金溅射镀膜

注意：需要对样品进行镀膜以防止其带电。请根据设备制造商的说明调整相关参数，例如工作气体压力（本方案中为0.5 × 10^-1 mm Hg）、溅射时间（220 s）、金层厚度（约120 Å）、电流（50 mA）以及电压供应。尽管不同制造商的设备在操作上可能略有差异，但溅射过程通常遵循相似的工作流程。

1. 打开铰接式靶臂，将载物台上的样品台放置到位。
2. 关闭铰接式靶臂，并检查玻璃真空室的飞溅屏蔽是否已正确嵌入。
3. 打开氩气钢瓶阀门，并接通主电源开关。
4. 观察设备显示屏上的真空度上升情况，直至达到显示值 0.5 × 10^-1 mm Hg；然后启动清洗程序。重复此操作 5 次。
5. 启动水循环系统，激活HV On选项，并打开镀金膜盖。确认等离子体颜色呈粉红色。按照本方案，设定溅射时间为 220 秒，电流为 50 mA，可沉积约 120 Å（12 nm）厚的金膜。
6. HV On将自动关闭。关闭水循环系统，并关闭镀金膜盖。
7. 关闭主电源开关，使空气进入真空室。对于花园和废弃物样品，重复步骤 7.1–7.7 共 3 次。
   注意：若样品制备后不能立即进行成像，应将样品台存放在装有硅胶层的密封容器中，以防止样品重新吸水。

8. 成像

注意：请遵循制造商的说明调整扫描电子显微镜（SEM）的设置，例如物镜光阑直径、工作电压、电子束系统的对中、轴向对中以及消像散器。

1. 将样品 stub 放入样品台，并记录每个样品的位置。
   注意：插入或取出样品台时需佩戴手套，并尽可能保持样品台清洁。
2. 从桌面启动操作软件。
3. 选择仪器设置。使用30 µm 的物镜光阑直径（即第二级）对花园样品进行成像，工作模式为高真空，信号检测采用二次电子检测器（SED），加速电压为20 kV，工作距离为15 - 20 mm，探针电流设为40.0（高电流模式），并根据样品情况调节放大倍数。
4. 按照导航提示，点击通风（Vent）图标，等待样品室充气。进度条将显示真空状态。
5. 当达到大气压后，打开样品室，小心插入样品台。
6. 轻轻关闭样品室门，点击抽真空（Evac）图标以对仪器进行抽真空，并通过进度条监控真空状态。导航系统将显示移动载物台的位置，并在移动完成后提供样品台示意图。点击相机（Camera）图标拍摄样品台照片，获得顶部视图，以便在成像过程中在不同样品间导航。
7. 点击观察（Observation）图标以开启电子枪，并等待图像形成。使用手动用户界面（手动控制）手动调节 Z 轴至合适高度（依据样品高度和设定的工作距离）。
   注意：为延长钨灯丝寿命，在不进行主动成像时应暂停观察（Observation）功能。
8. 使用屏幕上显示的选项或手动控制调节扫描速率和图像位置。移动载物台以全面观察样品，利用RDC功能聚焦特定区域。当观察目标结构（或感兴趣结构）时，相应调节放大倍数、聚焦、亮度、对比度和消像散。通过手动用户界面移动载物台在 X 和 Y 方向上的位置来校正像散。
   1. 将放大倍数调节至 100x 至 700x，以观察花园的整体特征（如菌丝密度、基质及定植模式）。
   2. 将放大倍数调节至 700x 至 1,500x，以观察微生物群落的空间分布模式。
   3. 将放大倍数调节至 1,500x 至 3,000x，以观察微生物群落与生物膜之间的物理相互作用。
   4. 将放大倍数调节至 3,000x 至 4,000x，以聚焦特定的微生物聚集体。
9. 保存图像时，使用冻结（Freeze）功能，点击照片（Photo）图标，并设置文件路径。作为标准，应至少分析三个花园片段，对每个片段在第 8.8 步所述的所有放大倍数范围内进行成像。这将获得每个样品至少 12 张图像，但更多图像有助于更详细的描述。建议每个样品采集 15–25 张图像，覆盖第 8.8 步中的全部放大倍数，以获得样品描述所需的精细细节。
   注意：扫描和保存图像需要数秒钟，在此期间应避免对 SEM 浮动台产生任何振动。
10. 完成成像后，点击通风（Vent）选项对样品室进行充气，并通过进度条监控真空状态。小心取出样品台，轻轻关闭样品室门，然后点击抽真空（Evac）以重新抽真空。
11. 抽真空完成后，立即退出操作软件。
12. 使用图像编辑软件调节亮度和对比度，以改善图像可视化效果。

结果

本文介绍了一种简化的方案，用于观察切叶蚁菌园和废弃物样本中的组分，如菌丝、基质、微生物群落以及生物膜。扫描电镜（SEM）技术加深了我们对菌园和废弃物如何构建微生物群落结构模式的理解（图3）。在切叶蚁菌园中，真菌菌丝呈树枝状结构，覆盖部分基质表面。由于真菌菌丝对脱水和破裂极为敏感，用户可依据菌丝的形态来评估样品制备的效果。正如先前研究^32,33,45中所观察到的，菌丝呈管状结构；完整、呈管状的菌丝表明样品制备成功（图3A 和 图4C）。当菌丝呈带状时，这种扁平化形态可能是技术操作过程中产生的假象（图4C）。

植物基质表面可通过角质层和表皮层以及气孔和毛状体来识别。当基质尚未被真菌菌丝和微生物群定植时，这些结构更易于辨认（图3A 和 图4C）。当基质被定植后，微生物群和/或真菌菌丝会覆盖其表面，导致特定的植物结构不易分辨（图3A）。微生物群可能定植于真菌菌丝或基质上，二者呈现出明显不同的空间分布模式。图3 中对这些空间模式进行了示意图说明，并在相应扫描电镜（SEM）图像中用方框标出其位置；这有助于将SEM结果与其解释联系起来。

菌丝定殖微生物群较为少见，一旦发现，通常由杆状或球状细胞组成，这些细胞孤立存在或以小群体形式附着在菌丝表面。在小团块中可观察到包围菌丝的生物膜胞外多糖基质（EPS），呈现类似“蕾丝织物”的结构（图3A）。更为常见的是基质定殖微生物群，可在不同切叶蚁物种的菌圃中发现。定殖模式似乎在一定程度上由基质降解阶段所决定。因此，当微生物群定殖于尚未降解的基质时，可表现为单个细胞或聚集成小群体；而当基质出现显微镜下的降解迹象时（即植物角质层/表皮层及其他植物结构已不可辨认，且沟槽与凹陷大量存在），微生物群可形成覆盖基质的层状结构。

在这些“微生物垫”中，当不存在EPS基质时，细胞的形态更容易辨认。而在微生物细胞被包裹于EPS基质中的情况下，其形态则不易区分。根据其空间结构特征，我们将生物膜表征为“铺展型”或“三维结构型”。当生物膜呈铺展型时，微生物细胞与EPS基质间断性地覆盖在基质表面，形成一层平坦的、厚度为1至3个细胞的薄层（图3B）。当生物膜呈三维结构时，微生物细胞与EPS基质层层堆积，形成具有多个细胞厚度的聚集体。由退化基质（如老园区域和废弃物）构成的园艺区域，其沟槽与凹陷处为微生物群落提供了庇护所，并在此形成较厚的群落结构（图3C）。特别是废弃物样品中高度降解的基质，容纳了极为丰富的微生物群落，其形态多样性在所有区域中最为显著。酵母菌进一步增加了该群落的复杂性，通过生物膜与原核生物发生直接的物理相互作用。在Atta sexdens和Acromyrmex sp. 的废弃物样品中，观察到EPS基质形成明显的纤维状网状结构，包裹着杆状和球状的原核生物以及纺锤形和球形的酵母菌（图3C）。

由于菌丝相互交织形成网状结构，该菌圃具有海绵状构造，需要额外进行溅射镀膜以使样品表面覆盖更加均匀。这些步骤可避免电子散射，从而防止图像失真并提高分辨率（图4A）。样品制备步骤保留了大部分菌圃结构，揭示了微生物群的空间分布与组织方式。然而，有必要再次强调，真菌菌丝和胞外多糖（EPS）基质等结构对脱水极为敏感，极难保存，尤其是在扫描电镜（SEM）观察中。尽管菌丝结构相对保存较好，但仍应合理考虑：在部分菌圃样品中所观察到的生物膜可能缺失EPS基质的某些结构组分。虽然在某些样品中保留了包裹微生物群的最外层光滑多糖结构（图3A、B），但另有一些样品仅保留了微生物的形态特征，却未见EPS基质。然而，目前尚不明确EPS基质是实际缺失，还是在样品制备过程中被去除。

一方面，去除生物膜的光滑层会妨碍对生物膜精确结构的理解；另一方面，该操作能够揭示位于该层下方细胞的形态、空间排列以及物理相互作用，而这正是我们研究的主要关注点。先前的研究报道，使用四氧化锇（OsO₄）蒸气作为主要固定剂，可同时保存真菌菌丝和生物膜基质^{44,50,51,52,53,54}。随后，我们对新鲜的园艺样本进行了使用OsO₄ 蒸气固定的对比实验，结果明显保留了生物膜的光滑外观（图4B）。然而，该方法导致菌丝和微生物群发生严重压扁。这种压扁现象致使先前描述的园艺结构整体空间特征丧失^29,33,32,45，从而限制了对园艺结构模式的进一步研究。使用OsO₄ 固定使得微生物的形态与分布难以分辨，也难以区分细胞结构与技术性假象，进而增加了数据解读的复杂性。

图3：微生物群落的结构模式。 微生物群落在真菌菌丝或基质上定植，呈现不同的空间组织结构。这些空间模式在相应的扫描电镜图像中以示意图形式标出（图中以白色方框圈出）：（A）定植于菌丝的微生物群落由孤立或小团状的细胞组成，部分样品中可检测到生物膜的胞外多糖基质。（B）定植于基质的微生物群落在基质中广泛分布，胞外多糖基质覆盖细胞，导致其形态不易分辨。（C）定植于基质的微生物群落形成三维聚集体，构成单一或多种形态的生物膜，部分情况下可见胞外多糖基质。插图由 Mariana Barcoto 绘制。缩写：EPS = 胞外多糖基质。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：无效成像。低质量图像导致结果无效和/或阻碍对结构模式的解读。（A）电子散射使图像失真，降低其分辨率，从而影响形态学鉴定。该现象在仅喷镀一次的样品中频繁出现，通过额外镀膜可减轻。（B）使用四氧化锇（OsO₄）蒸气作为主要固定剂对新鲜园体样品进行固定^{44,50,51,52,53,54}，表面上保留了生物膜的光滑外观。然而，这导致菌丝和微生物群严重压平，破坏了园体的结构模式。（C）与使用OsO₄的样品制备相比，采用Karnovsky固定液制备的样品获得了更高质量的图像，较好地保留了大部分菌丝结构、微生物群分布以及园体的空间结构模式。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

扫描电子显微镜（SEM）利用电子束扫描样品，生成放大的图像，从而以高分辨率观察三维微结构。由于SEM在高真空条件下运行，因此需要从样品中去除99%以上（或高达99%以上）的水分。在SEM真空腔内，部分水合的样品可能发生脱水和塌陷，并导致电子散射。为了实现SEM的高分辨率成像，样品制备应包括去除水分的同时尽可能减少体积和形态变化的步骤，以及进行镀层处理以防止成像过程中产生电荷积累^55,56,57。

首先，通过交联样品中的蛋白质和核酸对其进行化学固定，该过程可通过多种技术实现。一种广泛使用的方法是将戊二醛和甲醛（或聚甲醛）加入缓冲液中，例如哌嗪-1,4-二[2-乙磺酸]（PIPES）；N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）；磷酸盐缓冲盐水（PBS）；或二甲胂酸钠。化学固定可增强样品的稳定性，从而在干燥过程中保持其结构。根据样品性质，可能需要进行二次固定（使用四氧化锇），甚至三次固定（使用醋酸铀酰）。其次，样品必须脱水。由于空气干燥会导致精细结构严重塌陷，一种常见的替代方法是临界点干燥（CPD）。在临界点干燥过程中，样品不会受到表面张力作用，从而避免产生假象。一方面，水的临界点为228.5 bar和374 °C，这一条件极易破坏样品；另一方面，CO₂ 的临界点为73.8 bar和31 °C，因此适合作为过渡流体。当温度升高时，CO₂转化为气态并从样品中去除^{58,59,60,61,62,63}。第三，非导电样品应进行镀膜处理，以防止样品带电并提高二次电子产率，从而有助于获得清晰的图像信号⁶⁴。

本文所展示的方案结合了保存基于真菌的样本^{32,33,45,65,66,67,68} 以及生物膜^69,70的多种操作步骤，同时通过省略后固定步骤并缩短脱水时间简化了流程。该方法成功保留了菌圃精细的结构，进一步揭示了微生物群落之间的物理相互作用，并展现了生物膜的空间结构。微生物群落的空间组装对于建立相互作用关系及其调控模式均至关重要。空间分布塑造了微生物的社会动态，由此可能涌现出内在特性，这对于应对微生物生态系统中所面临的变异性与复杂性具有重要意义^71,72,73。我们的研究结果强化了菌圃结构模式在整合微生物群落中的作用，支持其可能参与生理响应的假设^32,42,43,44。我们提供了in situ证据，表明生物膜在切叶蚁菌圃栽培系统中的微生物相互作用具有重要作用^42,44。生物膜是复杂且异质性的多细胞体系，其中微生物被包裹于自身分泌的胞外多糖基质（EPS）中，形成社会性网络。通过合作性或拮抗性相互作用，生物膜内部的互动决定了生态位的开启、占据与改造^71,72,73,74。扫描电镜（SEM）使我们能够进一步理解微生物群落在菌圃不同区域的空间组织结构，详细呈现了微生物群落与基质之间以及微生物群落与菌丝之间的物理相互作用，同时简化了该领域未来研究的方法流程。

关于花园微生物群的研究正受到越来越多的关注，特别是聚焦于可能影响这些独特群落组成的过程^75,76，以及它们的功能和相互作用^42,43,44。细菌与真菌在作物上的相互作用可能帮助真菌溶解磷酸盐、产生铁载体，并降解纤维素和几丁质。这类相互作用可能以互利-拮抗的连续体形式存在，从而调控花园的功能⁴⁴。我们在此提出的方法学手段，能够实现对相互作用可能发生的空间结构维度进行原位观察。该方法强调，与其他大多数已被研究的微生物生态系统相似，切叶蚁花园在空间上具有明确的、异质性的组织模式^5,7,8。扫描电镜（SEM）已为多种宿主相关微生物群落中的微生物动态提供了原位空间视角，例如蓝细菌海绵⁷⁷、座头鲸皮肤⁷⁸、蘑菇⁶⁶、刺胞动物⁷⁹、人类肠道⁸⁰、地衣⁸¹，同时也助力于描述“塑料圈”（一种新近由人类活动形成的生态系统）⁸²。然而，这些研究中每一项所采用的样品制备步骤方法均略有不同。

园艺样本极为精细且具有高度异质性，其中真菌菌丝被认为具有防止水分流失的适应性²⁶，此外还包含多种基质²⁴、微生物群及其生物膜。然而，我们所采用的样本制备方案保留了大部分此类结构，使我们能够进一步拓展对微生物群空间结构的表征。我们认为使用Karnovsky固定液是该方案中的关键步骤，因为此类精细样本的三维结构在此阶段可能发生塌陷和/或压平。通常，基于真菌的复杂样本采用戊二醛固定，再用OsO₄进行后固定来制备扫描电镜（SEM）样品^65,66,67,68。然而，已有报道表明，联合使用醛类（多聚甲醛和戊二醛）可改善生物膜在SEM中的保存效果^69,70。用于保存生物膜的方法还可包括在初始Karnovsky固定液中添加0.15%阿尔新蓝（Alcian Blue）或0.15%钌红（Ruthenium Red），以及在1%锇酸（osmium）后固定液中加入1%单宁酸。既往研究中，使用Karnovsky液固定并以OsO₄ 进行后固定的方案虽可在老化的园艺样本和废弃物样本中保留细菌，但未能清晰显示生物膜结构³²。由于我们的样本在未采用以往方案中所使用的锇酸后固定步骤的情况下，仍成功保留了园艺结构、微生物群及生物膜^32,33,69,70，因此我们选择简化方案，省略该步骤。OsO₄ 是一种氧化剂，主要用于固定脂质性细胞组分⁸³。由于其具有强腐蚀性，OsO₄ 接触皮肤或黏膜时可能引起严重灼伤，吸入或摄入后还可能损伤呼吸道或胃肠道^84,85。通过去除OsO₄ 后固定步骤，该方案相应减少了需操作的有毒试剂数量。

我们还建议使用乙醇洗涤系列，而不是丙酮，因为丙酮可能对 delicate 样本过于剧烈⁸⁶。乙醇洗涤系列每步持续10分钟，也简化了以往的扫描电镜（SEM）操作流程⁴⁵ ，且不会影响图像分辨率。此外，我们通过实验验证发现，额外的溅射步骤可获得更高品质的图像，这一现象在我们测试的所有物种的园艺样本中均一致存在。这些额外步骤可能使样本镀层更加均匀，因为仅镀一次的样本中电子散射现象明显更频繁（图4A）。因此，我们鼓励未来研究进一步测试不同的添加剂和条件，以优化适用于园艺样本中生物膜可视化的实验方案。

扫描电镜（SEM）是一种强大的工具，可用于详细观察表面微生物群的细胞形态及胞外聚合物（EPS）的空间排列，能够以高分辨率和高放大倍数揭示样本表面的形貌与纹理特征^70,87然而，该方法无法提供群落成员的分类学区分，因此我们无法明确各微生物的分布位置。此外，尽管扫描电镜具有较大的焦深，却无法揭示样品的三维结构特征。对于包括分类学地理分布和三维空间分辨率在内的切叶蚁微生物园的完整描述，扫描电镜分析可作为园内样本逐步成像技术的初步步骤。为实现分类学上的分辨，扫描电镜可与荧光技术相结合 原位 荧光原位杂交（FISH）^88,89 及其变体，例如高系统发育分辨率荧光原位杂交（HiPR-FISH）⁹⁰组合标记与光谱成像FISH（CLASI-FISH）^9,91和三维投影⁹²三维微结构分析可通过X射线显微断层扫描（X-ray µCT）进一步细化。⁹³到目前为止，扫描电镜（SEM）使我们能够详细观察菌丝周围以及基质表面、沟槽和凹陷处微生物群落的空间分布。这类微生物空间模式的研究正在增进我们对切叶菌圃中潜在微生物相互作用的认识。我们认为，本文所介绍的样品制备步骤可广泛应用于其他精细微生物生态系统中微生物空间结构研究的优化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mL 离心管	Axygen	MCT-200-C-BRA	固定并脱水样本
无水氯化钙	默克	C4901	CaCl2 无水以配制 Karnovsky’固定剂
临界点干燥仪	Leica	EM CPD 300	用于临界点干燥
双面碳导电胶带，12 毫米（宽）× 5 米（长）	电子显微镜科学公司	77819-12	用于样品封片
昆虫镊	无特定供应商		处理园艺样品
乙醇（=ethanol），纯品（≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	用于脱水
镊子	无特定供应商		处理园艺样品
玻璃烧杯	无特定供应商		用于脱水
玻璃培养皿	无特定供应商		处理园艺样品
玻璃移液管	无特定供应商		固定并脱水样本
戊二醛（水相电子显微镜级戊二醛，25%）	电子显微镜科学公司	16220	制备卡诺夫斯基固定液’固定剂
金靶	Ted Pella, Inc.	8071	镀金溅射处理
盐酸	Sigma-Aldrich	320331	用于调节溶液的pH值
图像编辑器	Photoshop	任何版本	调整图像
多聚甲醛（多聚甲醛20%水溶液，电子显微镜级）	电子显微镜科学公司	15713	制备卡诺夫斯基固定液’固定剂
丙烯容器	无特定供应商		用于维持活体蚂蚁群落
扫描电子显微镜	JEOL	IT300 SEM	用于样品成像
二甲胂酸钠三水合物	Sigma-Aldrich	C0250	用于配制卡考基酸钠缓冲液
刮勺	无特定供应商		处理园艺样品
直径15毫米、高10毫米的标本容器	Ted Pella, Inc.	4591	用于临界点干燥
溅射镀膜仪	Baltec	SCD 050	镀金
支架（铝制底座，平头针）12.7 mm × 8 mm	电子显微镜科学公司	75520	用于样本封片