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方法文章

切叶蚁菌圃的微生物群落：通过扫描电子显微镜可视化微生物景观

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DOI：

10.3791/67334

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2024年10月4日

 ,  ,  , 
1Institute of Biosciences, Rio Claro, Department of General and Applied Biology, São Paulo State University (UNESP), 2Plant Pathology and Nematology Department, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, University of São Paulo (USP)

本文内容

摘要

我们提出了一种优化的扫描电子显微镜实验方案，用于观察包含植物和真菌生物量以及微生物群和生物膜的高度异质且脆弱的样品。该方案可用于描述微生物群空间结构的维度特征。

摘要

在宏观生态系统中，例如雨林或珊瑚礁，生物体的空间定位是我们理解群落生态学的基础。同样，在微生物世界中，微尺度生态系统也远非生物与栖息地的随机均质混合。获取微生物的空间分布对于理解微生物群的功能与生态至关重要，因为共存的物种更有可能相互作用并影响彼此的生理状态。

真菌种植蚂蚁群落的核心是一个跨界的微生物生态系统，这些蚂蚁培养担子菌门真菌作为营养来源。切叶蚁采集多种底物（主要为植物来源），由所培养的真菌代谢这些底物并形成一种海绵状结构，即"微生物园"，其功能类似于体外消化系统。该“微生物园”由真菌菌丝交织而成，菌丝通过代谢底物不断生长，从而为具有特征性且已适应的微生物群落创造生态位并使其定殖。目前认为，这些微生物群落在底物降解和真菌生长过程中发挥重要作用，但其空间组织结构仍有待阐明。

本文中，我们描述了如何利用扫描电子显微镜（SEM）以前所未有的细节研究不同培菌系统中培菌蚁的微生物群落及生物膜的空间结构。SEM成像已提供了微生物群落空间结构与组织方式的详细描述。SEM结果显示，微生物群落通常以生物膜形式聚集，这是培菌系统中微生物生态景观中普遍存在的结构。我们展示了用于固定、脱水、干燥、溅射镀膜以及成像这类复杂群落的实验方案。这些方案经过优化，可处理包含植物和真菌生物量以及微生物群落和生物膜的脆弱且异质的样品。

引言

生态系统由特定地理区域（即环境）内通过各种过程相互关联的生物组成。生物随时间与环境相互作用，从而形成复杂且异质的空间格局。空间格局决定生态多样性与稳定性，并最终影响生态系统的功能1,2,3,4。在湿地、稀树草原、珊瑚礁和干旱生态系统等大尺度生态系统中，空间格局与资源的流动和浓度密切相关。空间异质性和空间格局有助于资源优化，使得生态系统比均质系统更具恢复力2。群落生态学中生物的空间定位基础同样适用于微生物世界。

微生物生态系统并非生物体在微生境中随机且均匀混合的状态，而是呈现出定义其大部分功能的空间格局5,6,7从温诺格拉斯基柱到环境及宿主相关微生物群落，这些生态系统在空间上呈异质性分布，其空间排布会引发不同的表型响应。共存物种更有可能相互作用并影响彼此的生理状态。因此，群落的空间结构相较于其组成 本身，界定生态系统属性和生态位5,7,8以这些概念为例，空间分布模式的变化似乎与牙菌斑、龋齿和牙龈疾病的病理进展相关。9,10炎症性肠病11，囊性纤维化肺部感染，慢性伤口感染12,13结直肠癌和腺瘤14.

在微生物生物地理学（研究微生物多样性在时空尺度上的分布格局）的范畴内，理解微生物群落的空间分布模式极大地促进了人们对微生物生态系统的认知。6,13,15,16,17我们研究了迷人切叶蚁（fungus-growing attine ant）所构建的昆虫-微生物生态系统的空间格局，该生态系统位于其核心膜翅目：蚁科：切叶蚁亚科：收获蚁族：收获蚁亚族) 菌落。这里存在着一个以担子菌门真菌为核心的“微生物园”，该真菌属于担子菌科族 白鬼伞亚科（担子菌门：蘑菇科） 或在科内 小塔氏菌科 (担子菌门：伞菌目)18,19,20,21,22。菌圃是由菌丝相互交织形成的海绵状结构，通过代谢蚂蚁采集的以植物为主的基质而生长图 1）。根据不同的切叶蚁属，这些物质可能包括：干燥的植物部分、昆虫粪便和尸体、 freshly cut leaves、种子以及花部结构23,24类似于外部草食性动物的消化道，该菌圃通过酶解和化学作用将难降解的聚合物转化为易利用的营养物质，为蚂蚁提供必需氨基酸、脂质和可溶性糖21,25,26,27,28.

对切叶蚁属Atta和Acromyrmex的菌圃进行的超微结构、酶学和转录组学分析表明，这些环境构成了一个连续的底物降解和营养斑块体系26,29,30,31,32。菌圃的较年轻区域由于新近加入并被破碎的底物而通常颜色较深。这些新添加的底物通常从边缘开始被定植，这些边缘由工蚁切割，并接种了菌丝团块。菌丝从切割边缘向外辐射，在底物表面扩展29,32,33。随着底物降解的进行，菌丝丰度增加，形成白色且代谢活跃的区域30,31,32。较老的区域底物降解程度更高，并含有丰富的微生物群落29,32，通常呈现褐色色调且湿度较高。工蚁会移除这些区域的碎片，将其分离并堆放为废弃物，同时也会将有害于真菌共生体的底物带入其中34,35,36。尽管废弃物堆在物理上与菌圃分离，但仍是大量定居微生物持续进行底物降解和养分循环的重要场所29,32,37,38,39。

主要由微生物群组成的 肠杆菌属，克雷伯氏菌属，泛菌属，假单胞菌属 和 粘质沙雷菌，也栖息于菌圃中，似乎被多种切叶蚁真菌种植系统所共有。这些微生物编码能够补充真菌代谢的代谢通路，可能参与菌圃的生理响应过程40,41,42,43,44。宏基因组数据不仅表明微生物群的存在41,42，但对切叶蚁菌圃的扫描电镜（SEM）分析显示，植物基质上主要为杆状细菌32尽管从整个菌圃中分离出了细菌（包括纤维素降解菌株），但细菌仅在菌圃较老的区域、废物堆以及创始蚁后携带的初始菌团中被观察到。29,32也不确定微生物群是否能够形成生物膜 体内 （即在花园和废弃物中），这与其代谢能力相符42 并观察 体外44.

本研究采用扫描电子显微镜（SEM）进一步解析花园不同区域中微生物群落的空间组织结构，详细描述微生物群落与基质以及微生物群落与菌丝之间的物理相互作用。SEM 提供具有较大焦深的图像，能够以高分辨率观察三维微观结构，从而实现对花园微生物群落空间分布模式的全面分析。本文详细阐述了对这类异质性高且脆弱的真菌基样品进行固定、脱水、干燥、溅射镀膜和成像的步骤。通过省去四氧化锇（OsO4）的后固定步骤并缩短脱水时间，我们对用于花园样品和废弃物样品 SEM 分析的前处理方案32,33,45 进行了简化。该优化后的方案可有效保持菌丝结构特征以及微生物群落和生物膜的空间组织状态，亦可应用于其他脆弱的微生物生态系统和生物膜的研究。

切叶蚁园中的微生物相互作用概念；含生物膜分析的显微图像。
图1：切叶蚁的微生物园。该菌园是一种海绵状结构，由菌丝交织形成的网状物构成，通过代谢蚂蚁带入的以植物为主的底物而生长。园中还栖息着微生物群，其编码的代谢通路可能补充真菌的代谢功能。宏基因组数据和先前的扫描电子显微镜分析已表明其存在，但我们对其空间组织以及与底物和真菌菌丝的物理相互作用了解甚少。我们采用扫描电镜（SEM）揭示微生物群及生物膜的空间组织与分布模式。图示由Mariana Barcoto绘制（菌园和微生物群改编自Barcoto和Rodrigues94），照片由Mariana Barcoto和Enzo Sorrentino拍摄。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

1. 野外蜂群采样

注意：采集蚂蚁种群时，须确保已获得当地法律法规要求的所有许可后方可进行采集。在本研究中，采集许可证编号 #74585 由巴西奇科·门德斯生物多样性保护研究所（Instituto Chico Mendes de Conservação e Biodiversidade, ICMBio）签发。若样本来源于实验室种群，请直接进入第 2 节。

  1. 找到并标记蚁群位置。在蚁巢周围挖掘一条沟槽，直至暴露菌圃室（图2A）。
    注意：某些切叶蚁物种可能将巢穴建于落叶层下或腐烂的树干内部。在此类情况下，应小心翻动落叶层或谨慎劈开树干以采集样本。有关多种切叶蚁物种的巢穴定位、样本采集及活体蚁群维持的详细信息，请参见 Sosa-Calvo 等人46。
  2. 从侧面打开菌圃室，以防止土壤掉落至菌圃表面。根据菌圃大小，使用昆虫镊子、勺子或厨房滤网小心采集菌圃样本。
    注意：采集前务必对工具进行灭菌处理。采集切叶蚁菌圃时，应佩戴厚实的织物手套，以防止（或至少减轻）工蚁叮咬。对于其他切叶蚁物种，佩戴织物手套为可选操作。
  3. 将菌圃样本转移至洁净的塑料容器中，容器内需铺有一层石膏以调节菌圃湿度。转移菌圃及工蚁后，将容器密封，防止样本干燥。将菌圃样本储存于23–25 °C条件下，直至进行后续处理。
  4. 用先前挖出的土壤将沟槽填回。

蚁群挖掘及扫描电镜样品制备示意图：固定、脱水、干燥、成像。
图2：样品制备流程图。（A）野外蚁群取样。（B）样品处理。（C）样品制备的基本原理与操作流程：1. 固定：用于增强并保持样品结构。2. 脱水：用乙醇置换样品中的水分。3. 临界点干燥：用液态CO2置换乙醇并使其蒸发。4. 安装：将样品置于分析位置。5. 溅射镀金：防止样品带电。6. 成像。插图与照片由Mariana Barcoto提供。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 试剂

注意：请记住，以下溶液应预先配制。

  1. 配制 0.2 M 的二甲胂酸钠缓冲液。将 42.8 g 二甲胂酸钠溶解于 800 mL 蒸馏水中，搅拌至完全溶解，并使 pH 稳定在 7.2（如需要，可用盐酸调节 pH）。用蒸馏水定容至 1 L。4 °C 下保存（约 1 个月）。
    注意：戊二醛和多聚甲醛具有毒性，操作时应在通风橱内进行。接触此类试剂时，务必全程佩戴腈类手套和防护眼镜。
  2. 配制 Karnovsky 固定液（参照 Karnovsky 方法改良）47。取 25 mL 0.2 M 二甲胂酸钠缓冲液，加入 10 mL 25% 戊二醛水溶液和 10 mL 20% 多聚甲醛水溶液，混匀。再加入 1 mL 0.1 M 氯化钙（CaCl2），用蒸馏水定容至 100 mL。4 °C 下保存（最多 1 个月）。
    注意：Karnovsky 固定液吸入后有害，可能引起皮肤和眼睛刺激。避免吸入蒸气，仅在户外或通风良好的区域使用。操作该溶液时，务必全程佩戴腈类手套和防护眼镜。
  3. 使用分析纯无水乙醇，用蒸馏水配制 30%、50%、70% 和 90% 的乙醇溶液；同时需要 100% 乙醇。

3. 样品固定

注意：固定剂可硬化并保存样本，维持其形态学特征。醛类（如多聚甲醛和戊二醛）属于非凝固性交联型固定剂，可在蛋白质和核酸内部及其之间诱导形成交联结构48。

  1. 使用昆虫学镊子从花园样本中移除工蚁、卵、蛹和幼虫（图2B）。将不超过5 mm3的花园碎片分离出来，并加入至2 mL离心管中（图2C）。
  2. 向含有样本的离心管中，使用巴斯德玻璃移液管加入约1 mL卡诺夫斯基固定液（确保样本完全被覆盖）。轻轻振荡混合，以促进样本充分浸润，并在4 °C下孵育至少24小时，之后再继续样本处理（图2C.1）。
    注意：若后续脱水步骤无法在固定后立即进行，可在本步骤暂停实验流程，样本可在4 °C下保存约1年。
    建议使用巴斯德玻璃移液管，因其材质惰性，且后续更易于清洗重复使用。花园材料具有高度疏水性，容易漂浮在固定液表面，通常需要长达5分钟才能完全浸入固定液中。请确保固定液体积足以覆盖所有花园碎片，因为液体渗入样本孔隙后体积会减少。我们通过实验观察到，当样本被浸润变湿后，其组分（特别是脆弱的真菌菌丝体）在进一步混合时易发生破碎。因此，我们建议尽可能避免振荡或剧烈晃动样本。

4. 样品脱水

注意：乙醇洗涤系列步骤可逐步将样品中的水替换为乙醇。为避免对这类精细样品造成过度损伤或塌陷，必须从低浓度的乙醇溶液开始（见下文）49。

  1. 使用玻璃移液管完全去除卡诺夫斯基固定液，注意不要破坏样本（图 2C.1）。
    注意：将卡诺夫斯基固定液弃置于正确标记的有毒化学残留物处理容器中。
  2. 去除固定液后，立即加入 1 mL 30% 乙醇，注意不要破坏样本，并在室温下孵育 10 分钟（图 2C.2）。
    注意：样本必须始终浸没在溶液中。在逐步乙醇洗涤过程中，应迅速更换溶液。当样本失去多孔结构并在管底聚集时，1 mL 乙醇通常足以覆盖样本（当样本体积不超过 5 mm3 时）。但如果样本未被完全覆盖，请添加乙醇直至完全浸没。
  3. 使用玻璃移液管完全去除 30% 乙醇，注意不要破坏样本。妥善弃置 30% 乙醇。
    注意：在整个逐步乙醇洗涤过程中，均应将乙醇弃置于正确标记的有毒化学残留物处理容器中。
  4. 加入 1 mL 50% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 50% 乙醇，注意不要破坏样本。妥善弃置 50% 乙醇。
  5. 加入 1 mL 70% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 70% 乙醇，注意不要破坏样本。妥善弃置 70% 乙醇。
    注意：在 70% 乙醇洗涤步骤中，如需暂停操作，可将样本管置于 4 °C 过夜保存，以便材料不立即进行后续处理。
  6. 加入 1 mL 90% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 90% 乙醇，注意不要破坏样本。妥善弃置 90% 乙醇。
  7. 加入 1 mL 100% 乙醇，在室温下孵育 10 分钟。使用玻璃移液管完全去除 100% 乙醇，注意不要破坏样本。妥善弃置 100% 乙醇。
  8. 使用镊子和/或刮刀，小心地将样本转移至临界点干燥仪（CPD）的样品容器中，容器上应贴有预先用纸和铅笔书写的样本标识标签。为防止样本干燥，此转移操作应在盛有 100% 乙醇并加盖的培养皿中进行，将容器置于其中。
  9. 盖上容器盖子，并将其浸入装有足量 100% 乙醇的刻度玻璃烧杯中，乙醇应足以淹没容器。盖上烧杯，在室温下孵育 10 分钟；然后妥善弃置 100% 乙醇。
  10. 将样品容器转移至另一个装有足量 100% 乙醇的刻度玻璃烧杯中，乙醇应足以淹没容器。盖上烧杯，在室温下孵育 10 分钟；然后将样品容器转移至临界点干燥仪中。
    注意：完成洗涤步骤后，玻璃移液管和烧杯应使用蒸馏水充分冲洗，冲洗后的残液应弃置于正确标记的有毒化学残留物处理容器中。冲洗后，玻璃器皿可用中性洗涤剂清洗，再用自来水冲洗，并自然晾干。

5. 临界点干燥

注意：临界点干燥仪将样品中的乙醇置换为液态二氧化碳（CO2），然后在较高温度和压力下使二氧化碳从样品中蒸发。请遵循仪器制造商提供的相关操作说明。

  1. 打开设备。
  2. 打开腔室，将样品容器放入其中，并加入100%乙醇直至完全浸没容器，然后关闭腔室。
  3. 启动冷却 选项，等待温度降至10 °C。
  4. 打开CO2气瓶阀门，并启动搅拌器 选项。
  5. 启动通入CO2 选项，同时持续观察腔室，确认CO2填充程度。当腔室接近充满时，关闭通入CO2选项，启动置换 选项，并保持开启状态，直至腔室内CO2仅足以覆盖样品容器为止。确保容器始终被CO2覆盖（即在所有CO2排出前关闭置换 选项）。重复步骤5.5共6次。
  6. 最后一次启动通入CO2选项，将腔室填充至样品容器被完全覆盖。
  7. 启动加热 选项，关闭搅拌器 选项，并关闭CO2气瓶阀门。
  8. 待温度升至35 °C后，启动排气 选项。
    注意：当温度升至约30 °C时，腔室内压力达到70–80 bar，达到临界点，此时液相消失。
  9. 当腔室压力降至1 bar时，表明所有气体已排尽。打开腔室并取出容器。
  10. 关闭设备。

6. 封片

  1. 准备扫描电镜样品台（即铝制样品台；图 2C.4）。
    1. 用一片铝箔包裹样品台，仅覆盖顶部，以便在分析后清洁样品台。
    2. 在样品台底部写上样品编号/代码，以确保能够识别放置在上方的样品。
    3. 用双面碳导电胶带覆盖样品台的上部表面，并将样品台放入样品 holder 中。
  2. 打开样品容器的盖子，使用镊子和刮刀小心地将干燥的样品转移至玻璃培养皿中。
    注意：临界点干燥的类器官容易聚集，形成高度致密的样品，应小心将其分离成不超过 1 mm3 大小的碎片。
  3. 小心地将碎片放置在覆盖胶带的样品台粘性表面上。一旦类器官碎片接触到胶带，便很难再移动或重新调整位置，因此需避免将其置于不希望的位置。每个样品台最多放置九个碎片。
  4. 对每个样品重复步骤 6.2 和 6.3。

7. 金溅射镀膜

注意：需要对样品进行镀膜以防止其带电。请根据制造商的说明调整相关参数，例如工作气体压力（本方案中为0.5 × 10-1 mm Hg）、溅射时间（220 s）、金层厚度（约120 Å）、电流（50 mA）以及电压供应。尽管不同制造商的设备在操作上可能略有差异，但溅射过程通常遵循相似的工作流程。

  1. 打开铰接的目标臂，将样品台上的载片放置到位。
  2. 关闭铰接的目标臂，并检查玻璃真空室的防溅屏蔽是否正确嵌入。
  3. 打开氩气瓶阀门，并接通主电源开关。
  4. 观察设备显示屏上的真空度上升情况，直至达到显示值 0.5 × 10-1 mm Hg；然后启动Rinsing（清洗）程序。重复此操作5次。
  5. 启动水循环系统，激活HV On（高压开启）选项，并打开镀金膜盖。确认等离子体颜色呈粉红色。按照本方案，设定溅射时间为220秒，电流为50 mA，可沉积约120 Å（12 nm）厚的金膜。
  6. HV On（高压开启）将自动关闭。关闭水循环系统，并盖上镀金膜盖。
  7. 关闭主电源开关，使空气进入真空室。对于园艺和废弃物样品，重复步骤7.1–7.7共3次。
    注意：若样品制备后不能立即进行成像，请将载片存放在充满硅胶层的密闭容器中，以避免样品重新吸水。

8. 成像

注意：请遵循制造商的说明调整扫描电子显微镜（SEM）的设置，例如物镜光阑直径、工作电压、电子束系统的对中、轴向对中以及消像散器。

  1. 将样品 stub 放入样品台，并记录每个样品的位置。
    注意：插入或取出样品台时需佩戴手套，并尽量保持样品台清洁。
  2. 从桌面启动操作软件。
  3. 选择仪器参数设置。使用30 µm 的物镜光阑直径（即第二级）对花园样品进行观察，工作模式为高真空，信号检测采用二次电子探测器（SED），加速电压设为20 kV，工作距离设为15 - 20 mm，探针电流设为40.0（高电流模式），并根据样品情况调节放大倍数。
  4. 按照导航提示，点击Vent图标，等待样品室通气。进度条将显示真空状态。
  5. 当压力达到大气压后，打开样品室，小心插入样品台。
  6. 轻轻关闭样品室门，点击Evac图标开始抽真空，并通过进度条监控真空状态。导航系统将显示移动载物台的位置，并在移动完成后提供样品台示意图。点击Camera图标拍摄样品台照片，获得俯视图，以便在成像过程中在不同样品间导航。
  7. 点击Observation图标以开启电子枪，并等待图像形成。使用手动用户界面（手动控制）手动调节 Z 轴至合适高度（根据样品高度和设定的工作距离）。
    注意：为延长钨灯丝寿命，在不进行主动成像时应暂停Observation功能。
  8. 使用屏幕上显示的选项或手动控制调节扫描速率和图像位置。移动载物台以全面观察样品，利用RDC功能对特定区域进行聚焦。当观察目标结构或感兴趣结构时，相应调节放大倍数、聚焦、亮度、对比度和消像散。通过手动用户界面移动载物台在 X 和 Y 方向上的位置来校正像散。
    1. 将放大倍数调节至 100x 至 700x，以观察花园的整体特征（如菌丝密度、基质及定植模式）。
    2. 将放大倍数调节至 700x 至 1,500x，以观察微生物群落的空间分布模式。
    3. 将放大倍数调节至 1,500x 至 3,000x，以观察微生物群落与生物膜之间的物理相互作用。
    4. 将放大倍数调节至 3,000x 至 4,000x，以聚焦于特定的微生物聚集体。
  9. 保存图像时，使用Freeze功能，点击Photo图标，并设置文件路径。作为标准，应至少分析三个花园片段，对每个片段均在第 8.8 步所述的所有放大倍数范围内进行成像。这将获得每个样品至少 12 张图像，但更多图像有助于更详细的描述。建议每个样品采集 15–25 张图像，覆盖第 8.8 步中的全部放大倍数范围，以获得更精细的样品描述细节。
    注意：扫描和保存图像需要数秒钟，在此期间应避免对 SEM 浮动台产生任何振动。
  10. 完成成像后，点击Vent选项对样品室通气，并通过进度条监控真空状态。小心取出样品台，轻轻关闭样品室门，然后点击Evac对样品室重新抽真空。
  11. 抽真空完成后，立即退出操作软件。
  12. 使用图像编辑软件调节亮度和对比度，以改善图像可视化效果。

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结果

本文介绍了一种简化的可视化方法，用于观察切叶蚁菌园及废弃物样本中的组分，如菌丝、基质、微生物群落和生物膜。扫描电镜（SEM）技术加深了我们对菌园和废弃物如何支撑微生物群落结构模式的理解。图3）。在切叶菌圃中，菌丝是覆盖基质表面部分区域的树枝状结构。由于菌丝通常对脱水和破裂极为敏感，操作者可依据菌丝的形态来评估样品制备的效果。此现象亦见于先前的研究中32,33,45，菌丝呈管状；完整、管状的菌丝表明样品制备有效（图3A 和 图 4C）。当菌丝呈带状时，这种扁平化可能是该技术造成的人工假象（图4C).

植物基质表面可通过角质层和表皮...

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讨论

扫描电子显微镜（SEM）利用电子束扫描样品，生成放大的图像，从而以高分辨率观察三维微结构。由于SEM在高真空条件下运行，因此需要从样品中去除99%以上（或高达99%以上）的水分。在SEM真空腔内，部分水合的样品可能发生脱水和塌陷，并导致电子散射。为了实现SEM的高分辨率成像，样品制备应包括去除水分的同时尽可能减少体积和形态变化的步骤，以及进行镀层处理以防止成像过程中产生电荷积累55,56,57。

首先，通过交联样品中的蛋白质和核酸对其进行化学固定，该过程可通过多种技术实现。一种广泛使用的方法是将戊二醛和甲醛（或聚甲醛）加入缓冲液中，例如哌嗪-1,4-二[2-乙磺酸]（PIPES）；N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）；磷酸盐缓冲盐水（PBS）；或二甲胂酸钠。化学固定可增强样品的稳定性，从而在干燥过程中保持其结构。根据样品性质，可能需要进行二次固定...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢圣保罗州研究资助基金会 (FAPESP) 提供的资金支持（项目编号 #2019/03746-0）。MOB 感谢 FAPESP （项目编号 2021/08013-0）和巴西高等教育人员提升协调办公室（CAPES）——资助代码 001 提供的博士奖学金。AR 还感谢国家科学技术发展委员会（CNPq） 提供的研究奖学金（#305269/2018）。作者感谢 Marcia Regina de Moura Aouada 和 Antonio Teruyoshi Yabuki 在样品制备预实验中的帮助，感谢 Renato Barbosa Salaroli 提供的技术支持，以及 Enzo Sorrentino 在摄影拍摄中的协助。本研究在遗传资源获取授权 # SISGen AA39A6D 下开展。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 mL 离心管AxygenMCT-200-C-BRA固定并脱水样本
无水氯化钙默克C4901CaCl2 无水以配制 Karnovsky’固定剂
临界点干燥仪LeicaEM CPD 300用于临界点干燥
双面碳导电胶带，12 毫米（宽）× 5 米（长）电子显微镜科学公司77819-12用于样品封片
昆虫镊无特定供应商处理园艺样品
乙醇（=ethanol），纯品（≥99.5%)Sigma-Aldrich459836用于脱水
镊子无特定供应商处理园艺样品
玻璃烧杯无特定供应商用于脱水
玻璃培养皿无特定供应商处理园艺样品
玻璃移液管无特定供应商固定并脱水样本
戊二醛（水相电子显微镜级戊二醛，25%）电子显微镜科学公司16220制备卡诺夫斯基固定液’固定剂
金靶 Ted Pella, Inc.8071镀金溅射处理
盐酸Sigma-Aldrich320331用于调节溶液的pH值
图像编辑器Photoshop任何版本调整图像
多聚甲醛（多聚甲醛20%水溶液，电子显微镜级）电子显微镜科学公司15713制备卡诺夫斯基固定液’固定剂
丙烯容器无特定供应商用于维持活体蚂蚁群落
扫描电子显微镜JEOL IT300 SEM用于样品成像 
二甲胂酸钠三水合物Sigma-AldrichC0250用于配制卡考基酸钠缓冲液
刮勺无特定供应商处理园艺样品
直径15毫米、高10毫米的标本容器Ted Pella, Inc.4591用于临界点干燥
溅射镀膜仪Baltec SCD 050镀金
支架（铝制底座，平头针）12.7 mm × 8 mm 电子显微镜科学公司75520用于样本封片

参考文献

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