本文深入描述了一种基于显微计算机断层扫描技术的方法，用于对小鼠颅面骨进行三维模型的分割与测量，相较于现有方法，可更准确地评估小鼠颅面骨的发育情况。
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本文内容
摘要
摘要
为了模拟维生素A缺乏（VAD）引起的颅面畸形，我们在成骨细胞中表达了一种显性负性类视黄醇受体突变，以特异性抑制小鼠中RAR的转录活性。该方法使我们能够研究VAD在临床病例中对颅骨低矿化、下颌畸形和锁骨发育不全的影响。在本研究中，小鼠颅颌面区域的显微计算机断层扫描（microCT）成像成为研究该动物模型生长与发育的有力工具。人工图像评估既耗时又不准确。因此，本文提出了一种简单、高效且准确的方法，用于分割和量化每块颅颌面骨的microCT图像。采用microCT软件对小鼠的下颌骨、额骨、顶骨、鼻骨、前上颌骨、上颌骨、间顶骨和枕骨进行切片，并测量其相应的长度和宽度。该分割方法可应用于发育生物学、生物医学及其他相关科学领域的生长与发育研究，使研究人员能够分析基因突变对各颅颌面骨的个体化影响。
引言
人类颅骨和面部的复杂发育过程涉及一个由众多基因精密调控的三维形态发生机制。这些基因在调控来自不同胚胎来源组织的复杂模式、增殖和分化中发挥关键作用。这一高度协调的过程凸显了人类颅面生长与发育的复杂性。由于发育异常导致的颅面畸形（包括唇裂和腭裂、颅缝早闭以及面部发育不全）占所有先天性出生缺陷的三分之一以上。小鼠作为生物医学研究中常用的一种模式动物，其颅颌面骨结构复杂而精细，在解剖学和生理学上与人类颅颌面骨结构非常相似。近年来，随着小鼠遗传学新技术的发展，尤其是针对畸形研究的技术进步，颅颌面发育生物学的研究已取得长足进展1。
视黄酸（RA）是维生素A的体内代谢产物2。维生素A缺乏症（VAD）与多种严重的多系统疾病相关，例如骨重建障碍、骨折，以及以侏儒症为特征的颅面畸形和骨骼畸形3,4。视黄酸受体（RARs）是视黄酸信号通路中的关键转录因子5。研究人员设计了一种显性负性突变体RARα403（dnRARα）6，并建立了成骨细胞表达dnRARα的转基因小鼠模型。这些小鼠表现出侏儒症、颅面畸形、皮质骨形成不全，以及小梁骨数量增加但重建不良的现象。
微型计算机断层扫描（microCT）在颅颌面畸形研究中具有巨大潜力。该技术能够检测并追踪啮齿类动物模型中先天性和后天性骨骼异常的发生与发展过程。microCT成像分析可深入探究基因修饰小鼠模型中的颅面生长障碍7,8。此外，三维成像已成为界定形态学特征的关键工具，有助于实现定制化的分析与可视化方法9。已有多个研究应用Micro-CT分析颅颌面表型，包括确定人类和小鼠的解剖学标志点，以及对每块颅颌面骨进行体积分析10,11,12。本文详细描述了一种基于microCT技术的方法，用于分离和测量小鼠颅颌面骨的三维模型，从而实现比现有方法更精确的小鼠颅颌面骨骼发育评估与分析。
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方案
我们已遵守所有相关的动物实验和研究伦理规范。所有实验动物操作均经上海交通大学医学院附属第九人民医院机构动物护理与研究咨询委员会批准。
本研究所用的 Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 小鼠品系（R26dn/dn）和 Osterix-Cre（OsxCre）（编号 006361）均维持在 C57BL/6 背景上。R26dn/dn 小鼠与 OsxCre 小鼠杂交，以生成 OSXCre;R26dn/dn 小鼠。所有小鼠均在特定无病原体（SPF）条件下饲养和维持。
1. 小鼠繁殖
注：F 表示小鼠的繁殖代数；N 表示合子小鼠与背景品系小鼠交配的代数。因此，F2+N 代表第二代以及后续所有小鼠繁殖程序。F0 表示原始代小鼠。
- 将一只性成熟的雄性小鼠与两只年龄相近的雌性小鼠配对。在配对后第18天开始，每日检查是否有新生仔鼠。一旦确认雌鼠怀孕，必要时将其单独隔离，以确保最佳的母体护理。若在初次配对后一个月内未观察到任何妊娠情况，可考虑将雄性小鼠轮换至不同的繁殖组合中，以促进受精。
- 交叉 R26dn/dn带有 OSX 的小鼠Cre 小鼠（F0）。剪取尾尖进行基因分型，并保留雄性 OSXCre;R26dn/+将小鼠在笼中饲养至性成熟，约为6周龄（F1）。
- 交叉六周龄雄性 OSXCre;R26dn/+带有雌性 R26 的小鼠dn/dn小鼠（F2）。剪取尾尖进行基因分型，并及时用年轻的繁殖小鼠替换已老化的繁殖小鼠（F2+N）。
2. 准备
- 准备四对4周龄的OsxCre, OSXCre;R26dn/+和OSXCre;R26dn/dn小鼠。通过二氧化碳窒息法对小鼠进行个体安乐死。
注意：为确保安乐死过程有效，CO2流速应调节至每分钟置换笼子体积约30%。例如，对于一个尺寸为45 cm × 30 cm × 30 cm的笼子，建议流速为40 L/min。 - 用手固定小鼠身体，用剪刀剪开颈部，保留颅骨完整。
注意：为获得完整的颅骨，需打开小鼠口腔，使用眼科剪刀沿口角剪开，双手向两侧拉伸并旋转，剥离小鼠头部皮肤。 - 将小鼠颅骨浸入4%多聚甲醛中固定48小时，随后转移至70%乙醇中保存。
警告：多聚甲醛具有毒性，操作时应穿戴适当的防护装备。 - 使用显微CT扫描仪对收集的颅骨进行扫描——分辨率：4.5 µm；电压：70 kV；电流：114 µA；滤膜：0.5 mm Al；旋转步进：0.5°。
- 保存CT扫描图像。选择DICOM格式的图像导入软件进行分析。
3. 显微CT成像与三维重建
注意：本研究中使用的所有骨骼均为手动分割。
- 在 MASKs 页面上单击鼠标右键，选择 New mask；此时会出现一个名为 Green 的新图层。
- 在弹出的 Thresholding 页面中选择 671–2,566 的阈值范围。对所有相关图层重复此操作。（图 1A）。
- 在 Edit 菜单中使用 Eraser 工具，在 2D 矢状面的每一图层上手动擦除附着于下颌骨的骨骼。（图 1B）。
- 单击 Region Growing 选项后，在 2D 矢状面上选择下颌骨区域。（图 1C）。
注意：确保在每一图层中完整选中下颌骨区域；否则，重建后的下颌骨将不完整。 - 在 MASKS 页面中单击新创建的 Mandible 图层，并从下拉菜单中选择 Calculate 3D。（图 1D）。
- 在 3D objects 界面中，右键单击 Mandible 并点击 Properties。点击更改 Color。使用不同颜色对重建出的不同骨骼的 3D 模型进行编码。
- 单击左上角的 Measure，并从弹出的下拉菜单中选择 distance。在 3D 图像中标记点以计算 length（长度）。（图 1E）。
注意：测量骨宽度的参考位置应为骨最宽的部分。 - 在 3D-objects 界面中，右键单击 Mandible 并点击 Properties。进入 Properties-Info-Volume 模块，读取每个颅颌面骨块的重建体积值。（图 1F）。
- 以同样方法测量下颌骨、额骨、顶骨、鼻骨、前上颌骨、上颌骨、间顶骨和枕骨，并使用不同颜色分别标记。
4. 统计分析
- 使用选定的软件进行统计分析。进行双尾 Student's t-检验（n = 4/组）。
- 所有图表中，使用误差线表示标准差。将 P 值 < 0.05 视为具有统计学意义。
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结果
大量研究表明，基因突变对小鼠的生长、发育及器官系统具有多方面的影响。由于单一组织或二维图像分析方法存在局限性，对突变小鼠颅面骨进行综合评估需要采用更为全面的技术手段。因此，阐明颅面骨的发育过程对于研究人类颅面发育异常具有重要意义。
该方法为评估小鼠颅颌面骨的生长和发育提供了有用的工具（图1）。采用上述方法，通过显微CT分析了4周龄 OsxCre, OSXCre;R26dn/+, 和 OSXCre;R26dn/dn 小鼠的颅骨，并进行了颅面骨的三维重建。结果显示，骨骼缺陷与dnRARα表达呈剂量依赖性关系。这些缺陷包括下颌骨、额骨和顶骨长度缩短（图2和
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讨论
MicroCT 是一种强大的工具，可用于从致密且不透明的生物样本中以微米级分辨率获取真实且各向同性的三维信息。MicroCT 获取的数据在几何和强度上均经过校准，因此特别适用于定量研究13,14,15,16,17。该技术被用于研究骨和牙本质的微观结构18,19。近几十年来，研究人员使用阿利新蓝（Alcian Blue）和茜素红（Alizarin Red）对实验动物骨骼进行透明化和染色处理，该方法被认为是研究骨骼发育的金标准。
在研究颅面异常时，仅关注单个组织或二维切片无法全面揭示突变小鼠颅面骨的异常情况。将明确的解剖标志与颅面骨结构的三维显微C...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分得到了中国海南省自然科学基金（824MS152）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GraphPad Prism 6.01 软件 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | / | |
| 显微CT | Quantum GX micro CT, PerkinElmer, Waltham, MA, USA | / | |
| Mimics Medical 19.0 | Materialise, Leuven, Belgium | / | |
| Osterix-Cre (OsxCre) | / | / | 来自杰克逊实验室 |
| Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 品系 | / | / | 来自美国哥伦比亚大学 |
参考文献
- Chai, Y., Maxson, R. E. Jr Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
- Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927(2018).
- Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonneton, C., Porquet, D., Evain-Brion, D. Nuclear retinoic acid receptor characterization in cultured human trophoblast cells: Effect of retinoic acid on epidermal growth factor receptor expression. Mol Cell Endocrinol. 105 (2), 165-173 (1994).
- Hayes, K. C., Cousins, R. J. Vitamin A deficiency and bone growth. I. Altered drift patterns. Calcif Tissue Res. 6 (2), 120-132 (1970).
- Ghyselinck, N. B., Duester, G. Retinoic acid signaling pathways. Development. 146 (13), dev167502(2019).
- Damm, K., Heyman, R. A., Umesono, K., Evans, R. M. Functional inhibition of retinoic acid response by dominant negative retinoic acid receptor mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (7), 2989-2993 (1993).
- Ford-Hutchinson, A. F., Cooper, D. M., Hallgrímsson, B., Jirik, F. R. Imaging skeletal pathology in mutant mice by microcomputed tomography. J Rheumatol. 30 (12), 2659-2665 (2003).
- Brewer, S., Feng, W., Huang, J., Sullivan, S., Williams, T. Wnt1-cre-mediated deletion of ap-2alpha causes multiple neural crest-related defects. Dev Biol. 267 (1), 135-152 (2004).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3d mouse embryo atlas based on micro-ct. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Motch Perrine, S. M., et al. Craniofacial divergence by distinct prenatal growth patterns in fgfr2 mutant mice. BMC Dev Biol. 14, 8(2014).
- Percival, C. J., Huang, Y., Jabs, E. W., Li, R., Richtsmeier, J. T. Embryonic craniofacial bone volume and bone mineral density in fgfr2(+/p253r) and nonmutant mice. Dev Dyn. 243 (4), 541-551 (2014).
- Titiz, I., Laubinger, M., Keller, T., Hertrich, K., Hirschfelder, U. Repeatability and reproducibility of landmarks--a three-dimensional computed tomography study. Eur J Orthod. 34 (3), 276-286 (2012).
- Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43 (2-3), 104-115 (2012).
- Salomé, M., et al. A synchrotron radiation microtomography system for the analysis of trabecular bone samples. Med Phys. 26 (10), 2194-2204 (1999).
- Mizutani, R., et al. Three-dimensional microtomographic imaging of human brain cortex. Brain Res. 1199, 53-61 (2008).
- De Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. J Neurosci Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).
- Zou, W., Hunter, N., Swain, M. V. Application of polychromatic µct for mineral density determination. J Dent Res. 90 (1), 18-30 (2011).
- Neues, F., Epple, M. X-ray microcomputer tomography for the study of biomineralized endo- and exoskeletons of animals. Chem Rev. 108 (11), 4734-4741 (2008).
- Gabner, S., Böck, P., Fink, D., Glösmann, M., Handschuh, S. The visible skeleton 2.0: Phenotyping of cartilage and bone in fixed vertebrate embryos and foetuses based on x-ray microCT. Development. 147 (11), dev187633(2020).
- Ermakova, O., Orsini, T., Gambadoro, A., Chiani, F., Tocchini-Valentini, G. P. Three-dimensional microCT imaging of murine embryonic development from immediate post-implantation to organogenesis: Application for phenotyping analysis of early embryonic lethality in mutant animals. Mamm Genome. 29 (3-4), 245-259 (2018).
- Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-ct. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
- Rajion, Z. A., et al. A three-dimensional computed tomographic analysis of the cervical spine in unoperated infants with cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac J. 43 (5), 513-518 (2006).
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