本文深入描述了一种基于显微计算机断层扫描技术的方法，用于对小鼠颅面骨进行三维模型的分割与测量，相较于现有方法，可更准确地评估小鼠颅面骨的发育情况。
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本文内容
摘要
摘要
为了模拟维生素A缺乏（VAD）引起的颅面畸形，我们在成骨细胞中表达了一种显性负性类视黄醇受体突变，以特异性抑制小鼠中RAR的转录活性。该方法使我们能够研究VAD在临床病例中对颅骨低矿化、下颌畸形和锁骨发育不全的影响。在本研究中，小鼠颅颌面区域的显微计算机断层扫描（microCT）成像成为研究该动物模型生长与发育的有力工具。人工图像评估既耗时又不准确。因此，本文提出了一种简单、高效且准确的方法，用于分割和量化每块颅颌面骨的microCT图像。采用microCT软件对小鼠的下颌骨、额骨、顶骨、鼻骨、前上颌骨、上颌骨、间顶骨和枕骨进行切片，并测量其相应的长度和宽度。该分割方法可应用于发育生物学、生物医学及其他相关科学领域的生长与发育研究，使研究人员能够分析基因突变对各颅颌面骨的个体化影响。
引言
人类颅骨和面部的复杂发育过程涉及一个由众多基因精密调控的三维形态发生机制。这些基因在调控来自不同胚胎来源组织的复杂模式、增殖和分化中发挥关键作用。这一高度协调的过程凸显了人类颅面生长与发育的复杂性。由于发育异常导致的颅面畸形（包括唇裂和腭裂、颅缝早闭以及面部发育不全）占所有先天性出生缺陷的三分之一以上。小鼠作为生物医学研究中常用的一种模式动物，其颅颌面骨结构复杂而精细，在解剖学和生理学上与人类颅颌面骨结构非常相似。近年来，随着小鼠遗传学新技术的发展，尤其是针对畸形研究的技术进步，颅颌面发育生物学的研究已取得长足进展1。
视黄酸（RA）是维生素A的体内代谢产物2。维生素A缺乏症（VAD）与多种严重的多系统疾病相关，例如骨重建障碍、骨折，以及以侏儒症为特征的颅面畸形和骨骼畸形3,4。视黄酸受体（RARs）是视黄酸信号通路中的关键转录因子5。研究人员设计了一种显性负性突变体RARα403（dnRARα）6，并建立了成骨细胞表达dnRARα的转基因小鼠模型。这些小鼠表现出侏儒症、颅面畸形、皮质骨形成不全，以及小梁骨数量增加但重建不良的现象。
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方案
我们已遵守所有相关的动物实验和研究伦理规范。所有实验动物操作均经上海交通大学医学院附属第九人民医院机构动物护理与研究咨询委员会批准。
本研究所用的 Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 小鼠品系（R26dn/dn）和 Osterix-Cre（OsxCre）（编号 006361）均维持在 C57BL/6 背景上。R26dn/dn 小鼠与 OsxCre 小鼠杂交，以生成 OSXCre;R26dn/dn 小鼠。所有小鼠均在特定无病原体（SPF）条件下饲养和维持。
1. 小鼠繁殖
注：F 表示小鼠的繁殖代数；N 表示合子小鼠与背景品系小鼠交配的代数。因此，F2+N 代表第二代以及后续所有小鼠繁殖程序。F0 表示原始代小鼠。
- 将一只性成熟的雄性小鼠与两只年龄相近的雌性小鼠配对。在配对后第18天开始，每日检查是否有新生仔鼠。一旦确认雌鼠怀孕，必要时将其单独隔离，以确保最佳的母体护理。若在初次配对后一个月内未观察到任何妊娠情况，可考虑将雄性小鼠轮换至不同的繁殖组合中，以促进受精。....
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结果
大量研究表明，基因突变对小鼠的生长、发育及器官系统具有多方面的影响。由于单一组织或二维图像分析方法存在局限性，对突变小鼠颅面骨进行综合评估需要采用更为全面的技术手段。因此，阐明颅面骨的发育过程对于研究人类颅面发育异常具有重要意义。
该方法为评估小鼠颅颌面骨的生长和发育提供了有用的工具（图1）。采用上述方法，通过显微CT分析了4周龄 OsxCre, OSXCre;R26dn/+, 和 OSXCre;R26dn/dn 小鼠的颅骨，并进行了颅面骨的三维重建。结果显示，骨骼缺陷与dnRARα表达呈剂量依赖性关系。这些缺陷包括下颌骨、额骨和顶骨长度缩短（图2和
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讨论
MicroCT 是一种强大的工具，可用于从致密且不透明的生物样本中以微米级分辨率获取真实且各向同性的三维信息。MicroCT 获取的数据在几何和强度上均经过校准，因此特别适用于定量研究13,14,15,16,17。该技术被用于研究骨和牙本质的微观结构18,19。近几十年来，研究人员使用阿利新蓝（Alcian Blue）和茜素红（Alizarin Red）对实验动物骨骼进行透明化和染色处理，该方法被认为是研究骨骼发育的金标准。
在研究颅面异常时，仅关注单个组织或二维切片无法全面揭示突变小鼠颅面骨的异常情况。将明确的解剖标志与颅面骨结构的三维显微C.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分得到了中国海南省自然科学基金（824MS152）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GraphPad Prism 6.01 软件 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | / | |
| 显微CT | Quantum GX micro CT, PerkinElmer, Waltham, MA, USA | / | |
| Mimics Medical 19.0 | Materialise, Leuven, Belgium | / | |
| Osterix-Cre (OsxCre) | / | / | 来自杰克逊实验室 |
| Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 品系 | / | / | 来自美国哥伦比亚大学 |
参考文献
- Chai, Y., Maxson, R. E. Jr Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
- Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927(2018).
- Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonne....
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