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方法文章

用于下游应用的禽类排前卵泡颗粒层与膜层细胞的分离

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DOI：

10.3791/67344

⸱

2024年10月25日

 ,  ,  , 
1Department of Animal & Food Sciences, University of Delaware, 2Departments of Animal & Food Sciences, Biological Sciences, Medical & Molecular Sciences, and Microbiology Graduate Program, University of Delaware

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍一种分离禽类排前卵泡中卵黄、颗粒细胞和膜细胞的实验方案。这种精细操作方法有助于深入研究这些结构层在生殖功能中的作用，推动对卵泡发育、激素调控以及疾病机制的理解，从而为提高农业产出和获得生物医学新见解提供支持。

摘要

蛋鸡（产蛋鸡）和肉种鸡（肉用鸡的繁殖种群）作为可靠的蛋白质来源，在全球食物供应中具有重要作用。它们同时也是研究人类生殖系统疾病的新兴动物模型。随着家禽研究领域的不断发展，蛋鸡和肉种鸡卵巢的健康与功能将成为农业和生物医学研究人员的重要研究课题。这一新兴研究兴趣带来的一项挑战，是需要建立可重复的技术方法，使所有研究人员都能在卵巢样本采集过程中加以应用。特别是必须建立详细的可视化操作流程，以明确从鸡卵泡中正确分离特化的颗粒细胞层和膜细胞层的方法，从而实现研究人员之间的一致性与可比性。

本研究描述了从处于最佳繁殖年龄的白来航鸡母鸡中提取前排卵卵泡和卵巢组织的方法。在低温液体条件下进行这些卵泡的分离，以凝固卵黄，便于操作，并防止卵泡自身重量在分离过程中撕裂细胞层。分离完成后，可对所需细胞层进行进一步消化，用于组织培养，或进行冷冻保存，以用于基因组学和蛋白质组学分析。

引言

产蛋鸡是全球食品供应链中的关键组成部分，也是研究生育力和卵巢癌的不断发展的动物模型。鸡在实验室中有着悠久的使用历史，从 在卵内 流感疫苗研究1 癌症肿瘤生长的研究2，是研究性腺发育的重要动物模型3,4,5了解母鸡生殖系统的作用，特别是卵巢卵泡发育的周期性特征及其所涉及的细胞类型，是一个备受关注且具有广泛应用前景的研究领域。通过多组学方法研究母鸡卵巢，不仅可通过生产性能分析提高农业产出，还可利用母鸡作为生殖系统疾病的模型，揭示影响人类健康的潜在因素。

禽类卵巢具有非常明显的发育性卵泡阶段，包括：（1）小型原始卵泡和初级卵泡（>1 mm）；（2）大小不等的前募集卵泡（白色至淡黄色，2–8 mm）；以及（3）大型、充满卵黄的排前卵泡（黄色）（图1）5,6,7。性成熟的禽类卵巢由外层皮质和内层髓质组成，其中皮质容纳卵巢卵泡，髓质则由平滑肌、神经和血管组织构成8。整个卵泡发育周期均发生在皮质中。然而，直到大约五月龄时，仅左侧卵巢才表现出完整的排前（即黄色）卵泡发育等级结构，此时母鸡将经历首次排卵和产蛋（产蛋）。排前卵泡形成肉眼可见的等级结构，通常包含约5至6个卵泡，从最大且即将排卵的F1卵泡，到发育程度较低、体积最小的F5或F6卵泡。由于排前卵泡体积更大、神经支配丰富且含有深黄色卵黄，因此很容易与较小的前募集卵泡区分开来。

所有卵泡均包含多种特化的细胞类型，这些细胞在卵泡发育至排卵前的不同阶段中，分别发挥信号传导、生长和发育的支持作用——这些细胞包括颗粒细胞、卵泡膜细胞以及卵母细胞（雌性配子）（图2A）。其中，颗粒细胞形成卵泡的内壁，而卵泡膜细胞则构成包围卵母细胞的外层结构。随着卵泡在排卵前等级体系中的发育，卵泡膜细胞层和颗粒细胞层开始变薄，尤其在排卵前卵泡柄部正对面的区域尤为明显。该柄部是卵泡与卵巢相连的附着点（图2B）。位于柄部对侧的颗粒细胞层与卵泡膜细胞层交界处称为排卵痕（stigma）（图2C），此处完全缺乏血管结构，是F1卵泡排卵时发生破裂的部位。此外，图中还可观察到生发盘（germinal disc），即围绕卵母细胞周围的一层絮状白色支持细胞（图2B）。

颗粒细胞和膜细胞是卵泡发育的关键组成部分，它们通过复杂的激素信号通路包围并支持卵母细胞。颗粒细胞层通过环磷酸腺苷（cAMP）信号传导促进类固醇生成途径，从而诱导孕酮的产生9,10,11。另一方面，膜细胞在时间上产生雌二醇，这与哺乳动物显著不同——哺乳动物的膜细胞主要产生雄激素和孕酮12,13,14。结合外部信号共同作用，颗粒细胞和膜细胞在卵泡成熟及排卵过程中起着至关重要的驱动作用。分离颗粒细胞层与膜细胞层的技术最初由Gilbert等人于1977年报道15。然而，采用Gilbert方法实现颗粒细胞层与膜细胞层的完全分离，并确保无残留的颗粒细胞物质，可能存在困难。此外，由于缺乏清晰的可视化操作指引，该分离过程可能难以准确完成。本研究旨在描述从近成熟卵泡中提取并分离颗粒细胞层、膜细胞层以及卵母细胞层的方法，提供技术改进，并通过图像和视频形式提供清晰的可视化展示（图3）。对该技术的可视化呈现将有助于研究禽类卵巢卵泡的科研人员可重复地获取颗粒细胞层和膜细胞层，进而应用于农业和生物医学领域的多组学研究。

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方案

本研究中使用的所有动物均按照特拉华大学机构动物照护与使用委员会批准的方案（IACUC 方案 110R）进行饲养和安乐死。

1. 准备

  1. 灭菌
    1. 使用重力置换式高压灭菌法（121 °C，20 分钟）对 5 盎司玻璃碗进行高压灭菌，玻璃碗需用铝箔覆盖，并在铝箔上贴高压灭菌指示胶带，以维持并指示无菌状态。
      注意：每个待分离的卵泡均需使用一个玻璃碗。
    2. 使用重力置换式高压灭菌法（121 °C，20 分钟）对解剖工具进行高压灭菌，包括剪刀、弯头镊子和直头镊子，工具需置于灭菌袋中。
  2. 分离区域的准备
    1. 按照图 4所示设置卵泡分离区域。在开始卵泡分离前，向盛放容器中加入冰块，并在分离过程中根据需要及时补充冰块。
  3. 溶液配制
    1. 将 10 倍浓度的 PBS 稀释为 1 倍工作液，并于解剖前一天放置于 +4 °C 冰箱中备用。
    2. 将异丙醇稀释至 70% 工作液浓度，装入喷雾瓶中。

2. 解剖

  1. 处死一只性成熟的雌性鸟类。
    1. 选择一只性成熟且正在产蛋的雌性鸟类，根据机构动物护理与使用规程，采用批准的方法（如美国兽医协会指南中的颈椎脱位法）实施安乐死16。
    2. 为获取最大的F1卵泡，应在当日光照开始后的前4小时内处死动物。在安乐死前触诊下腹部，确认子宫内存在硬壳蛋；这可确保排卵尚未发生，因此下一次排卵也还未开始。
  2. 暴露卵巢。
    1. 用70%异丙醇喷洒尸体外部及羽毛，以湿润羽毛并清洁切口部位。
    2. 使用解剖剪和戴手套的手，捏起皮肤、肌肉和脂肪层后进行约7.5厘米（3英寸）长的单一横向（横断面）中线切口，避免刺破内脏器官。
    3. 向鸟类右侧横向扩大切口，并用戴手套的手指探查，将内脏器官推开以便剪刀操作。持续操作直至右侧2-3根肋骨被剪断。
    4. 以相同方式向鸟类左侧扩大切口。 操作时需格外小心，因为卵巢的排前卵泡位于此处，突出于卵巢表面，容易破裂。在剪断左侧2-3根肋骨时，应用手指轻柔施压，使排前卵泡远离剪刀。
    5. 一只手置于鸟类下腹部，另一只手牢固地压在胸骨下方，手动将胸部向上牵拉，以进一步暴露体腔。
    6. 双手分别握住鸟类的两腿靠近跗关节处，手动向后推动，同时脱位两侧髋关节。此时即可完全视觉和空间上暴露卵巢。
  3. 摘除排前卵泡。
    1. 所有步骤均通过常规肉眼观察完成。若操作者在任何阶段观察困难，可使用解剖显微镜辅助。
    2. 仅使用戴手套的手指，轻柔地托起每个可见的黄色排前卵泡，并从卵巢上取出。提取过程中仅可捏住卵泡柄部以帮助切断，切勿挤压卵泡本身，以免破裂。
    3. 将每个卵泡放入含有冰冻PBS的无菌容器中。
    4. 将排前卵泡置于冰上至少5分钟，使卵黄凝固。温热的卵黄会黏附于周围的卵泡细胞层，增加后续分离操作的难度。

3. 实验室内的分离

  1. 从无菌容器中取出一个分离的卵泡，并将装有其余卵泡的容器放回冰上。在操作前观察卵泡，注意三个结构的位置： stalk（柄）、stigma（破裂点）和 germinal disc（生发盘）（图2）。
  2. 首先去除卵泡表面的浆膜。将卵泡在干燥的纸巾上轻轻滚动，以去除浆膜层，必要时可轻柔地将其撕下。
  3. 用镊子夹住卵泡的柄部，置于盛有PBS的培养皿上方。利用重力判断柄部在卵泡表面的终止位置，使用剪刀仅剪除柄部，避免刺破卵泡表面。继续去除浆膜，直至其完全不可见。
  4. 使用背光灯照明，并以生发盘作为参考，重新定位对侧的破裂点，轻柔地握住卵泡使破裂点一侧朝上可见。将卵泡保持在盛有冰冻PBS的培养皿正上方。
  5. 拿起手术刀，沿破裂点的长轴方向轻轻切开，一旦卵黄开始流出，立即把卵泡放入PBS中。切勿 用力握紧卵泡，否则会将卵黄挤出，而非让其在重力作用下自然流出。
  6. 使用一对直形无齿组织镊，从切口一侧轻柔地将卵泡壁的粉红色层从卵黄上剥离。通过轻微的夹捏和牵拉动作，将卵泡壁逐步从卵黄上提起并分离。
  7. 当每次将约5 mm的卵泡壁组织从卵黄上拉开时，层间分离效果最佳。当成功将一段5 mm的卵泡壁从卵黄上分离后，使用弯头镊与直镊配合，沿卵泡壳进行探查。
  8. 在某些情况下，颗粒细胞层可能比膜细胞层更紧密地附着于卵黄。此时，只需用任一镊子极其轻柔地在卵黄表面滑动，尝试将纸样薄层从卵黄上剥离。一旦定位到颗粒细胞层，即用镊子将其牢固夹住并与膜细胞层固定，然后如前所述，将两层一同从卵黄上逐步拉离。
  9. 使用弯头镊轻轻将卵黄从夹持的组织层上刷离。清除或移除培养皿中多余的卵黄。切勿刮擦颗粒细胞层，以免造成撕裂。剧烈操作会使PBS溶液浑浊，影响观察。请以谨慎而有目的的动作继续操作。
  10. 每当完成一段5–10 mm的卵泡壁回缩后，暂停操作，用两把镊子分别夹住膜细胞层和颗粒细胞层，确保两层正被逐渐彼此分离，同时也在从卵黄上共同剥离。围绕卵泡外周继续此过程。若因颗粒-膜细胞层瓣过大导致操作困难，可翻转卵泡，从切口的另一侧重新开始操作。
  11. 在分离过程中，会遇到生发盘（雌性配子及生发泡）。该区域与颗粒细胞层和卵黄均高度黏附。应小心接近生发盘，用直镊牢固夹住颗粒细胞层与膜细胞层，同时用弯头镊做轻柔刷动，将生发盘从颗粒细胞上推离至卵黄表面。
    1. 若需将生发盘作为研究样本，此时可用弯头镊将其从卵黄上轻轻刷下，并按需保存。
  12. 继续使用弯头镊将卵黄从卵泡壁上分离，直至整个卵泡球体的卵黄被完全去除。
  13. 当剩余卵黄被完全刷除后，将最后一部分颗粒细胞层与膜细胞层彼此分离。完全分离的颗粒细胞层可能仍含有少量卵黄物质，但应确保其未被卵黄覆盖。将颗粒细胞层和膜细胞层分别放入盛有4 °C PBS的独立容器中。
    1. 当颗粒细胞层已与膜细胞层分开放置后，用镊子在PBS中轻轻来回搅动膜细胞层，以确保任何残留的颗粒细胞层成分完全脱落。
      注：根据后续研究需求，某些分离后的处理方法（如消化或离心）可进一步去除脂质碎片。
    2. 初次练习该技术时，应制备并进行代表性分离样本的组织学分析，以确认各层分离与收集的准确性。
      1. 具体操作：使用网状组织包埋盒或海绵将分离的组织固定于中性缓冲福尔马林中，防止样本丢失，随后进行石蜡包埋、切片，并用苏木精-伊红（H&E）染色。
      2. 由于颗粒细胞层结构脆弱，应小心操作，将其置于活检海绵上并放入组织包埋盒中，以保持细胞层完整。
      3. 将膜细胞层直接放入组织包埋盒中。此举也有助于观察样本是否被其他卵泡组织污染（例如颗粒细胞样本中残留卵黄蛋白，或膜细胞样本中混入颗粒细胞）。
        注：由于卵泡各组织间紧密相邻，有时难以获得完全纯净的单一层。然而，了解可能的污染程度有助于后续多组学分析结果的解读。

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结果

本方案可实现从卵巢卵泡中分离颗粒细胞层和膜细胞层（图5 和 图6）。分离后的组织层可进一步制备用于组织学检查，以确认分离效果。这些组织学图像由经认证的兽医病理学家（EMB）审核并采集，清晰地展示了F1和F5期排卵前卵泡的颗粒细胞层与膜细胞层的有效分离（图7）。值得注意的是，颗粒细胞层呈现出复杂的褶皱结构，这是由于其在从相邻的膜组织中提取和分离后结构较为脆弱所致。颗粒细胞可通过其柱状至假复层柱状的形态特征进行识别，细胞间紧密排列，细胞膜边界清晰（图7A、B）。

卵泡膜细胞层的特征是梭形细胞，具有小而致密的细胞核，可能包含大的黄体细胞（增大的多边形细胞，胞质丰富，呈透明至泡沫状，提示活跃的类固醇激素合成）。在卵泡膜层中常见血细胞（鸟类物种中的有核卵圆形细胞）以及小口径血管，这些均属正常现象。在取材的卵泡膜层样本中，通...

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讨论

本研究概述了从家禽排卵前卵泡中分离颗粒细胞层和膜细胞层的详细步骤。与Gilbert等人于1977年建立的现有方法不同，本方法的改进之处在于，能够在手动分离所有排卵前卵泡的颗粒细胞层与膜层时提供更可控的操作环境15。此外，该方法使研究人员能够在整个操作过程中持续观察颗粒细胞层，从而提高操作的精确性和分析能力。该技术可轻松适用于其他家禽物种的颗粒细胞层或膜层的分离，也可能用于其他卵生动物（产卵动物）17,18。本方法为研究人员提供了分离和研究不同卵泡细胞层的机会，对这些细胞层的深入探究将有助于深入了解包括家禽农业养殖、鸟类繁殖以及人类生育力和生殖疾病潜在模型等多个研究领域19。

在执行本方案时，需考虑若干关键步骤。首先是将卵泡冷却至约 4 °C，以在沿排卵痕切割前使卵黄凝固。这一步骤需立即将卵泡浸入冰冻的 PBS 中，并在从鸡体内取出后持续维持低温环境。卵泡在冰冻 PBS 中...

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披露

作者无任何竞争利益需要申报。

致谢

感谢Milos Markis（AviServe）在动物饲养方面的协助，感谢Nicole Guarino（特拉华大学）在稿件准备方面的协助，感谢Evelyn Weaver和Ramesh Ramachandran（宾夕法尼亚州立大学）在实验操作示范和稿件准备方面的协助。图2A 和 图3 使用BioRender.com绘制，该平台由特拉华大学研究办公室资助的机构许可证支持。本工作得到特拉华大学农业与自然资源学院比较病理学实验室（UD CANR Comparative Pathology Laboratory）的支持。KME获得美国农业部国家食品与农业研究所（USDA NIFA）资助项目2023-67011-40333的支持。本研究还获得了特拉华大学研究基金会（UDRF）以及特拉华州INBRE项目（由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所NIGMS P20 GM103446项目资助及特拉华州政府支持）向AD提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3.5 英寸小玻璃碗，5 盎司AmazonB0BXP5PJTN直径至少为 3.5 英寸的可高压灭菌玻璃碗
铝箔Costco720用于覆盖高压灭菌碗
Amazon 宠物训练垫，常规尺寸，100 片装AmazonB0B58WTPFS可用作尸体解剖垫，任何吸水垫均可
高压灭菌指示胶带Fisherbrand15-901-111
Cole-Parmer LED 光纤照明光源Cole-ParmerEW-41723-02
弯曲超细精密尖头镊子Fisherbrand16-100-123无齿
解剖显微镜Leica S6E
精细精密剪刀Fisherbrand12-000-155无齿
带盖食品储存盒，17 件套，透明/绿色，适用于微波炉、冷冻和洗碗机AmazonB09QGZCRDB可使用任何能够容纳冰块和 3.5 英寸小玻璃碗的容器
高精度 45 度弯曲渐细超细尖镊子/镊钳Fisherbrand12-000-125无齿
高精度直型超细尖镊子/镊钳Fisherbrand16-100-120无齿
异丙醇 FisherbrandA426P-4
McKesson 标本容器，无菌，螺旋盖，防漏，120 mLMcKesson16-95264 盎司 / 120 立方厘米，带刻度
磷酸盐缓冲液 (PBS, 10x)，pH 7.6ThermoFisherJ62692.K7需稀释为 1x PBS
喷雾瓶Cole-ParmerEW-06091-01用于盛装 70% 异丙醇
无菌外科刀片 #22Cincinnati Surgical122
灭菌袋，10" x 16"AmazonB07MFB455C
渐细超细尖镊子 Fisherbrand Fisherbrand16-100-121无齿
泡沫活检垫，矩形Fisherbrand22-038-221
福尔马林溶液，10%（组织学用）Fisher ChemicalSF98-4
组织处理/包埋盒（带盖）Simport M490-2Z672122

参考文献

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