用于下游应用的禽类排前卵泡颗粒层与膜层细胞的分离

摘要

本文介绍一种分离禽类排前卵泡中卵黄、颗粒细胞和膜细胞的实验方案。这种精细操作方法有助于深入研究这些结构层在生殖功能中的作用，推动对卵泡发育、激素调控以及疾病机制的理解，从而为提高农业产出和获得生物医学新见解提供支持。

摘要

蛋鸡（产蛋鸡）和肉种鸡（肉用鸡的繁殖种群）作为可靠的蛋白质来源，在全球食物供应中具有重要作用。它们同时也是研究人类生殖系统疾病的新兴动物模型。随着家禽研究领域的不断发展，蛋鸡和肉种鸡卵巢的健康与功能将成为农业和生物医学研究人员的重要研究课题。这一新兴研究兴趣带来的一项挑战，是需要建立可重复的技术方法，使所有研究人员都能在卵巢样本采集过程中加以应用。特别是必须建立详细的可视化操作流程，以明确从鸡卵泡中正确分离特化的颗粒细胞层和膜细胞层的方法，从而实现研究人员之间的一致性与可比性。

本研究描述了从处于最佳繁殖年龄的白来航鸡母鸡中提取前排卵卵泡和卵巢组织的方法。在低温液体条件下进行这些卵泡的分离，以凝固卵黄，便于操作，并防止卵泡自身重量在分离过程中撕裂细胞层。分离完成后，可对所需细胞层进行进一步消化，用于组织培养，或进行冷冻保存，以用于基因组学和蛋白质组学分析。

引言

产蛋鸡是全球食品供应链中的关键组成部分，也是研究生育力和卵巢癌的不断发展的动物模型。鸡在实验室中有着悠久的使用历史，从 在卵内 流感疫苗研究¹ 癌症肿瘤生长的研究²，是研究性腺发育的重要动物模型^3,4,5了解母鸡生殖系统的作用，特别是卵巢卵泡发育的周期性特征及其所涉及的细胞类型，是一个备受关注且具有广泛应用前景的研究领域。通过多组学方法研究母鸡卵巢，不仅可通过生产性能分析提高农业产出，还可利用母鸡作为生殖系统疾病的模型，揭示影响人类健康的潜在因素。

禽类卵巢具有非常明显的发育性卵泡阶段，包括：（1）小型原始卵泡和初级卵泡（>1 mm）；（2）大小不等的前募集卵泡（白色至淡黄色，2–8 mm）；以及（3）大型、充满卵黄的排前卵泡（黄色）（图1）^5,6,7。性成熟的禽类卵巢由外层皮质和内层髓质组成，其中皮质容纳卵巢卵泡，髓质则由平滑....

方案

本研究中使用的所有动物均按照特拉华大学机构动物照护与使用委员会批准的方案（IACUC 方案 110R）进行饲养和安乐死。

1. 准备

1. 灭菌
   1. 使用重力置换式高压灭菌法（121 °C，20 分钟）对 5 盎司玻璃碗进行高压灭菌，玻璃碗需用铝箔覆盖，并在铝箔上贴高压灭菌指示胶带，以维持并指示无菌状态。
      注意：每个待分离的卵泡均需使用一个玻璃碗。
   2. 使用重力置换式高压灭菌法（121 °C，20 分钟）对解剖工具进行高压灭菌，包括剪刀、弯头镊子和直头镊子，工具需置于灭菌袋中。
2. 分离区域的准备
   1. 按照图 4所示设置卵泡分离区域。在开始卵泡分离前，向盛放容器中加入冰块，并在分离过程中根据需要及时补充冰块。
3. 溶液配制
   1. 将 10 倍浓度的 PBS 稀释为 1 倍工作液，并于解剖前一天放置于 +4 °C 冰箱中备用。
   2. 将异丙醇稀释至 70% 工作液浓度，装入喷雾瓶中。

2. 解剖

1. 处死一只性成熟的雌性鸟类。....

结果

本方案可实现从卵巢卵泡中分离颗粒细胞层和膜细胞层（图5 和 图6）。分离后的组织层可进一步制备用于组织学检查，以确认分离效果。这些组织学图像由经认证的兽医病理学家（EMB）审核并采集，清晰地展示了F1和F5期排卵前卵泡的颗粒细胞层与膜细胞层的有效分离（图7）。值得注意的是，颗粒细胞层呈现出复杂的褶皱结构，这是由于其在从相邻的膜组织中提取和分离后结构较为脆弱所致。颗粒细胞可通过其柱状至假复层柱状的形态特征进行识别，细胞间紧密排列，细胞膜边界清晰（图7A、B）。

卵泡膜细胞层的特征是梭形细胞，具有小而致密的细胞核，可能包含大的黄体细胞（增大的多边形细胞，胞质丰富，呈透明至泡沫状，提示活跃的类固醇激素合成）。在卵泡膜层中常见血细胞（鸟类物种中的有核卵圆形细胞）以及小口径血管，这些均属正常现象。在取材的卵泡膜层样本中，通.......

讨论

本研究概述了从家禽排卵前卵泡中分离颗粒细胞层和膜细胞层的详细步骤。与Gilbert等人于1977年建立的现有方法不同，本方法的改进之处在于，能够在手动分离所有排卵前卵泡的颗粒细胞层与膜层时提供更可控的操作环境¹⁵。此外，该方法使研究人员能够在整个操作过程中持续观察颗粒细胞层，从而提高操作的精确性和分析能力。该技术可轻松适用于其他家禽物种的颗粒细胞层或膜层的分离，也可能用于其他卵生动物（产卵动物）^17,18。本方法为研究人员提供了分离和研究不同卵泡细胞层的机会，对这些细胞层的深入探究将有助于深入了解包括家禽农业养殖、鸟类繁殖以及人类生育力和生殖疾病潜在模型等多个研究领域¹⁹。

在执行本方案时，需考虑若干关键步骤。首先是将卵泡冷却至约 4 °C，以在沿排卵痕切割前使卵黄凝固。这一步骤需立即将卵泡浸入冰冻的 PBS 中，并在从鸡体内取出后持续维持低温环境。卵泡在冰冻 PBS 中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3.5 英寸小玻璃碗，5 盎司	Amazon	B0BXP5PJTN	直径至少为 3.5 英寸的可高压灭菌玻璃碗
铝箔	Costco	720	用于覆盖高压灭菌碗
Amazon 宠物训练垫，常规尺寸，100 片装	Amazon	B0B58WTPFS	可用作尸体解剖垫，任何吸水垫均可
高压灭菌指示胶带	Fisherbrand	15-901-111
Cole-Parmer LED 光纤照明光源	Cole-Parmer	EW-41723-02
弯曲超细精密尖头镊子	Fisherbrand	16-100-123	无齿
解剖显微镜	Leica	S6E
精细精密剪刀	Fisherbrand	12-000-155	无齿
带盖食品储存盒，17 件套，透明/绿色，适用于微波炉、冷冻和洗碗机	Amazon	B09QGZCRDB	可使用任何能够容纳冰块和 3.5 英寸小玻璃碗的容器
高精度 45 度弯曲渐细超细尖镊子/镊钳	Fisherbrand	12-000-125	无齿
高精度直型超细尖镊子/镊钳	Fisherbrand	16-100-120	无齿
异丙醇	Fisherbrand	A426P-4
McKesson 标本容器，无菌，螺旋盖，防漏，120 mL	McKesson	16-9526	4 盎司 / 120 立方厘米，带刻度
磷酸盐缓冲液 (PBS, 10x)，pH 7.6	ThermoFisher	J62692.K7	需稀释为 1x PBS
喷雾瓶	Cole-Parmer	EW-06091-01	用于盛装 70% 异丙醇
无菌外科刀片 #22	Cincinnati Surgical	122
灭菌袋，10" x 16"	Amazon	B07MFB455C
渐细超细尖镊子 Fisherbrand	Fisherbrand	16-100-121	无齿
泡沫活检垫，矩形	Fisherbrand	22-038-221
福尔马林溶液，10%（组织学用）	Fisher Chemical	SF98-4
组织处理/包埋盒（带盖）	Simport M490-2	Z672122