分离禽排卵前卵泡颗粒和卵泡膜细胞层用于下游应用

产蛋鸡是世界食品供应链的关键组成部分，是研究生育能力和卵巢癌的不断发展的动物模型。鸡在实验室使用的历史悠久，从流感疫苗的卵子研究¹ 到癌性肿瘤生长的研究²，是了解性腺发育的关键动物 ^3,4,5。了解母鸡生殖系统的作用，特别是卵巢卵泡发育的周期性以及所涉及的细胞类型，是一个非常有趣和潜在应用的领域。询问母鸡卵巢的多组学方法可用于通过生产力分析提高农业产量，并通过将母鸡作为生殖疾病的模型来阐明对人类健康的因素。

禽卵巢具有非常明显的发育卵泡阶段，包括 （1） 小的原始和初级卵泡 （>1 mm），（2） 大小不一的募集前卵泡（白色至淡黄色，2-8 mm），以及 （3） 大的、充满卵黄的排卵前卵泡（黄色）（图 1）^5,6,7。性成熟的禽卵巢由容纳卵巢卵泡的外皮层和由平滑肌、神经和脉管系统组成的内髓质组成⁸。卵泡发育的整个周期发生在皮层中。然而，直到大约 5 个月大时，只有左侧卵巢表现出排卵前（即黄色）卵泡的完整发育层次结构，鸡将经历她的第一次排卵和产卵（产卵）。排卵前卵泡建立了一个肉眼可见的层次结构，大约有 5 到 6 个卵泡，范围从最大且仅次于排卵的卵泡 - F1 卵泡 - 到发育较差、最小的卵泡 - F5 或 F6。排卵前卵泡很容易与较小的募集前卵泡区分开来，因为它们的体积较大、神经支配大且卵黄呈深黄色。

所有卵泡都包含专门的细胞类型，这些细胞类型在卵泡经历排卵前的不同阶段时支持卵泡的信号传导、生长和发育中的不同作用 - 这些是颗粒细胞、卵泡膜细胞和卵母细胞（雌配子）（图 2A）。特别是，颗粒细胞层形成卵泡的内壁，而卵泡膜细胞形成围绕卵母细胞的另一壁。随着卵泡通过排卵前层次结构，卵泡膜和颗粒细胞层开始变薄，特别是沿着排卵前卵泡茎正对面的一点。茎是卵泡与卵巢的附着点（图 2B）。与茎相对的颗粒和膜层的这条线称为柱头（图 2C）。它完全没有脉管系统，将成为 F1 卵泡排卵期间卵泡破裂的点。还可以看到生发盘，或围绕卵母细胞的蓬松白色支持细胞层（图 2B）。

颗粒细胞和卵泡膜细胞都是卵泡发育的关键组成部分，因为它们通过复杂的激素信号传导包围和支持卵母细胞。颗粒细胞层通过环状 AMP （cAMP） 信号转导支持类固醇生成途径，从而产生孕激素 ^9,10,11。另一方面，膜细胞暂时产生雌二醇，这与乳腺膜细胞产生雄激素和孕激素的哺乳动物有很大不同 12,13,14。颗粒细胞和卵泡膜细胞与外部信号传导一起，是卵泡成熟和产卵的关键驱动因素。分离颗粒层和膜层的技术最初由 Gilbert 等人于 1977 年报道¹⁵。实现颗粒层和膜层的全面分离并确保没有颗粒材料残留，这可能是 Gilbert 方法的困难所在。此外，缺乏完成分离的清晰视觉指南会使任务难以执行。本研究旨在描述从排卵前卵泡中提取和分离颗粒、卵泡膜和卵母细胞层，通过使用图像和视频提供适应并提供清晰的视觉表示（图 3）。可视化这项技术将使研究禽卵巢卵泡的科学家能够可重复地捕获颗粒和膜层，用于农业和生物医学多组学方法。

本研究中使用的所有动物均按照特拉华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC 协议 110R）批准的方案进行维护和安乐死。

1. 准备工作

1. 灭菌
   1. 使用重力置换高压灭菌（121°C，20分钟）高压灭菌5盎司玻璃碗，用铝箔覆盖，顶部有高压灭菌胶带以保持和指示无菌。
      注意:进行分离的每个卵泡需要一个碗。
   2. 使用重力置换高压灭菌（121°C，20分钟）的高压灭菌器解剖工具，包括灭菌袋中的剪刀、弯曲的镊子和直镊子。
2. 设置隔离区
   1. 设置卵泡分离区域， 如图 4 所示。在卵泡分离之前用冰填充容器，并在整个卵泡分离过程中根据需要补充。
3. 解决 方案
   1. 稀释至 10x PBS 浓度至 1x 工作原液，并在解剖前一天置于 +4 °C 冰箱中。
   2. 在喷雾瓶中将异丙醇稀释至 70% 工作储备液浓度。

2. 解剖

1. 对性成熟的雌鸟实施安乐死。
   1. 选择一只性成熟的雌鸟（目前必须正在产卵），并根据机构护理和使用方案（如颈椎脱位）通过批准的方法（AVMA 指南）对¹⁶ 只实施安乐死。
   2. 为了捕获最大的 F1 卵泡，在当天光照开始的前 4 小时内对动物实施安乐死。安乐死前触诊下腹部，确认子宫内有硬壳蛋;这确保了产卵，因此，下一次排卵还没有发生。
2. 进入卵巢。
   1. 用 70% 异丙醇喷洒外部胴体和羽毛。这会弄湿羽毛并清洁切口点。
   2. 使用解剖剪刀和戴手套的手，捏住并剪下一个约 7.5 厘米（3 英寸）长的水平（横向）中线切口。切开前捏住皮肤、肌肉和脂肪层，以避免穿刺器官。
   3. 在鸟的右侧横向扩大切口，用戴手套的手指探查，将内脏器官推出剪刀。继续直到动物右侧的 2-3 根肋骨被切开。
   4. 像在右侧所做的那样，向鸟的左侧加宽切口。要格外小心，因为卵巢的排卵前卵泡位于此处，从卵巢表面突出，很容易破裂。用手指轻轻按压，使排卵前卵泡远离剪刀，因为在鸟的左侧剪下 2-3 根肋骨。
   5. 将一只手放在鸟的下腹部，另一只手牢牢地放在胸骨的下侧，然后手动向上缩回鸟的乳房，以便进一步进入鸟的腔腔。
   6. 将鸟的每条大腿靠近跗关节，手动将它们向后推，以同时使两个髋关节脱臼。现在可以在视觉和空间上完全进入卵巢。
3. 去除排卵前卵泡。
   1. 通过常规目视执行所有步骤。如果一个人在任何阶段都难以可视化，请使用解剖显微镜。
   2. 仅使用戴手套的手指，轻轻地杯住每个可见的黄色排卵前卵泡，然后将其从卵巢中取出。在提取过程中只捏住茎，以帮助切断茎。不要捏卵泡本身，否则它可能会破裂。
   3. 将每个卵泡放入装有冰冷 PBS 的无菌容器中。
   4. 将排卵前卵泡放在冰上至少 5 分钟，以使卵黄凝结。温暖的蛋黄会粘附在周围的滤泡细胞层上，使后续的分离技术难以执行。

3. 实验室内分离

1. 从无菌容器中取出一个分离的卵泡，然后将装有剩余卵泡的容器放回冰上。在作之前研究卵泡，注意三个特征的位置:茎、柱头和生发盘（图 2）。
2. 首先从卵泡表面去除浆膜。在干纸巾上轻轻滚动毛囊以去除浆膜层，必要时轻轻将其拉下。
3. 将卵泡的茎放在装满 PBS 的碗上。利用重力来可视化茎在毛囊表面的末端位置，并使用剪刀仅剪断茎而不刺穿毛囊表面。继续去除浆膜，直到它不再可见。
4. 使用灯箱照明和生发盘作为参考，将柱头重新定位在另一侧，轻轻握住毛囊，使柱头侧可见。将卵泡直接放在一碗冰冷的 PBS 上。
5. 拿起手术刀，沿着柱头的长度轻轻切片，当蛋黄开始脱落时，立即将卵泡放入 PBS 中。 不要紧紧握住卵泡，因为这会将蛋黄推出，而不是让它简单地通过重力脱落。
6. 使用一对直的无齿组织镊子，轻轻地从切片一侧的蛋黄上剥开滤泡壁的粉红色层。通过小捏和拉动作完成提取，将卵泡壁从蛋黄上抬起。
7. 当一次从蛋黄中缩回大约 5 mm 的滤泡壁组织时，层分离效果最佳。当卵泡壁的 5 毫米切片从卵黄中成功缩回时，使用倾斜的镊子和直镊子沿卵泡壳探测。
8. 在某些情况下，颗粒层可能与卵黄的相关性比膜层更紧密。在这种情况下，只需使用任一对镊子非常轻柔地探测蛋黄表面，尝试将薄纸状层从蛋黄中拉出。找到颗粒层后，将其牢固地捏到膜层上，然后如前所述继续将两层从蛋黄中拉出。
9. 使用弯曲的镊子轻轻刷离捏合的蛋黄层。扫掉或去除碗中多余的蛋黄。不要刮擦颗粒层;这会导致撕裂。剧烈的动作会使 PBS 溶液变得模糊并降低可视化效果。继续进行仔细而深思熟虑的动作。
10. 在每 5-10 毫米的卵泡壁切片缩回后，暂停以取每组镊子中的膜层和颗粒层，并确保这两层逐渐彼此剥离，就像它们都从蛋黄上剥离一样。在毛囊外侧继续此过程。如果由于颗粒-膜层的皮瓣而导致作变得困难，请转动卵泡以从切片的另一侧开始该过程。
11. 在分离过程中，会遇到生发盘（雌配子和生发囊泡）。这是一个非常粘附于颗粒层和蛋黄的区域。小心地接近生发盘，使用直镊子将颗粒层牢牢地固定在卵黄层上，因为弯曲的镊子以轻刷动作将生发盘从颗粒细胞推到蛋黄表面。
    1. 如果需要将生发盘作为研究标本，此时用斜镊子刷掉蛋黄并根据需要储存。
12. 继续用弯曲的镊子将蛋黄与卵泡壁分离，直到卵泡的整个球体都去除了蛋黄。
13. 将蛋黄的剩余部分从各层刷掉后，将颗粒层的最后一部分与膜层分开。完全分离的颗粒层可能并非完全没有蛋黄物质，但要确保它没有被蛋黄物质覆盖。将颗粒层和鞘膜层放入具有 4 °C 温度 PBS 的单独容器中。
    1. 一旦颗粒层与膜层位于单独的容器中，用镊子在 PBS 中轻轻地来回搅动膜层，以确保颗粒层的任何剩余残留物分离。
       注:分离后的某些处理方法可能包括通过消化或离心去除脂质碎片，具体取决于所需的研究。
    2. 首次练习该技术时，准备和分析具有代表性的分离标本组织学，以确认准确的层分离和收集。
       1. 为此，使用网状组织盒或海绵将分离的组织部分固定在中性缓冲福尔马林中，以防止标本丢失，然后石蜡包埋、切片，并用苏木精和伊红 （H&E） 对切片进行染色。
       2. 由于其脆弱的性质，请小心处理颗粒层并将其放在组织学盒中的活检海绵上，以确保细胞层保持完整。
       3. 将膜层直接放入组织学盒中。这样做还可以可视化其他滤泡组织（即粘附卵黄蛋白或鞘膜细胞的颗粒细胞层标本）的标本污染水平。
          注意:由于滤泡组织的紧密结合，可能并不总是能够仅获得单层感兴趣。然而，了解可能的污染水平可以为后续多组学方法的解释提供信息。

该方案从卵巢卵泡中分离颗粒细胞层和鞘膜细胞层（图 5 和 图 6）。然后可以准备这些层进行组织学检查，以确认分离成功。这些由董事会认证的兽医病理学家 （EMB） 审查和捕获的组织学图像清楚地表明 F1 和 F5 排卵前卵泡的颗粒层和膜层有效分离（图 7）。值得注意的是，颗粒层表现出复杂的褶皱，这是其在从相邻鞘组织中提取和分离后脆弱性的结果。颗粒细胞可通过其柱状至假复层柱状形状来识别，其特点是彼此紧密附着和不同的细胞膜边界（图 7A、B）。

膜细胞层的特征是具有小而致密的细胞核的梭形细胞，可能包括大的黄体细胞（扩大的多边形细胞，具有丰富的透明至泡沫状细胞质，表明产生活性类固醇激素）。血细胞（鸟类的有核卵状细胞）和小口径血管在鞘膜层中很常见，这是意料之中的。下面的卵巢基质也可能在鞘膜层样本中可见（图 7C，D）8。与鞘膜层相比，基质组织往往表现出细胞密度降低，并且可以通过细胞方向的突然变化来观察，从圆周（细胞在彼此平行的层中排列，并与滤泡腔圆周排列）到多向（细胞在多个方向上排列）在颗粒细胞与膜层保留的情况下， 在膜细胞正上方，一层薄薄的柱状颗粒细胞将很明显（图 8）。为了确保完全层分离，彻底观察整个倒置的膜层至关重要。步骤 3.10.1 确定了一个额外的冲洗步骤，以确保在层分离后残留的颗粒细胞很少或没有。总之，组织学检查证实了颗粒和鞘层与排卵前卵泡的成功分离，突出了每一层的不同特征并验证了所提出的分离方法。

图 1:卵巢，成熟的蛋鸡。 母鸡卵巢，所有卵泡都附着在体外。排卵前卵泡被标记 （F1-F5） 以展示从最大 （F1） 到最小 （F5 或 F6） 卵泡的近似大小比较。一些母鸡卵巢可能有多达六个排卵前卵泡（未显示）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:卵巢排卵前卵泡解剖结构，成熟的蛋鸡。 （A） 细胞层示意图，其中包含构成排卵前卵泡的细胞类型和重要组织成分（使用 BioRender 创建）。请注意，该图不是按比例缩放的。（B） 卵泡结构上茎（卵泡附着点）和生发盘（雌配子部位）的大体鉴定。（C） 毛囊结构上柱头的粗略识别。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:家禽卵巢卵泡收集和分离的一般工作流程。 获取和收集细胞层（使用 BioRender 创建）的过程示意图。该过程从获得性成熟的母鸡并提取它们的卵巢卵泡开始。然后将这些卵泡收集在含有 1x PBS 的容器中并保持在冰上。然后将单个卵泡转移到含有 1x PBS 的冰培养皿中，其中灯箱用于分离细胞层。一旦实现分离，研究人员就可以将样品用于各种目的，包括 DNA 分析、RNA 分析、蛋白质分析、细胞培养或组织学。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:卵巢卵泡分离的实验室设置。 需要灯箱和解剖显微镜才能进行适当的观察。为了更好地保存样品，玻璃碗和 PBS 应预冷并保持在冰上，直到分离完成。需要一个无菌玻璃培养皿、收集容器、手术刀刀片和解剖工具。还建议有一张表格来记录分离发生的程度。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:蛋鸡卵巢中卵泡层的初步分离。 镊子用于固定膜层（粉红色的上层）和颗粒层（薄白色的下层）。此时，在分离过程中，滤泡壁的两层仍然部分相互粘附。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6:家禽卵巢卵泡层的代表性大体解剖分离。 （A） 分离的颗粒层。（B） 离体膜层。 请单击此处查看此图的较大版本。

图7:蛋鸡卵巢组织中F1和F5颗粒层和膜层的代表性组织学分离。 在 400 倍放大倍率下对 （A） F1 和 （B） F5 排卵前卵泡分离的颗粒层进行组织学鉴定。以 400 倍放大倍率从 （C） F1 和 （D） F5 排卵前卵泡中分离出卵泡膜细胞层。颗粒细胞呈柱状至假复层柱状，具有明显的细胞膜边界，而卵泡膜细胞呈纺锤形形态，细胞核小而致密。此外，在鞘膜层样本中通常观察到血细胞和小口径血管以及潜在的卵巢基质的存在。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 8:从家禽卵巢分离卵泡层后颗粒层的保留。 在少量分离中，可以观察到颗粒细胞（上图）的斑片滞留部分附着在鞘膜层（中）上，覆盖滤泡基质（下图），突出了对纯细胞层进行精确处理和分离的必要性。图像为 200 倍放大倍率。 请单击此处查看此图的较大版本。

作者没有相互竞争的利益需要报告。