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基于喹啉的离子液体的绿色合成

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DOI：

10.3791/67345

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2024年9月27日

 , 
1Molecular Genetics of Aging, Dr. B.R. Ambedkar Center for Biomedical Research (ACBR), University of Delhi

本文内容

摘要

本研究中，我们阐明了一种基于喹啉的离子液体（IL）的绿色合成方法，即通过将喹啉与过量的1-溴十六烷混合，制备出1-十六烷基喹啉溴化物{[C16quin]Br}，并利用核磁共振和红外光谱对其进行了详细表征。

摘要

抗菌耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）这一日益严峻的威胁，正在削弱现有抗生素对细菌、病毒、寄生虫及真菌不断引发的感染的治疗效力，严重危害人类健康与福祉。在此背景下，多种新型分子已展现出卓越潜力，其中离子液体（Ionic Liquids, ILs）因其环境友好、非挥发性、热稳定性高、溶解能力强且蒸气压低，成为现有抗菌剂中极具前景的替代选择之一。此外，离子液体在稳定与破坏蛋白质结构以及增强酶活性方面的应用，进一步提升了其在生物医学领域的应用价值。基于此，本文报道了一种基于喹啉的离子液体的绿色合成及其表征，该化合物具有显著的抗菌活性、低细胞毒性以及优良的人工分子伴侣功能。本研究采用无溶剂、更环保的一锅法合成策略，不仅提高了反应效率，还显著提升了化学产率。通过1H核磁共振（NMR）、13C NMR和红外光谱（IR）对所合成离子液体的纯度进行了确证。通过分析其吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）特性，并结合纸片扩散法实验，进一步验证了该化合物的生物学潜力。

引言

近年来，全球人口的急剧增长导致各类商品的消费量大幅上升，包括食品、药品以及其他维持生命所必需的重要产品。这推动了全球范围内对具有高度专一性、环境友好且有益特性的新型化学化合物的探索。离子液体（ILs）在这一领域表现出显著优势。这些化合物在科学领域的应用促进了现代化学技术研究的新发展1。与传统方法相比，离子液体的使用不仅有助于实现更先进的反应条件，还提供了一种可定制的策略，以应对实验研究与开发中涉及的多种生物化学挑战2。

通常，离子液体（ILs）是由阳离子（有机）和阴离子（无机）组成的稳定盐类，其熔点低于100 °C3。根据绿色化学的12条原则，这些化合物在经验上被认为是传统有机溶剂的有力替代品4。离子液体在应用中表现出诸多优异特性，包括高本征导电性、极性、溶解能力、热稳定性、非挥发性、酸碱性、亲水性/疏水性以及可调节性，使其非常适用于实验研究5。

除了离子液体（ILs）在现代有机合成6、催化7以及涉及传感器8、驱动器9、电池10和燃料电池11的各种电化学过程中的广泛应用外，近年来，这类化合物在应对抗菌耐药性（AMR）的生物医学领域也获得了重大关注。目前的研究表明，基于咪唑鎓、吡啶、胆碱和吡咯的离子液体由于具有高电荷密度和疏水性，作为治疗剂表现出极高的有效性12。然而，基于喹啉的离子液体仍被认为对致病微生物具有最强的抑制作用12。此类离子液体的其他生物医学应用还包括人工分子伴侣活性13、对癌细胞的细胞毒性14以及优异的药物携带能力15。

传统上，离子液体（ILs）的制备通常需要使用高毒性的溶剂体系，例如二氯甲烷、苯、四氯化碳、二氯乙烯等16，这会降低化合物的生物相容性并增加其毒性，因而不适用于生物学用途。此外，反应体系中使用有害溶剂不仅会延长反应时间，还会增加无意产生的副产物排放到环境中，造成环境污染17。而且，反应介质中所用溶剂还会影响最终产物的pH值；因此，在反应结束时彻底去除溶剂至关重要，尤其是在目标化合物拟用于蛋白质相关生物体系时。因此，在绿色化学领域，避免使用此类溶剂是更为可取的做法。

本研究报道了一种生物相容性好且无毒13的离子液体（即1-十六烷基喹啉溴化物）的一步法合成方法，该方法采用更环保的合成路线。本策略无需使用分子溶剂，而是利用反应混合物中生成的离子液体自身的自溶剂化能力，从而提高了反应效率和化学产率。该合成方法基于Menschutkin反应18。 通过核磁共振（NMR）和红外光谱（IR）对所合成化合物的纯度进行了表征。通过ADMET研究评估了该化合物的药代动力学特征及其毒性。此外，本研究还验证了所合成离子液体对致病性Candida albicans菌株的抗菌潜力。

方案

注意：1-十六烷基喹啉-1-溴化物{[C16quin]Br} 的合成方法如 Sharma 等人先前所述13。

1. 玻璃器皿的准备与灭菌

注意：此步骤应在进行目标化合物合成反应前至少1天完成。

  1. 彻底清洗一个24/29接口的250 mL双颈圆底烧瓶（RB）以及其他玻璃器皿（如量筒等），先用蒸馏水冲洗，再用丙酮冲洗。
  2. 将清洗后的器皿置于60 °C的热风烘箱中干燥，直至完全干燥以供后续使用。
    注意：通常情况下，清洗后的器皿应放置在干燥烘箱中过夜，以彻底去除水膜，确保反应体系无杂质。

2. 设置实验装置

注意：应将装置妥善固定，以确保反应物受热均匀。反应装置的示意图见图1。

  1. 将油浴锅置于带有磁力搅拌器的加热板上。反应开始前，将油浴预热至 80 °C。
  2. 使用试管铁架台将圆底烧瓶（RB）固定于油浴中，使其一半浸入置于磁力搅拌器加热板上的油浴内。
  3. 用橡胶塞密封圆底烧瓶的上口，塞中插入吹扫针，并连接带有附着 N2 气球的注射器。
  4. 用另一个橡胶塞紧密封住圆底烧瓶的另一颈口，以防止 N2 从反应体系中泄漏。
  5. 在向圆底烧瓶中加入反应物之前，通过 N2 吹扫维持惰性气氛，将整个体系预热至 80 °C。
  6. 反复补充 N2 气球中的气体，以确保反应体系的惰性环境，并在整个过程中维持温度（因此优先采用油浴加热）。

3. 将反应物加入反应体系

  1. 将 0.1 M 喹啉和 0.105 M 1-溴十六烷加入反应体系中，注意不要扰动预设的反应环境。
  2. 在惰性环境和恒定温度下，以 2500–3000 rpm 的速度持续搅拌 3 天。

4. 化合物的纯化/重结晶

注意：切勿对全部产物进行重结晶。为避免产物损失，应选择分批重结晶。

  1. 将所得固体溶于甲苯/乙酸乙酯体积比为1:2的混合溶剂中。将该混合液置于超低温冰箱（设定温度为-15 °C）中冷却至-15 °C，然后使用布氏漏斗在真空条件下抽滤；布氏漏斗通过橡胶管连接真空泵和抽滤瓶。在布氏漏斗中放置一张孔径为0.45 µm的聚丙烯滤膜，确保完全覆盖滤器底部。缓慢倒入少量上述混合溶剂润湿滤膜，以形成良好密封，防止装置发生任何空气泄漏。
  2. 用预冷的甲苯洗涤滤得的产物，即缓慢将溶剂沿漏斗加入，随后将产物在70 °C的真空烘箱中干燥。重复此操作两次，以确保目标化合物具有高纯度。

5. 使用核磁共振波谱法验证化合物

  1. 在将该化合物进行处理之前 1H NMR 和 13C核磁共振，将其溶解于氘代氯仿（CDCl₃）中3) 通过称取1-10 mg该化合物并溶于约1 mL CDCl₃中进行测定3.
  2. 使用1 mL注射器将该混合物注入核磁共振管中，用于在核磁共振波谱仪下进行样品分析。两种情况下的样品制备方法相同 1H NMR 和 13C NMR

6. 合成离子液体的红外表征

  1. 获取化合物的红外光谱无需进行样品预处理。
  2. 取少量毫克级的固体样品进行红外光谱仪检测，以了解所合成化合物中存在的不同官能团。检测方法如先前所述19。

7. ADMET 性质预测

  1. 将目标离子液体的规范SMILES输入免费在线软件ADMETLAB 2.0中，并运行程序以获得多种参数，从而验证其生物潜力。

8. 琼脂扩散试验展示所合成离子液体的生物医学应用

  1. 将白色念珠菌（Candida albicans）菌株（ATCC 90028） 接种于酵母浸膏蛋白胨葡萄糖（YPD）液体培养基中，在37 °C的BOD摇床培养箱中预培养约16小时。
  2. 通过将1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和1.5%琼脂溶于1 L双蒸水中制备YPD琼脂培养基。将配制好的培养基在121 °C下高压灭菌15分钟后，取25 mL新鲜配制的YPD琼脂培养基倒入90 mm的培养皿中。静置培养皿，使培养基充分凝固。
  3. 待培养基完全凝固后，用玻璃涂布棒将约100 µL新鲜制备的真菌接种液均匀涂布于含培养基的平板表面。将平板置于超净工作台中静置5–7分钟。
  4. 使用镊子将直径为5–6 mm的无菌圆形滤纸片置于同一平板中央。
  5. 使用20–200 µL移液器，缓慢将50 µL浓度为0.1 mM的合成离子液体（IL）水溶液加至滤纸片上。
  6. 将平板置于冰箱中冷藏约30分钟，以确保离子液体在琼脂中充分扩散。随后将平板放入预设温度为37 °C的BOD培养箱中培养24小时。
  7. 使用刻度尺测量抑菌圈直径（包含滤纸片直径），并根据公式1计算抑菌圈面积。
    面积 = πr2    （1）

结果

图2 展示了在合成过程中所涉及的门施特金反应（Menschutkin反应）的反应路线。所合成的1-十六烷基喹啉-1-鎓溴化物通过核磁共振（NMR）和红外光谱（IR）进行了表征。所得油状产物预期在 1H NMR（400 MHz，CDCl3）中显示如下信号：δ 9.34（d，1H）、8.21（d，1H）、7.80（t，1H）、7.30–7.35（m，3H）、7.20（d，1H）、5.00（t，2H）、2.00（p，2H）、1.30–1.35（m，26H）、1（t，3H），如图3所示。该化合物在13C NMR（图4；100 MHz，CDCl3）中应显示如下信号：δ 143、141、131、130.27、130、127.5、126.3、126、60、31、29、29、28.5、27、23 和 14。每个峰均标注了化合物结构中产生该信号的相应质子编号。

CDCl3 由于不含会在核磁共振（即射频区域）电磁波谱中产生显著信号的氢原子，该溶剂在核磁共振区域内是透明的，因此以其氘代形式被用作样品制备的溶剂。它不会干扰外加磁场，且本身完全惰性。然而，由于核磁共振溶剂的氘代程度无法达到完全100%，因此无法彻底消除该溶剂对应的峰（在1H NMR谱中约出现在7.26 ppm处）。不过，该峰通常不显著，可通过运行CDCl₃的空白谱图将其完全扣除。3 并相应地对所需峰进行积分。这些设置可直接在仪器上完成，也可借助特定软件（如 NMRium 等）实现。若样品未完全干燥，水的特征峰可能在谱图中显著出现。此外，CDCl3 其他氘代溶剂也可能含有一定量的水，从而产生归属于水存在的峰。该问题可通过适当干燥样品并将核磁共振溶剂在室温下用透明薄膜覆盖保存来解决。在某些情况下，还可使用某些惰性干燥剂（如碳酸钾或硫酸钠）以去除CDCl3溶剂瓶中的水分。3.

离子液体的FTIR光谱（图5）预期在3051 cm-1、2917 cm-1和2853 cm-1处出现强度最大的振动峰，分别对应于芳香环以及烷基碳中存在的C-H伸缩振动。在3440 cm-1处的一个宽峰肩对应于N-H伸缩振动。在1357 cm-1处观察到的另一个峰肩特征性地归属于C-N键引起的伸缩振动。在820 cm-1、770 cm-1和710 cm-1处的显著峰与面外C-H弯曲振动相关。1155 cm-1处的峰特指面内C-H弯曲振动。芳香环中占主导地位的C-C伸缩振动由1468 cm-1、1520 cm-1和1585 cm-1处可见的峰得以验证。所获得的结果与Sharma等人先前报道的数据13相当，因而证实了目标化合物的形成。

ADMET 分析所得结果列于表1中。采用扩散法对[C16quin]Br针对C. albicans菌株的生物医学潜力进行了研究（图6）。该技术通过测量化合物作用部位周围生长抑制圈的范围，评估离子液体的抗菌效力。结果表明，[C16quin]Br对C. albicans具有统计学上显著的抗菌效果（p < 0.05），表明此类离子液体在生物医学领域具有高度的活性与应用价值。

反应的产率百分比
根据所采用的反应方案（图2），可按如下方法计算反应的理论产率。

根据该反应方案，1 M 喹啉可生成 1 M 的 1-十六烷基喹啉溴化物，即 129.16 g/mol 喹啉 = 434 g/mol [C16quin]Br。因此，

12.916 g（0.1 摩尔）喹啉 显示 434 除以 129.16 的方程式，结果为科学计算分析。 ×12.916 = 43.4 g

因此，该反应的理论产量为 43.4 g。

然而，

产率 = 产率计算公式，实际产量除以理论产量，化学方程式。 ×100

在本研究中，产物完全干燥后，测得反应的实际产量为 37.84 g。

因此，

产率 = 数学分数，37.84 除以 43.4，用于说明数值计算。 ×100 = 87.188% (87%)

此外，较长的反应时间（如本实验情况所示）有助于反应体系达到完全的热力学平衡，此时体系的熵达到最大，同时吉布斯自由能降至最低，从而最终实现反应产率的最大化。然而，由于反应条件较为温和，因此需要延长反应时间，以确保所有反应物完全转化为产物。此处的反应时间是经过多次实践优化后确定的。

气球集气的化学反应装置；带加热/搅拌设备的蒸馏示意图。
图1：反应装置示意图。该图展示了反应装置的通用示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

亲核取代反应机理、化学方程式、箭头图示、有机化学反应。
图 2：合成机理。 合成过程中所涉及反应路线的示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

显示具有光谱峰的化学结构的核磁共振波谱图，用于分子结构分析。
图3：预期的1H NMR谱图。 [C16quin]Br的1H NMR谱图表示。 请点击此处查看此图的放大版本。

核磁共振谱图与化学结构；显示化合物的相互作用及在不同ppm值处的峰。
图4：预期的13C NMR谱图。 [C16quin]Br的13C NMR谱图表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

FTIR光谱图；分子分析的透射率与波数关系图。
图5：预期的红外光谱。 [C16quin]Br的红外光谱图表示。请点击此处查看该图的放大版本。

抗菌活性测定，含有化合物1-十六烷基喹啉-1-鎓抑菌圈的培养皿。
图6：抗真菌研究。 通过加入50 µL浓度为0.1 mM的离子液体（IL）进行纸片扩散法测定，以评估[C16quin]Br的抗真菌潜力。请点击此处查看该图的放大版本。

性质数值说明
Lipinski 规则符合分子量 ≤ 500；log P ≤ 5；氢键受体 ≤ 10；氢键供体 ≤ 5。若有两个参数超出范围，则可能吸收或通透性较差；一个参数超出可接受。
胃肠道吸收高提高口服给药的疗效
水溶性中等增强化合物的载药能力
生物利用度评分0.55 (55%)影响化合物的治疗潜力

表1：ADMET分析。 该表格列出了用于评估所合成离子液体生物活性的重要性质。

讨论

近年来，离子液体（ILs）在生物化学科学领域展现出多种有前景的应用，包括蛋白质复性/分子伴侣活性、药物递送载体以及多种有机反应中的催化剂。其独特的物理化学性质，如可调节性、生物相容性、溶解性、可持续性、稳定性等，使其成为开发新型治疗剂的潜在候选材料20。本研究将抗菌耐药性（AMR）视为一个严重问题，也是当今全球健康、食品安全和发展面临的最大威胁之一，因此优先推动生物医学科学领域内新型药物化合物的研究与开发。在选择基于喹啉的离子液体用于生物医药产业时，我们认识到其在杀灭病原微生物方面具有高效性。除了此类化合物的抗菌作用外，其人工分子伴侣活性也提升了其在生物物理学领域的科学价值。

本研究中，我们通过一种更环保的反应路线成功合成了目标离子液体。与依赖有毒溶剂并产生有害气体副产物的传统方法21相比，本文报道了一种更为经济、环保且无溶剂的合成方法。该方案仅需简单的反应装置和简易仪器，便于在实验室中稳定地合成目标化合物。所得产物可通过简单的过滤技术轻松分离。反应过程中未生成显著副产物，进一步增强了该合成方法的绿色化学特性。本研究所采用的技术在目标化合物的化学产率和纯度方面均表现出高效性。原本需多步完成的反应被整合于单个反应釜中进行，旨在节省时间和资源。采用该技术还可避免一般有机合成中常见的耗时较长的分离与纯化步骤。

然而，上述方案所伴随的局限性包括需要全面管理反应条件（尤其是温度）的兼容性，并确保充分通入氮气，以手动维持惰性工作环境。及时控制和监测反应环境对于正确执行每一步骤至关重要。可扩展性可能是该方案的另一个潜在障碍，因为将一锅法合成放大至工业规模极为困难，这主要源于均相混合以及对各个反应参数控制方面的问题。

综上所述，所报道的方法是绿色化学中一种强有力的策略，具有多种优势，但在设计、实施以及优化反应路线时，也存在一系列需要仔细应对和深入思考的挑战。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者衷心感谢印度政府卫生研究委员会（ICMR），德里-110029 [No./ICMR/52/06/2022-BIO/BMS] 项目资助的财政支持。作者还感谢大学科学 & 仪器中心（USIC），德里大学，感谢提供分析支持。Kajal Sharma 感谢科学技术部通过 INSPIRE 计划（IF200397）提供的经费支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-溴十六烷MerckCAS 号 112-82-3纯度 95%（由 HPLC 分析确定）
乙酸乙酯MerckCAS 号 205-500-4纯度 95%（由 HPLC 分析确定）
核磁共振（NMR）波谱仪Jeol，型号：JNM-ECZ 400S无无
喹啉MerckCAS 号 91-22-5纯度 95%（由 HPLC 分析确定）
甲苯MerckCAS 号 108-88-3纯度 95%（由 HPLC 分析确定）

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