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方法文章

筛选与分离可裂解C-糖苷的肠道细菌

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DOI：

10.3791/67346

⸱

2025年2月28日

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究建立了一套标准操作程序（SOP），用于高效筛选和分离能够裂解C-糖苷的肠道细菌。

摘要

C-糖苷广泛存在于药用植物中，具有丰富的结构多样性，并表现出多种生物活性，包括抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤活性。在C-糖苷中，糖基部分的异头碳通过碳-碳键直接与苷元相连。与O-糖苷相比，C-糖苷结构更稳定，耐酸且抗酶解，因此通常难以断裂，导致其吸收性差、生物利用度低。有趣的是，某些肠道细菌能够断裂C-C糖苷键，为降解C-糖苷提供了一种特异且环境友好的生物途径。本研究基于天然化合物的生物转化模型，建立了一套用于筛选可断裂C-C糖苷键的肠道细菌的标准操作程序（SOP）。该程序包括肠道细菌的制备与富集、基于活性的筛选以及在低碳源培养基中的活性验证。该方法为致力于分离和研究这类特殊功能菌的研究人员提供了基础参考。

引言

C-糖苷是一类通过碳-碳键将糖基直接连接到苷元上的化合物1。在自然界中，荭草素、牡荆素、葛根素及其衍生物通常被鉴定为C-糖苷2。这些化合物常见于如Trollius chinensis3等药用植物中，也存在于如Styela plicata4等动物体内。研究表明，这些化合物具有多种生物活性，可为人体健康带来益处，包括抗菌5,6,7、抗炎8,9,10,11,12、抗病毒3,12,13、抗氧化14,15,16以及抗肿瘤活性17。

由于糖基通过C-C键与骨架相连，这类化合物具有高度稳定性，耐受酸性和酶促水解18，导致其吸收性差、生物利用度低19。这一局限性制约了C-糖苷的开发与利用。然而，含有C-糖苷的药物通常经口服给药后，可被特定酶去糖基化，生成活性更强的生物活性苷元20,21,22,23。尽管宿主自身的酶无法对C-糖苷进行去糖基化，但已有研究报道肠道细菌能够代谢某些类型的C-糖苷。例如，部分肠道细菌可将芒果苷转化为降阿替里醇（norathyriol），后者作为抗糖尿病或抗肿瘤药物表现出更强的活性24。尽管已有上述发现，目前仅有限数量的能够裂解C-糖苷的细菌被鉴定，其潜在作用机制仍不清楚。对这些细菌进行高效且标准化的筛选，将有助于深入理解其功能，并加速C-糖苷类药物的开发。

筛选方法经过不断改进，已发展为成熟的体系。其核心方法包括富集培养、活性导向筛选以及在低碳源培养基中的活性验证。该方法有助于分离纯的目标菌株，并实现对目标微生物的物种鉴定、基因组数据解析及其特性的识别。利用该系统，可有效筛选和分离能够裂解C-糖苷的肠道细菌。

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方案

实验操作严格遵守与各菌株相关特定生物安全风险相适应的本地、国家及国际生物安全防护规定。粪便样本采集自至少一周内未服用任何药物的健康志愿者。所用试剂和设备的详细信息见于 材料表.

1. 人肠道细菌转化模型的构建  体外

  1. 通用厌氧培养基（GAM）的制备25
    1. 溶液A的制备
      1. 在500 mL锥形瓶中加入10.0 g胰蛋白胨、10.0 g蛋白胨、3.0 g大豆蛋白胨、13.5 g消化血清粉、1.2 g肝脏提取物粉、2.2 g牛肉提取物和5.0 g酵母提取物。
      2. 加入500 mL蒸馏水，加热搅拌至物质完全溶解。
    2. 溶液B的制备
      1. 按照与溶液A相同的步骤制备溶液B，但在250 mL锥形瓶中加入3.0 g葡萄糖、5.0 g可溶性淀粉、2.5 g磷酸氢二钾和3.0 g氯化钠。
    3. 溶液C的制备
      1. 按照与溶液A和溶液B相同的步骤制备溶液C，但需在100 mL锥形瓶中加入0.3 g盐酸半胱氨酸和0.3 g硫代乙醇酸钠。
      2. 将三种溶液全部加入一个1000 mL的锥形瓶中，用10%氢氧化钠溶液调节pH至7.2，并加入蒸馏水定容至1000 mL。
      3. 将培养基分装至250 mL锥形瓶中，于121 ˚C高压灭菌30 min。冷却至室温后，4 ˚C保存。
    4. 固体通用厌氧培养基的制备
      1. 向GAM液体培养基中加入1%-2%琼脂，加热至完全溶解。分装至250 mL锥形瓶中，于121 ˚C高压灭菌30 min。
    5. 低碳源培养基的制备
      1. 使用与制备GAM培养基相同的步骤制备低碳源培养基，但省略酵母提取物、葡萄糖和可溶性淀粉。
  2. 混合人肠道菌群的制备
    1. 在一次性无菌粪便采集管中收集1-2 g新鲜人类粪便，采集管内充有氮气。立即密封采集管。加入5 mL GAM培养基，密封后于无菌厌氧培养箱中37 ˚C培养24 h。
      注意：使用氧气计监测厌氧培养箱的氧气水平，并根据需要更换氮气以维持厌氧条件。
  3. 混合人肠道菌群的激活
    1. 24小时后，将0.5 mL人肠道菌悬液转移至含有4.5 mL新鲜GAM培养基的新微量离心管中。
    2. 在厌氧条件下，37 ˚C 密封培养 24 h，以获得活性混合人肠道菌群。
  4. 标准溶液的配制
    1. 称取5 mg的牡荆素和木犀草素，分别加入1 mL DMSO溶解，配制成浓度为5 mg/mL的牡荆素和木犀草素对照品溶液。
  5. 筛选能够裂解C-糖苷的活性肠道菌群
    1. 将260 µL活化的肠道菌群与含有40 µL牡荆素对照品溶液的6 mL新鲜低碳源培养基混合，于37 ˚C培养。
    2. 设置对照组（6 mL低碳源培养基、40 µL牡荆素对照品溶液和260 µL生理盐水）和空白组（6 mL低碳源培养基、40 µL生理盐水和260 µL活化肠道菌群）。
      注意：所有实验均需在厌氧培养箱中设置三个重复。
  6. 转化溶液的预处理
    1. 24 h 和 48 h 后，用移液器将 1 mL 反应溶液转移至 1.5 mL 微离心管中，在 13,400 x g 室温孵育15分钟以去除细菌。
    2. 将200 µL上清液加入600 µL甲醇中，混匀，并在13,400 x g 室温下孵育15分钟以去除蛋白质。
  7. 转化产物的检测
    1. 使用0.22 µm微孔滤膜过滤上清液，并分析滤液 通过 高效液相色谱法（HPLC）。在配备C柱的仪器上进行HPLC分析18 色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）
    2. 将色谱柱温箱温度维持在 40 ˚C，流速为 1 mL/min。以乙腈作为流动相 A，0.1% 甲酸水溶液（纯化水配制）作为流动相 B。
      注意：采用线性梯度系统，具体如下：0-20 分钟，5%-55% A；20-25 分钟，55%-95% A；25-30 分钟，95%-5% A；30-32 分钟，5% A。

2. 从人类肠道菌群中分离单菌株

  1. 混合人肠道菌群的活化
    1. 按照步骤1.3所述方法，活化能够裂解荭草苷的混合人肠道菌群，获得活化后的人肠道菌群溶液。
  2. 固体GAM平板的制备
    1. 加热溶解已配制的固体GAM培养基，在厌氧培养箱中将其倒入一次性无菌培养皿中。待培养基凝固后，制得固体GAM平板。
  3. 人肠道菌群中单菌株的初步筛选
    1. 取100 µL活化后的菌液，移入含有1 mL生理盐水的1.5 mL微量离心管中。
    2. 用一次性接种环取适量菌液，接种至培养皿表面，密封后置于厌氧培养箱中培养。
  4. 菌落形态观察
    1. 在37 ˚C下培养48小时后，观察平板上菌落的大小、形态和颜色。
  5. 挑选单菌落以获得纯菌株
    1. 挑选形态分明的单个细菌菌落，接种于含有4.5 mL新鲜GAM培养基的10 mL微量离心管中，在37 ˚C厌氧条件下培养24小时，获得单菌株。
  6. 单菌株活性验证
    1. 按照步骤1.5、1.6和1.7所述方法，验证单菌株的活性。采用高效液相色谱法（HPLC）和平板标记法进行活性检测25。
  7. 人肠道菌群中单菌株的纯化
    1. 按照步骤2.1所述方法对具有活性的单菌株进行纯化。通过荭草苷转化实验，依照步骤1.5、1.6和1.7所述程序验证其活性。

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结果

通过转化实验对十名健康志愿者的粪便样本进行了筛选，其中一份样本显示出降解牡荆素糖苷键的活性。该结果证实了筛选具有活性样本的可行性。采用平板标记法对活性样本进行分离。根据菌落的形态和特征，选取了约18个呈黄色或白色、形态各异、边缘不规则的单菌落进行进一步分析。其中仅有一个菌落能够将牡荆素裂解为其苷元——木犀草素。该菌落随后按照先前所述方法，经过五轮平板标记过程进一步纯化，最终获得一株纯的具有活性的菌株。采用高效液相色谱法（HPLC）检测去糖基化产物。牡荆素和木犀草素的保留时间分别为11.5 min和16.5 min（图1）。成功分离出具有去糖基化活性的纯菌株，并记录了其形态学特征（图2）。在GAM固体培养基上，该菌株形成的菌落呈米色，边缘不规则。

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讨论

已建立用于筛选能够裂解C-糖苷的人类肠道细菌的标准操作程序 (SOP)。通过使用这些程序，成功获得了一株纯的活性菌株，并通过转化试验验证了其去糖基化特性。该SOP包括肠道细菌的制备与富集、基于活性的筛选，以及在低碳源培养基中进行活性验证。

筛选过程中最重要的方面是使用低碳源培养基来诱导细菌活性，从而提高筛选成功率。在转化实验中，使用GAM培养基难以识别活性较低的细菌，而低碳源培养基则更易于检测此类细菌25。通过优化制备和富集技术，可在最大程度上富集目标菌株，同时减少非目标菌株的干扰。筛选过程在活性检测的指导下逐步进行，可提高成功率并最大限度降低假阳性率。本标准操作程序可供致力于获取功能性细菌的研究人员使用或参考。

与替代方法相比，本标准操作程序（SOP）专为筛选能够裂解C-糖苷的肠道细菌而设计1,9,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金 82374134 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙腈Thermo Fisher ScientificF2408R205HPLC
厌氧培养箱上海 CIMO 医疗仪器制造有限公司YQX-II
牛肉浸膏北京阿博星生物技术有限公司01-009BR
消化血清粉北京阿博星生物技术有限公司01-087BR
磷酸氢二钾北京化工厂M26298AR
一次性无菌粪便采样管朗夫有限公司5 mL
蒸馏水北京中医药大学生物制药系
DMSOSigma-Aldrich 公司WXBD2861VAR
EP 管北京百德生物技术有限公司10 mL/1.5 mL
Eppendorf 离心机Eppendorf AG5418
葡萄糖北京化工厂GC205003AR
高效液相色谱仪岛津公司LC-20
高压蒸汽灭菌器三洋电机上海有限公司MLS-3780
Innoval C18 色谱柱艾杰尔科技有限公司4.6 mm × 250 mm, 5 µm
盐酸半胱氨酸北京阿博星生物技术有限公司BGASY01BR
肝脏提取物粉末北京阿博星生物技术有限公司01-085BR
木犀草素中国食品药品检定研究院>98%
磁力搅拌器Ika Werke 有限公司RCT basic
甲醇Thermo Fisher Scientific20240901312AR
Millipore 滤膜生工生物工程（上海）股份有限公司0.22 µm × 50 mm
异荭草素北京益世明生物技术有限公司19120601>98%
蛋白胨北京阿博星生物技术有限公司1685787BR
培养皿北京百德生物技术有限公司150 mm
氯化钠北京阿博星生物技术有限公司BN20008AR
硫代甘油酸钠上海将来生物技术有限公司J031S219019AR
可溶性淀粉北京阿博星生物技术有限公司S9765BR
大豆蛋白胨北京阿博星生物技术有限公司2147955BR
胰蛋白胨艾杰尔科技有限公司1685787BR
超声波清洗机昆山超声仪器有限公司KQ-500DE
酵母提取物北京阿博星生物技术有限公司01-014BR

参考文献

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