筛选与分离可裂解C-糖苷的肠道细菌

摘要

本研究建立了一套标准操作程序（SOP），用于高效筛选和分离能够裂解C-糖苷的肠道细菌。

摘要

C-糖苷广泛存在于药用植物中，具有丰富的结构多样性，并表现出多种生物活性，包括抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤活性。在C-糖苷中，糖基部分的异头碳通过碳-碳键直接与苷元相连。与O-糖苷相比，C-糖苷结构更稳定，耐酸且抗酶解，因此通常难以断裂，导致其吸收性差、生物利用度低。有趣的是，某些肠道细菌能够断裂C-C糖苷键，为降解C-糖苷提供了一种特异且环境友好的生物途径。本研究基于天然化合物的生物转化模型，建立了一套用于筛选可断裂C-C糖苷键的肠道细菌的标准操作程序（SOP）。该程序包括肠道细菌的制备与富集、基于活性的筛选以及在低碳源培养基中的活性验证。该方法为致力于分离和研究这类特殊功能菌的研究人员提供了基础参考。

引言

C-糖苷是一类通过碳-碳键将糖基直接连接到苷元上的化合物¹。在自然界中，荭草素、牡荆素、葛根素及其衍生物通常被鉴定为C-糖苷²。这些化合物常见于如Trollius chinensis³等药用植物中，也存在于如Styela plicata⁴等动物体内。研究表明，这些化合物具有多种生物活性，可为人体健康带来益处，包括抗菌^5,6,7、抗炎^8,9,10,11,12、抗病毒^3,12,13、抗氧化

方案

实验操作严格遵守与各菌株相关特定生物安全风险相适应的本地、国家及国际生物安全防护规定。粪便样本采集自至少一周内未服用任何药物的健康志愿者。所用试剂和设备的详细信息见于 材料表.

1. 人肠道细菌转化模型的构建  体外

1. 通用厌氧培养基（GAM）的制备²⁵
   1. 溶液A的制备
      1. 在500 mL锥形瓶中加入10.0 g胰蛋白胨、10.0 g蛋白胨、3.0 g大豆蛋白胨、13.5 g消化血清粉、1.2 g肝脏提取物粉、2.2 g牛肉提取物和5.0 g酵母提取物。
      2. 加入500 mL蒸馏水，加热搅拌至物质完全溶解。
   2. 溶液B的制备
      1. 按照与溶液A相同的步骤制备溶液B，但在250 mL锥形瓶中加入3.0 g葡萄糖、5.0 g可溶性淀粉、2.5 g磷酸氢二钾和3.0 g氯化钠。
   3. 溶液C的制备
      1. 按照与溶液A和溶液B相同的步骤制备溶液C，但需在100 mL锥形瓶中加入0.3 g盐酸半胱氨酸和0.3 g硫代乙醇酸钠。
      2. 将三种溶液全部加入一个1000 mL的锥形瓶中，用10%氢氧化钠溶液调节pH至....

结果

通过转化实验对十名健康志愿者的粪便样本进行了筛选，其中一份样本显示出降解牡荆素糖苷键的活性。该结果证实了筛选具有活性样本的可行性。采用平板标记法对活性样本进行分离。根据菌落的形态和特征，选取了约18个呈黄色或白色、形态各异、边缘不规则的单菌落进行进一步分析。其中仅有一个菌落能够将牡荆素裂解为其苷元——木犀草素。该菌落随后按照先前所述方法，经过五轮平板标记过程进一步纯化，最终获得一株纯的具有活性的菌株。采用高效液相色谱法（HPLC）检测去糖基化产物。牡荆素和木犀草素的保留时间分别为11.5 min和16.5 min（图1）。成功分离出具有去糖基化活性的纯菌株，并记录了其形态学特征（图2）。在GAM固体培养基上，该菌株形成的菌落呈米色，边缘不规则。

讨论

已建立用于筛选能够裂解C-糖苷的人类肠道细菌的标准操作程序 (SOP)。通过使用这些程序，成功获得了一株纯的活性菌株，并通过转化试验验证了其去糖基化特性。该SOP包括肠道细菌的制备与富集、基于活性的筛选，以及在低碳源培养基中进行活性验证。

筛选过程中最重要的方面是使用低碳源培养基来诱导细菌活性，从而提高筛选成功率。在转化实验中，使用GAM培养基难以识别活性较低的细菌，而低碳源培养基则更易于检测此类细菌²⁵。通过优化制备和富集技术，可在最大程度上富集目标菌株，同时减少非目标菌株的干扰。筛选过程在活性检测的指导下逐步进行，可提高成功率并最大限度降低假阳性率。本标准操作程序可供致力于获取功能性细菌的研究人员使用或参考。

与替代方法相比，本标准操作程序（SOP）专为筛选能够裂解C-糖苷的肠道细菌而设计^1,9,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈	Thermo Fisher Scientific	F2408R205	HPLC
厌氧培养箱	上海 CIMO 医疗仪器制造有限公司		YQX-II
牛肉浸膏	北京阿博星生物技术有限公司	01-009	BR
消化血清粉	北京阿博星生物技术有限公司	01-087	BR
磷酸氢二钾	北京化工厂	M26298	AR
一次性无菌粪便采样管	朗夫有限公司		5 mL
蒸馏水	北京中医药大学生物制药系
DMSO	Sigma-Aldrich 公司	WXBD2861V	AR
EP 管	北京百德生物技术有限公司		10 mL/1.5 mL
Eppendorf 离心机	Eppendorf AG		5418
葡萄糖	北京化工厂	GC205003	AR
高效液相色谱仪	岛津公司		LC-20
高压蒸汽灭菌器	三洋电机上海有限公司		MLS-3780
Innoval C18 色谱柱	艾杰尔科技有限公司		4.6 mm × 250 mm, 5 µm
盐酸半胱氨酸	北京阿博星生物技术有限公司	BGASY01	BR
肝脏提取物粉末	北京阿博星生物技术有限公司	01-085	BR
木犀草素	中国食品药品检定研究院		>98%
磁力搅拌器	Ika Werke 有限公司		RCT basic
甲醇	Thermo Fisher Scientific	20240901312	AR
Millipore 滤膜	生工生物工程（上海）股份有限公司		0.22 µm × 50 mm
异荭草素	北京益世明生物技术有限公司	19120601	>98%
蛋白胨	北京阿博星生物技术有限公司	1685787	BR
培养皿	北京百德生物技术有限公司		150 mm
氯化钠	北京阿博星生物技术有限公司	BN20008	AR
硫代甘油酸钠	上海将来生物技术有限公司	J031S219019	AR
可溶性淀粉	北京阿博星生物技术有限公司	S9765	BR
大豆蛋白胨	北京阿博星生物技术有限公司	2147955	BR
胰蛋白胨	艾杰尔科技有限公司	1685787	BR
超声波清洗机	昆山超声仪器有限公司		KQ-500DE
酵母提取物	北京阿博星生物技术有限公司	01-014	BR