小鼠心血管重塑的多模态研究：四维超声与质谱成像

Amelya G. Fox; Kelsey E. Buonodono; Allison R. Jones; Madison Thomas; Luke E. Schepers; Conner C. Earl; Craig J. Goergen; Anna Colleen Crouch

doi:10.3791/67347

需要JoVE订阅才能观看此内容。请登录或开始免费试用

方法文章

小鼠心血管重塑的多模态研究：四维超声与质谱成像

1.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67347

⸱

2025年1月10日

Amelya G. Fox^*¹ , Kelsey E. Buonodono^*¹ , Allison R. Jones^*¹ , Madison Thomas¹ , Luke E. Schepers² , Conner C. Earl² , Craig J. Goergen² , Anna Colleen Crouch¹

¹Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, ²Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种使用该方案的协议体内四维超声成像和离体质谱成像技术用于评估小鼠心血管系统中的生物力学与生物分子改变。该技术应用于分析手术诱导心肌梗死模型中的心脏重塑以及衰老动物模型中的血管变化。

摘要

心血管疾病（CVD）是美国的主要死亡原因。损伤在心血管系统疾病可能由环境暴露、创伤、药物毒性或多种其他因素引起。因此，心肌组织和血管系统会发生结构改变，并表现出功能减退。这些损伤及其引发的重构可在器官水平通过超声成像（US）进行检测和定量，同时在分子水平利用质谱成像（MSI）加以分析。本文描述了一种研究小鼠心脏病理生理学的创新方法，结合体内四维（4D）超声成像与分析 ex 活体基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱成像在心脏中的应用。四维超声可提供动态的容积测量数据，包括整个心动周期中的径向位移、表面积应变和纵向应变。在血管系统中，质谱成像与超声技术可用于评估血管壁成分、血流动力学及血管壁动态变化。该方法可通过调整感兴趣的功能指标和/或改变MALDI质谱成像方案以靶向特定分子，从而适用于多种心血管疾病的研究。MALDI质谱成像可用于分析脂质、小分子代谢物、多肽和糖类。本方案概述了MALDI质谱成像在非靶向脂质组学分析中的应用，以及超声成像在心血管血流动力学与生物力学研究中的使用。

引言

心血管疾病（CVD）是全球主要的死亡原因¹。预防和治疗心血管疾病需要深入理解组织对生物力学力的分子适应机制，以及由此引起的力学性质变化。在整个心血管系统中，生物力学力在组织的功能和结构中起着重要作用²。心血管（CV）组织的力学性质受到这些力的影响，因此可作为健康与疾病的指标³^,⁴^,⁵^,⁶。为了预防、诊断和治疗心血管疾病，开发能够理解并观察疾病起始与进展过程的方法至关重要。生物医学成像在获取生理学和机制性认识方面发挥了关键作用，新的成像技术和分析方法也正在不断涌现。本实验方案展示了一种将两种心血管成像与分析技术相结合的方法，以验证这些成像模式在缺血性心脏病和血管老化研究中的潜力。

生物力学领域的研究人员通常结合体内、离体和计算机模拟方法来开展生物力学研究。以往的分子生物力学研究主要集中在蛋白质⁷（尤其是对生物力学特性具有重要影响的细胞外基质蛋白胶原蛋白和弹性蛋白），而将体内成像生物力学与分子研究相结合的工作则局限于组织学和免疫组织化学。尽管这些方法能够提供多种分子指标，并已提出细胞外基质和细胞重塑的可能机制，但它们通常分别受限于现有染料或抗体的种类。该研究领域尚缺乏对大量分子类别（例如脂质）的系统性分析。尽管这些分子类别是否直接参与力学机制尚不明确，但理解其相应的分子适应性变化仍然至关重要，因为这些分子可能成为诊断标志物和治疗干预的潜在靶点。可应用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）等分析化学方法；然而，这些技术会丢失分子在组织中的空间定位信息。而质谱成像技术（MSI）能够保持分子的空间分布完整性，并可通过连续切片对多种分析物类型（分子类别）进行成像。MSI是一种强大的分析工具，可用于研究生物组织中几乎所有类型分子的空间分布，包括代谢物、脂质、糖类、肽段以及小分子药物⁸。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）MSI是MSI的一种，特别适用于发现性分析分子量范围在50–8000 Da之间的分子。MALDI-MSI是一种离子化技术，通过向样品施加可吸收激光能量的基质，以促进目标分析物的离子化。该方法避免了局限于单一分子靶标的局限性，并可结合生物信息学工具，识别哪些分子对生物力学特性和组织重塑具有影响。

四维超声（4DUS）是一种无创的活体（in vivo）方法，可用于心脏的时间和空间特征分析。4DUS 利用来自不同切面的高帧率动态图像序列，将其整合为包含时间信息的三维数据集。这使得能够在整个心动周期中直接可视化并量化心腔复杂的三维形态变化，而无需依赖传统二维超声心动图所需的几何假设。4DUS 可基于心脏复杂的形态与运动计算活体（in vivo）功能参数⁹^,¹⁰，而基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）则可用于离体（ex vivo）心脏组织中生物分子的空间研究¹¹。为了全面理解心血管疾病（CVD）中心脏的改变，需要同时探究其机械和分子机制。因此，本文提出一种联合方法，将4DUS成像与分析技术同心脏脂质的MALDI MSI相结合，用于研究小鼠心脏的病理生理学。该方法在小鼠心肌梗死模型中进行了示范应用。

血管生物力学在调节心血管功能方面也起着关键作用²。与衰老相关的血管硬化是心血管疾病（CVD）的危险因素¹²。血管中的生物力学和血流动力学变化可通过超声成像进行观察。血管壁的分子组成是生物力学的重要组成部分，同时也对血流动力学力极为敏感。例如，振荡性管壁剪切应力已被认为与动脉粥样硬化斑块的形成有关³。后续将展示老年动物血管力学和血流动力学的初步数据。

该团队致力于研究不同疾病状态下生物力学与分子组成之间的关系。通过临床前超声成像和质谱成像（MSI）技术，确定组织中分子变化的空间分布以及疾病进展过程中相关的生物力学改变。本报告详细描述了这些方法，并展示了针对头颈部心血管系统及心脏的初步研究数据。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所述动物实验已获得田纳西大学诺克斯维尔分校机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 超声成像¹³

实验设置与动物准备
1. 实验开始前，检查异氟烷麻醉水平，必要时进行补充。打开气体前检查氧气罐压力。称取活性炭并记录其重量。
2. 在成像平台附近摆放所需物品，准备成像区域。物品包括预先裁剪的胶带、脱毛膏、纱布、棉签、高压灭菌水、角膜润滑剂、润滑凝胶、直肠温度探头、电极导线、超声耦合剂、电极凝胶（如适用）以及加热灯（图1A）。
3. 打开超声设备并初始化电机（该系统也可采集4D超声图像数据）。在超声系统上建立新实验：选择 新建研究 或 新建序列 ，并填写小鼠信息。打开生理监测平板。
4. 检查三通阀，确保气流通向诱导箱，而通向鼻罩的通道关闭。通过将蒸发器氧气流量设为1 L/min，并将异氟烷旋钮调至3%-5%，预先填充麻醉诱导箱。
5. 从小鼠饲养笼中取出动物。
6. 将小鼠放入诱导箱，直至其在3%-5%异氟烷浓度下完全麻醉。
7. 切换三通阀，使气流转向超声成像板上的鼻罩。将异氟烷旋钮调至1%-2%。
8. 将小鼠从诱导箱中取出并称重，记录动物体重。
9. 将小鼠仰卧位放置于成像板上。
10. 在动物眼睛上涂抹角膜润滑剂。
11. 若成像区域有毛发，使用市售脱毛膏和棉签去除毛发。用海绵蘸水擦拭皮肤，清除残留脱毛膏，防止灼伤。
12. 根据动物体位，将心电图（ECG）电极导线皮下插入胸部和后肢两侧。
  1. 插入后，用胶带固定ECG导线。若不使用ECG导线（即未插入ECG导线），则通过动物成像板监测ECG信号。
  2. 为实现皮肤与板之间的电传导，在板上涂抹导电凝胶，并固定动物四肢位置。
13. 使用胶带或环绕成像板并覆盖四肢的弹性带固定动物四肢（图1B）。
14. 使用润滑凝胶插入直肠温度探头，并用胶带固定探头。
15. 在平板上检查ECG、呼吸和温度信号。确保心率约为350-600 bpm，呼吸频率约为50-100次/分钟，直肠温度在35-37 °C之间。根据需要调整异氟烷浓度。
16. 如有需要，打开加热灯（例如250 W红外加热灯泡）¹⁴，并调节高度以维持核心体温（图1C）。
  1. 加热灯与动物距离不得小于12英寸。在初步研究中为确定灯泡与动物之间的最佳距离，可调节高度并使用红外测温仪记录皮肤温度，该温度不应超过42 °C¹⁵。
心脏4D超声
1. 将换能器置于支架中，处于半锁定位置。
2. 将换能器上的凸起点与屏幕上的蓝点对齐。通常将该点朝向动物右侧。
3. 旋转换能器，使其沿小鼠矢状面方向放置，凸起切口指向尾侧。
4. 使用超声板底部的杠杆调节动物倾斜角度，使用换能器底部的杠杆调节换能器角度。
5. 在胸腔腹侧表面涂抹足量超声耦合剂，以实现皮肤与换能器之间的声学耦合。耦合前确保无残留毛发。
6. 降低换能器，使其接触超声耦合剂。
7. 使用板底部的X/Y旋钮进行微调，或移动整个板进行大幅调整。
8. 确保胸骨旁长轴切面图像在屏幕上水平显示心尖、左心室流出道和主动脉，以便获得更准确的短轴图像（图2A、B）。
9. 点击屏幕角落的 命名图像 以将图像保存至当前序列。
10. 顺时针旋转换能器90°，切换至胸骨旁短轴切面（图2C）。
  注意：为获得最佳4D图像质量，用户应尽量将步进电机沿心室胸骨旁长轴对齐，该轴并不总是与胸骨完全平行。心脏/左心室常呈向左下方倾斜的角度。
11. 确保左心室在屏幕右侧可见，右心室在屏幕左侧可见（图2D）。
12. 若小鼠呼吸节律稳定，点击图像左上角的 EKG框 以开启4D图像的呼吸门控。若节律不稳定，则在后期处理中完成此步骤。
13. 点击屏幕左上角的立方体图标以设置4D图像。
14. 在调整换能器的起始和终止位置前，重置换能器。
15. 将起始位置调整至心尖稍下方，将终止位置调整至主动脉弓。
16. 将步长设为0.08-0.13 mm，帧率设为200-300 Hz。
  注意：较小的步长可提供更佳的图像分辨率用于分析，但会增加采集时间。若数据采集时左心室对齐近乎完美且分析过程中无需或仅需极少重新定向，则可接受较大的步长。当动物心率较高（>450 bpm）时，应考虑提高帧率。
17. 在开始扫描前，确保生命体征和EKG信号持续稳定（>350 bpm，呼吸频率>50次/分钟）。
18. 扫描和处理完成后，开启 保存EKV/4D数据用于后期处理 和 呼吸门控 功能。
19. 点击屏幕右下角的 命名图像 ，并在名称中包含小鼠编号。
20. 为检查图像质量，点击 更多控制 并选择 载入4D。
21. 逐层查看心脏各切面，确保在整个心动周期中心脏中心位置不移动。中心移动表明EKG和/或呼吸门控存在变异性，从而增加分析难度。必要时重新调整监测设备并重复扫描。
心脏4D超声分析
1. 进入研究浏览器。将所有B模式2D图像导出至Vevo Lab，并将4D数据以其他文件类型导出，选择“.raw”数据格式保存至硬盘。
  注意：本研究中使用的4D图形用户界面工具箱目前尚未公开。如需获取访问权限和详细说明，请联系普渡大学Craig Goergen博士。
2. 使用VevoLab软件对4D数据进行替代性分析。使用此框架时，需将4D数据从设备导出为Vevo Lab文件。
血管成像
1. 对颈动脉进行B模式成像时，将超声换能器平行于颈动脉放置，靠近中线位置。
2. 当颈动脉可见后，向上移动换能器以寻找颈动脉分叉。
3. 找到清晰的颈动脉分叉图像后，将增益设置调整为35 dB，并采集B模式图像。
  1. 向左或向右倾斜换能器可能改善图像质量。调整换能器或平台角度，使目标血管不与换能器完全平行，从而使多普勒角度保持在60°以下。否则，可能需要进行±15°的偏移。
4. 切换至 脉冲波多普勒模式 以获取速度测量值。
5. 将取样容积置于血管中心。调整光标角度，使其与颈动脉平行。然后点击播放开始速度测量，并点击保存记录数据。
6. 对颈外静脉进行B模式成像时，将超声换能器平行于颈外静脉放置。颈外静脉位于颈动脉前方和外侧。
7. 找到颈外静脉后，移动换能器至颈内静脉与颈外静脉汇合处。找到清晰图像后，将增益设置调整为35 dB，并采集B模式图像。
8. 切换至 脉冲波多普勒 模式以获取速度测量值。
9. 将取样容积置于血管中心。调整光标角度，使其与颈外静脉平行。然后点击播放开始速度测量，并点击保存记录数据。
血管超声分析
1. 采集B模式图像和脉冲波多普勒测量数据后，使用软件测量血管直径和血流速度。
2. 将图像加载至软件后，选择 血管分析包。
3. 选择血管两侧以获取完整直径。
4. 对颈动脉，使用血管分析包中的直径选项测量收缩期和舒张期的直径。
5. 使用血管分析包中的速度选项进行速度测量。
6. 对颈动脉，在收缩期选择最高速度峰值进行速度测量，在舒张期选择最低速度峰值进行速度测量。
7. 利用直径测量值，使用以下公式计算格林-拉格朗日应变张量的周向分量：
  $弹性应变方程 $E_{\theta\theta} = \frac{1}{2}(\frac{D_s^2}{D_d^2} - 1)$。$ (1)
  其中 D_s 代表收缩期直径，D_d 代表舒张期直径。
8. 对颈外静脉，可在心动周期中任意点选取数据进行速度测量。

2. 安乐死与组织采集

准备铝箔船用于组织的速冻（图3）。
在实验结束时，通过5%浓度的异氟烷过量麻醉处死动物，并辅以双侧气胸或颈椎脱位（仅心脏研究）。
使用镊子将皮肤提起成帐篷状，在颈部区域用剪刀剪开帐篷状皮肤以暴露血管，或在胸骨下方剪开以暴露心脏。
切开皮肤和肌肉层以暴露血管，或切开骨骼以暴露心脏。
使用棉签进行钝性分离，将心脏或血管从周围组织（包括脂肪）中分离出来。务必分离颈动脉与神经。使用手术器械取出心脏和血管。
注意：可在切除血管前，于其近端和远端缝线，以便更完整地取出血管。
将组织置于预先标记好的铝箔船上，并将铝箔船放入液氮中（图3）。
将组织储存于-80 °C，直至进行冷冻切片。运输过程中使用干冰以维持低温。

3. 质谱成像

玻璃片上使用冷冻切片和最佳切割温度（OCT）包埋
1. 将冷冻切片机温度设为 -25 °C，并安装刀片。
2. 在金属持样头表面涂布 OCT，放入冷冻切片机中冷冻固定。
3. 使用 OCT 将心脏基底部固定在已准备好的金属持样头上（图 4A）。避免 OCT 接触到待测样本区域，因为 OCT 会污染质谱信号（聚乙二醇 [PEG] 污染），并抑制目标脂质信号。
  注意：可选择采用水贴片法以避免样本污染。详见下方附加方案中的操作说明。
4. 由于本方法对空间对齐要求较高，应参考 MATLAB 图形用户界面提供的标定后心脏数字图像来指导切片（图 4B）。
5. 切片过程中记录每次旋转（10 µm），并记录每张贴于载玻片上的切片所对应的深度（以毫米为单位）。
  注意：必须准确记录心脏或血管系统中的特定位置，以便与 MATLAB 提供的超声数据数字图像精确匹配。
6. 将组织切片（厚度 10 µm）以融霜贴片法贴附于显微镜载玻片上。
  注意：所用载玻片类型取决于使用的质谱仪。每张载玻片包含心脏各区域的一个切片。至少需要三张载玻片（正离子模式、负离子模式、备用）。
7. 对于每组 n = 1 的实验，沿心脏长轴方向切片，以观察从心尖到基底部的分子变化。
8. 对于血管组织，切片前应将其包埋于明胶中并快速冷冻¹¹。
9. 将载玻片置于 -80°C 的切片邮寄盒中保存，直至进行质谱成像实验。
10. 若需进一步通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）鉴定和定量脂质或代谢物，请连续切取约 60–100 µm 的组织切片，并在冷冻前收集至 0.5–2 mL 离心管中。
玻璃片上使用冷冻切片及水贴片法
1. 取一个烧杯加入高效液相色谱（HPLC）级水，并备好 5 mL 和 1 mL 注射器。
2. 将冷冻切片机温度设为 -25 °C，并安装刀片。
3. 将一对镊子放入冷冻切片机中预冷，以备贴片使用。
4. 用注射器吸取 5 mL HPLC 水，并将其放入冷冻切片机中。
5. 在注射器内的水即将完全冻结前，将其挤出至金属持样头表面，并使其完全冻结。
6. 用注射器吸取 1 mL HPLC 水，并将该注射器放入冷冻切片机中。
7. 约 30–60 秒后，在持样头中心位置滴一小滴部分固化的水。立即用镊子夹取心脏并置于水滴中，在其完全冻结前固定位置，待周围水完全冻结后保持稳定。
  注意：可根据感兴趣区域选择用心尖或基底部贴片。本研究中，将基底部贴附，心尖朝外。
8. 本方法其余步骤按 3.1 节所述操作进行。
基质喷涂
1. 从冰箱中取出载玻片，放入干燥器中直至载玻片表面干燥。
2. 开启 HTX M3+ 喷涂仪，在笔记本电脑上打开 HTX 应用程序，选择屏幕中央的方法选项。标准基质浓度可在已存储的方法中找到（屏幕左侧的方法选项 > OI_usermethods > 基质）。
  1. 本实验中，设定喷嘴温度为 75 °C，流速为 100 µL/min，压力为 10 psi。
3. 在实验记录本中记录样本名称、电离极性、基质种类、溶剂及浓度。计算所需基质量（例如，5 mL 浓度为 10 mg/mL 的溶液 = 50 mg 基质）。
4. 配制溶剂（例如，70% 甲醇）。
  1. 本实验中，正离子模式使用 40 mg/mL 的 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质溶液，负离子模式使用 10 mg/mL 的 9-氨基吖啶（9AA）基质溶液。两种基质均使用 70% 甲醇作为溶剂。其他常见基质及喷涂参数请参照步骤 3.3.2。
5. 称取基质并转移至 15 mL 圆锥形离心管中。确保质量接近步骤 3.3.3 中计算的所需量，无需完全精确。根据实测质量计算所需溶剂量。
6. 使用移液器向离心管中加入溶剂。
  注意：体积依据步骤 3.3.5 中测得的质量确定。
7. 超声处理混合液 10 分钟。在基质超声过程中，从干燥器中取出载玻片。
8. 打开喷涂仪托盘，将载玻片置于左下角，并用胶带固定边缘。
  注意：胶带一端可折叠以便于后续移除。
9. 选择 样本喷涂 区域。关闭托盘。
10. 使用注射器和滤器将基质溶液倒入注射器，通过滤器过滤至喷涂仪左侧带黑色盖子的样品瓶中。
11. 将样品瓶放回喷涂仪指定位置，并将 D 型管插入瓶中。
  注意：确保管子未接触瓶底，且完全浸入液体中。
12. 开启惰性气体，确保喷涂仪压力表显示为 10 psi。按下开始按钮。待喷涂仪达到设定温度后，点击闪烁的开始按钮。
13. 喷涂完成后，打开托盘，取出样本，放入 MALDI 载玻片架或重新放回干燥器中（图 4C）。
14. 使用扫描仪扫描 MALDI 载玻片架和载玻片，或用手机拍照。将图像保存至 U 盘，供质谱成像使用。
15. 在喷涂仪上选择适当的清洗或 下一次喷涂 选项。若进行清洗，将 D 型管从基质瓶移至废液烧杯中。
16. 向托盘喷洒甲醇并擦拭清洁。关闭氮气。
MALDI 质谱成像（MSI）
1. 在计算机上进入 Synapt 软件，检查极性是否已设置为所需模式，若未设置则进行更改。
2. 将载玻片加载至 MALDI 源的仪器中，并使用软件点击计算机上的加载按钮。
3. 将图像（步骤 1.2.17）移至项目文件夹中的图像文件夹。
4. 进入 HD Imaging 软件，打开先前的项目（使用相同基质的项目）。
5. 在实验记录本中记录质量范围、捕获和传输碰撞能量、激光能量、负/正离子模式。
6. 在 HD Imaging 中点击白色页面图标，然后点击下拉箭头并选择 新建板。
7. 浏览并找到 项目文件夹 > 图像 文件夹中的图像并打开。
8. 将板类型更改为 MALDI 标准，并定义板边缘（选择下方图示中以红色加号标示的四个角）。
  注意：左上框用于导航至各角点，右上框用于选择角点，下框仅用于整体载玻片可视化。
9. 在左上角找到小的图案标签，点击铅笔或其他矩形或圆形选项以勾勒组织轮廓。使用左键点击勾勒组织，右键点击结束。
10. 像素大小默认为 50 µm。根据需要进行调整。
11. 点击 另存为，浏览至 项目成像采集文件夹，以载玻片名称（YYYYMMDD 格式）命名并保存。
12. 点击顶部中央的 Mass Lynx 按钮，导出至 Mass Lynx。
13. 进入 Mass Lynx 软件。
14. 点击 文件 > 打开项目文件夹。编辑文件名和文本名为载玻片名称（YYYYMMDD 格式）。
15. 右键点击 MS 文件，浏览并选择当前载玻片。
16. 再次右键点击 MS 文件，点击编辑。双击蓝色框。
17. 进入扫描条件。找到源设置并更改为用户自定义。然后导航至正确的 项目文件夹 > 采集文件夹 > 当前载玻片 > 确定。
18. 点击 另存为 并包含载玻片名称进行保存。
19. 使用参考化合物（例如红磷）校准仪器
  1. 进入 Synapt（校准）界面。点击播放按钮开始采集数据。命名为 YYYYMMDD_cal1（例如：20230614_cal1）。
  2. 确保质量范围为 50–2000。激光能量可设为约 175。
  3. 点击激光发射播放，然后点击 下一步。运行至约 15 或 20 次后，点击 红色停止。
  4. 进入 W 控制台。
  5. 创建校准文件并点击开始。在 校准谱图编辑器 中，点击 文件 > 新建。输入 YYYYMMDD_cal1。
  6. 编辑质量范围为项目所需的质量范围（例如 50–2000）。
  7. 选择 手动校准。选择 分辨率模式 并点击编辑。选择红磷作为参考化合物。
  8. 点击原始数据文件，并滚动至最底部（应为刚刚采集的数据）。
  9. 进入底部历史记录，选择 精确质量 > 确定 > 确定。
  10. 持续点击 下一步 和确定，直至出现开始按钮，然后点击开始。
  11. 进入绿色对勾界面，查看未找到的峰。
20. 进入 Mass Lynx（开始实验样本的实际运行）。
21. 点击播放按钮，检查样本数量是否正确。
22. 进入 HD Imaging。
23. 检查像素大小是否仍为初始设定值。
24. 进入 Synapt 检查极性。
25. 点击相机按钮，确认其正在移动并发射激光。
26. 检查是否正在采集数据。采集的质谱应在 Synapt 页面上显示。
质谱分析
1. 使用 HD Imaging 软件和 Mass Lynx 进行数据分析。
2. 在 HD Imaging 中使用处理标签页处理成像数据。
3. 在 HD Imaging 的分析标签页中查看分子离子图像（也称质谱图像）。分子离子图像的热图显示特定 m/z 离子在某一区域的强度分布（图 5）。使用质谱图像叠加图展示分子的空间分布（图 6 和 图 7）。
4. 使用 TIC 或适用于成像的其他归一化方法对数据进行归一化。
5. 识别与感兴趣区域在空间上相关的 m/z 峰。在 HD Imaging 中运行空间相关性分析（R > 0.65）以识别共定位峰。
6. 使用 LipidMaps¹⁶ 和 METASPACE¹⁷ 对这些峰进行潜在脂质鉴定。
7. 通过后续 LC-MS 数据验证脂质注释。使用 Metaboanalyst 对 LC-MS 数据进行统计分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

上述成像方案已用于两项初步研究：心肌梗死（MI）重构和血管老化。在心脏实验中，通过永久性冠状动脉结扎手术诱导急性心肌梗死¹⁸^,¹⁹。对同一样本依次进行4D超声和基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI），以揭示其生理和分子层面的变化。梗死心脏中的代表性分子离子图像如图5所示。m/z 577.52被初步鉴定为Cohibin C或D。尽管仍需进一步分析（如LC-MS或串联质谱）以确认分析物身份，但已有研究在牛心脏中检测到Cohibin²⁰，且其可能与组织重构相关²¹^,²²。心室结构和功能的变化也可能与特定区域靶向脂质的上调或下调相关（图6）。在4D超声图像中，颜色谱的绿-黄色端表示表面应变幅度低于20%的组织，对应于梗死区域

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

超声成像可能受操作者影响，但通过使用解剖标志和充分的培训可减少操作者偏差。二维超声尤其容易受不同操作者之间的变异性影响，因为其成像角度依赖性强；而四维超声由于采集的是整个体积数据且不受角度影响，因此变异性较小。研究还发现，由于可调节的动物平台和探头支架的存在，图像的可重复性更容易实现。理想情况下，超声数据的采集应在整个研究过程中由同一名研究人员完成，以避免因技术差异导致的数据变化。

维持核心体温至关重要，因为温度变化可能改变心血管血流动力学和生物力学测量结果²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹。除了成像用的加热板外，还建议使用外部加热装置（如加热灯），如图1所示。该加热灯由用户调节，以维持直肠温度在37 °C。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

Craig J. Goergen 是 FUJIFILM VisualSonics 的付费顾问。

致谢

Allison Jones 由田纳西大学机械与航空航天工程系支持 & 生物医学工程系研究生奖学金。本出版物中报告的研究（Conner Earl）得到了美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所F30HL162452基金的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
2,5-二羟基苯甲酸（DHB）	Supelco, >99.0% (HPLC)	85707-10MG-F	MALDI-MS 用 DHB 基质试剂；https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/85707?cm_sp=Insite-_-wimsShippingEmailRecs_wims EmailAPI_wimsGruCrossEntropy-_-wimsEmailAPI10-3
9-氨基吖啶（9AA）	Supelco, ≥99.5% (HPLC)	92817-1G	MALDI-MS 用 9-氨基吖啶基质试剂；https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/92817?srsltid=AfmBOooiQjQ4pWv_XxITkU 4Lkm0UnHXKekGS_ dFl7V40V9QLWoPpNLoc
Aquasonic 超声耦合凝胶	Parker Laboratories	Parker 01-02	超声凝胶；https://www.parkerlabs.com/products/aquasonic-100-ultrasound-transmission-gel/
台式杜瓦瓶	ThermoScientific	4150-2000	液氮容器；https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4150-4000?gclid=Cj0KCQjwpvK4BhDUARIsA DHt9sQVc2f-NxN04Nb5Mv F6TZ7GLHWWDEeqDYmEvtKJSQ YHDeVgZ9qylvYaAs27EALw_wcB &source=google_shopping&ISO_ CODE=us&LANG_CODE=en&ef_id =Cj0KCQjwpvK4BhDUARIsADHt9 sQVc2f-NxN04Nb5MvF6TZ7GLHWWDE eqDYmEvtKJSQYHDeVgZ9qylvYa As27EALw_wcB:G:s&s_kwcid=AL!3652 !3!716188292869!!!g!2366243726129 !!21787513085!171591181194&ev_chn =shop&cid=0se_gaw_30092024_ PBYTXL&source=google_shopping &ISO_CODE=us&LANG_CODE= en&gad_source=1
冷冻切片机	Leica Biosystems	CM 系列	https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/
干燥器	VWR	89054-052	https://us.vwr.com/store/product/9104882/desiccator-plastic-ace-glass-incorporated
Epredia MX35 Premier 一次性低剖面切片刀	Fisher Scientific	3052835	冷冻切片机刀片；https://www.fishersci.com/shop/products/mx35-premier-disposable-low-profile-microtome-blades/3052835
Falcon 15 mL 圆锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-53A	圆锥形管；https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/1495953A?gclid=Cj0KCQjwpvK4BhDUARIsA DHt9sSBcy5n-lhShligJUOX5KKVGn0bt87 8AB2_muOD2PPTue1phpZgeqwa AqgiEALw_wcB&ef_id=Cj0KCQjw pvK4BhDUARIsADHt9sSBcy5n-lhS hligJUOX5KKVGn0bt878AB2_muO D2PPTue1phpZgeqwaAqgiEALw_ wcB:G:s&ppc_id=PLA_goog_20861 45674_81843405034_1495953A__ 386247001345_165426395473886 37329&ev_chn=shop&s_kwcid=AL!4428!3 !386247001345!!!g!856907751004!& gad_source=1
Flex-Tubes 微量离心管	Eppendorf	EP022364120	离心管；https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ep022364120?utm_source=google%2Cgoogle&utm _medium=organicshopping%2Ccpc&utm _campaign=21043330280&utm_ content=&gclid=Cj0KCQjwpv K4BhDUARIsADHt9sTHRD35k CHPtfI2A41axodnMVr6a1eBKk zM4bSUYQAyfEKo3UgTAEQa Ap7wEALw_wcB
气态氮气	Airgas	N/A
玻璃显微镜载玻片	Electron Microscopy Sciences	71873-02	https://www.emsdiasum.com/positive-charge-microscope-slides
液氮	Airgas	N/A
质谱仪	Waters	Synapt G2-Si	https://www.waters.com/waters/en_US/SYNAPT-G2-Si-Mass-Spectrometry/nav.htm?locale=en_mkcid=1000251Foodety%3C/a%3E&cid=134740653&bcid= 134528734
基质喷涂仪	HTX Technologies	M3+	https://www.htximaging.com/htx-m3-sprayer
甲醇（HPLC），>99.9%	Fisher Chemical	A4524	甲醇；https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-hplc-fisher-chemical-9/A4524?crossRef=A4524#?keyword=A4524
临床前超声成像系统	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-3100；Vevo F2 已取代 Vevo 3100 投入生产。系统包含异氟烷蒸发器和诱导箱。
Reynolds Wrap	N/A	N/A	铝箔
Signagel 电极凝胶	Parker Laboratories	Parker 15-60	电极导电凝胶；https://www.parkerlabs.com/products/signagel-electrode-gel/
无菌润滑胶	Medline	MDS032273Z	润滑凝胶；https://www.medline.com/ce/product/Sterile-Lubricating-Jelly/Lubricating-Jelly/Z05-PF03664?sku=MDPMDS032273H
手术器械：剪刀、镊子/弯头镊、缝合线	Fine Science Tools	11252-00, 11050-10, 14016-14, 14084-08, 15000-08	info@finescience.com
外科海绵 200 个装 –非无菌纱布垫 -急救伤口护理敷料海绵 –编织医用不粘、非粘连网状擦拭海绵	Medpride	B08RZGQ5GW	纱布；https://www.amazon.com/Medpride-Surgical-Sponges-200-Pack/dp/B08RZGQ5GW/ref=asc_df_B08RZGQ5GW/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&h vadid=693270340506&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=960915122 2290977669&hvpone=&hvptwo= &hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=& hvlocint=&hvlocphy=9192978&hv targid=pla-1245491514869&psc= 1&mcid=33f4d647c88630c79116 888d565a63b0
Tissue-Plus O.C.T. 包埋剂	Fisher Scientific	23-730-571	OCT；https://www.fishersci.com/shop/products/tissue-plus-o-c-t-compound-2/23730571
木柄棉签和涂药棒	Fisherbrand	22-363-160	棉签；https://www.fishersci.com/shop/products/wood-handled-cotton-swabs-applicators-8/p-7146852

参考文献

Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), E153-E639 (2022).
Kassab, G. S. Biomechanics of the cardiovascular system: The aorta as an illustratory example. J R Soc Interface. 3 (11), 719-740 (2006).
Moore, J. E., Xu, C., Glagov, S., Zarins, C. K., Ku, D. N. Fluid wall shear stress measurements in a model of the human abdominal aorta: Oscillatory behavior and relationship to atherosclerosis. Atherosclerosis. 110 (2), 225-240 (1994).
Nerem, R. M. Vascular fluid mechanics, the arterial wall, and atherosclerosis. J Biomech Eng. 114 (3), 274(1992).
Cecchi, E., et al. Role of hemodynamic shear stress in cardiovascular disease. Atherosclerosis. 214 (2), 249-256 (2011).
Good, B. The influence of blood composition and loading conditions on the behavior of embolus analogs. J Mech Behav Biomed Mater. 140, 105738(2023).
Bao, G., et al. Molecular biomechanics: The molecular basis of how forces regulate cellular function NIH public access. Mol Cell Biomech. 3 (2), 91-105 (2010).
Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Molecular imaging by mass spectrometry-looking beyond classical histology. Nat Rev Cancer. 10 (9), 639-646 (2010).
Soepriatna, A. H., Kevin Yeh, A., Clifford, A. D., Bezci, S. E., O'Connell, G. D., Goergen, C. J. Three-dimensional myocardial strain correlates with murine left ventricular remodelling severity post-infarction. J R Soc Interface. 16 (160), 20190570(2019).
Damen, F. W., et al. High-frequency 4-dimensional ultrasound (4DUS): A reliable method for assessing murine cardiac function. Tomography. 3 (4), 180-187 (2017).
McDonald, R., Poulos, D., Gutzwiller, L., Sheth, R. A., Good, B., Crouch, A. C. A MALDI mass spectrometry imaging sample preparation method for venous thrombosis with initial lipid characterization of lab made and murine clots. J Am Soc Mass Spectrom. 34 (9), 1879-1889 (2023).
Benetos, A., et al. Influence of age, risk factors, and cardiovascular and renal disease on arterial stiffness: Clinical applications. Am J Hypertens. 15 (12), 1101-1108 (2002).
Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. C. Murine echocardiography and ultrasound imaging. J Vis Exp. (42), v2100(2010).
Bellantuono, I., et al. A toolbox for the longitudinal assessment of healthspan in aging mice. Nat Protoc. 15 (2), 540-574 (2020).
Henriques, F. C. Jr, Moritz, A. R. Studies of thermal injury: I. The conduction of heat to and through skin and the temperatures attained therein. A theoretical and an experimental investigation. Am J Pathol. 23 (4), 530(1947).
Conroy, M. J., et al. LIPID MAPS: Update to databases and tools for the lipidomics community. Nucleic Acids Res. 52 (D1), D1677-D1682 (2024).
Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2016).
Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. Am J Physiol. 269 (6 Pt 2), H2147-H2154 (1995).
Clark, J. E., Flavell, R. A., Faircloth, M. E., Davis, R. J., Heads, R. J., Marber, M. S. Post-infarction remodeling is independent of mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3). Cardiovasc Res. 75 (3), 523-530 (2007).
Hattori, Y., Konno, H., Abe, M., Miyoshi, H., Goto, T., Makabe, H. Synthesis, determination of the absolute configuration of tonkinelin, and inhibitory action with bovine heart mitochondrial complex I. Bioorg Med Chem. 15 (8), 3026-3031 (2007).
Golam Mostofa, M., et al. CLIP and cohibin separate rDNA from nucleolar proteins destined for degradation by nucleophagy. J Cell Biol. 217 (8), 2675-2690 (2018).
Chan, J. N. Y., Poon, B. P. K., Salvi, J., Olsen, J. B., Emili, A., Mekhail, K. Perinuclear cohibin complexes maintain replicative life span via roles at distinct silent chromatin domains. Dev Cell. 20 (6), 867-879 (2011).
Dann, M. M., et al. Quantification of murine myocardial infarct size using 2-D and 4-D high-frequency ultrasound. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 322 (3), H359-H372 (2022).
Kaya, I., Sämfors, S., Levin, M., Borén, J., Fletcher, J. S. Multimodal MALDI imaging mass spectrometry reveals spatially correlated lipid and protein changes in mouse heart with acute myocardial infarction. J Am Soc Mass Spectrom. 31 (10), 2133-2142 (2020).
Tressler, C., et al. Factorial design to optimize matrix spraying parameters for MALDI mass spectrometry imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (12), 2728(2021).
Zhang, L., et al. Vascular lipidomics analysis reveals increased levels of phosphocholine and lysophosphocholine in atherosclerotic mice. Nutr Metab. 20 (1), 1-16 (2023).
Kohno, M., et al. Induction by lysophosphatidylcholine, a major phospholipid component of atherogenic lipoproteins, of human coronary artery smooth muscle cell migration. Circulation. 98 (4), 353-359 (1998).
Crouch, A. C., Batra, A., Greve, J. M. Hemodynamic response to thermal stress varies with sex and age: A murine MRI study. Int J Hyperthermia. 39 (1), 69-80 (2022).
Crouch, A. C., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional areas of deep/core veins are smaller at lower core body temperatures. Physiol Rep. 6 (16), e13839(2018).
Crouch, A. C., Castle, P. E., Fitzgerald, L., Scheven, U. M., Greve, J. M. Assessing structural and functional response of murine vasculature to acute β-adrenergic stimulation in vivo during hypothermic and hyperthermic conditions. Int J Hyperthermia. 36 (1), 1136-1145 (2019).
Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature. Int J Hyperthermia. 34 (7), 1121-1133 (2018).
Clift, C. L., Mehta, A., Drake, R. R., Angel, P. M. Multiplexed imaging mass spectrometry of histological staining, N-glycan and extracellular matrix from one tissue section: A tool for fibrosis research. Methods Mol Biol. 2350, 313-329 (2021).
Salehi, H. S., et al. Coregistered photoacoustic and ultrasound imaging and classification of ovarian cancer: Ex vivo and in vivo studies. J Biomed Opt. 21 (4), 046006(2016).
Verbeeck, N., et al. Connecting imaging mass spectrometry and magnetic resonance imaging-based anatomical atlases for automated anatomical interpretation and differential analysis. Biochim Biophys Acta. 1865 (7), 967-977 (2017).
Yang, E. Y., et al. Real-time co-registration using novel ultrasound technology: Ex vivo validation and in vivo applications. J Am Soc Echocardiogr. 24 (7), 720(2011).
Maris, L., et al. Method for co-registration of high-resolution specimen PET-CT with histopathology to improve insight into radiotracer distributions. EJNMMI Phys. 11 (1), 1-20 (2024).
Lin, B. J., et al. MSIr: Automatic registration service for mass spectrometry imaging and histology. Anal Chem. 95 (6), 3317-3324 (2023).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

小鼠心血管重塑的多模态研究：四维超声与质谱成像

本文内容

摘要

摘要

引言

方案

结果

讨论

披露

致谢

材料

参考文献

重印与许可

标签