方法文章

小鼠心血管重塑的多模态研究：四维超声与质谱成像

DOI：

10.3791/67347

⸱

2025年1月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, 2Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此处，我们介绍一种用于 体内 四维超声成像和 离体 质谱成像技术用于评估小鼠心血管系统中的生物力学和生物分子改变。该技术应用于分析手术诱导心肌梗死模型中的心脏重塑以及衰老动物模型中的血管变化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心血管疾病（CVD）是美国的主要死因。心脏损伤 心血管系统疾病可能由环境暴露、创伤、药物毒性或多种其他因素引起。 因此，心肌组织和血管系统会发生结构改变并表现出功能减退。这些损伤及其引发的重构可在器官水平通过超声成像（US）进行检测和量化，同时在分子水平通过质谱成像（MSI）进行分析。本文描述了一种研究小鼠心脏病理生理学的创新方法，结合 体内 四维（4D）超声成像与分析 ex 活体基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱成像在心脏中的应用。四维超声可提供动态的容积测量数据，包括整个心动周期中的径向位移、表面积应变和纵向应变。在血管系统中，质谱成像与超声技术可用于评估血管壁成分、血流动力学及血管壁动态变化。该方法可通过调整感兴趣的功能指标和/或改变MALDI质谱成像方案以靶向特定分子，从而适用于多种心血管疾病的研究。MALDI质谱成像可用于分析脂质、小分子代谢物、多肽和糖类。本方案概述了MALDI质谱成像在非靶向脂质组学分析中的应用，以及超声成像在心血管血流动力学与生物力学研究中的使用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心血管疾病（CVD）是全球范围内导致死亡的主要原因1。预防和治疗心血管疾病需要深入理解分子对生物力学力的适应性变化，以及由此引起的机械性能改变。在整个心血管系统中，生物力学力在组织的功能和结构中起着重要作用2。心血管（CV）组织的机械性能受到这些力学因素的影响，因此可作为健康与疾病的指标3,4,5,6。为了预防、诊断和治疗心血管疾病，开发用于理解与观察疾病起始和进展过程的方法至关重要。生物医学成像在获取生理学和机制性认识方面发挥了关键作用，新的成像技术和分析方法也正在不断涌现。本实验方案展示了一种将两种心血管成像与分析技术相结合的方法，以验证这些成像模式在缺血性心脏病和血管老化研究中的潜力。

生物力学领域的研究人员通常结合体内、离体和计算机模拟的方法来开展生物力学研究。以往的分子生物力学研究主要集中在蛋白质7（尤其是对生物力学特性具有重要影响的细胞外基质蛋白胶原蛋白和弹性蛋白），而将体内成像生物力学与分子研究相结合的工作则仅限于组织学和免疫组织化学。尽管这些方法能够提供多种分子指标，并已提出细胞外基质和细胞重塑的可能机制，但它们通常分别受限于现有染料或抗体的可用性。该研究领域尚缺乏对许多大类分子的系统研究，例如脂质。尽管这些分子类别是否直接参与力学机制尚不明确，但理解其引发的分子适应性变化仍然至关重要，因为这些分子可能成为诊断标志物和治疗干预的潜在靶点。可应用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）等分析化学方法；然而，这些技术会丢失分子在组织中的空间定位信息。而质谱成像技术（MSI）能够保持分子的空间分布完整性，并可通过连续切片对多种分析物类型（分子类别）进行成像。MSI是一种强大的分析工具，可用于研究生物组织中几乎所有类型分子的空间分布，包括代谢物、脂质、糖类、肽段以及小分子药物8。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）MSI是MSI的一种，特别适用于发现性分析分子量范围在50–8000 Da之间的分子。MALDI-MSI是一种离子化技术，通过向样品施加可吸收激光能量的基质，以促进目标分析物的离子化。该方法避免了局限于单一分子靶点的局限性，并可结合生物信息学工具，识别哪些分子对生物力学特性和组织重塑具有影响。

四维超声（4DUS）是一种非侵入性技术 体内 一种可用于心脏时空特征分析的方法。4DUS 采用来自不同切面的一系列高帧频动态图像循环，将其整合为包含时间信息的三维数据集。这使得能够直接可视化并量化心脏腔室在整个心动周期中复杂的三维形态变化，而无需依赖传统二维超声心动图所需的几何假设。4DUS 能够实现 体内 从心脏复杂的形态和运动中计算功能指标9,10，且MALDI质谱成像技术可实现对心脏组织内生物分子的空间研究 离体11为了充分理解心血管疾病（CVD）中心脏的改变，需要对机械和分子机制进行研究。因此，本文提出一种结合四维超声（4DUS）成像分析与心脏脂质基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）的联合方法，用于研究小鼠心脏的病理生理学。该方法在小鼠心肌梗死模型中得以验证。

血管生物力学在调节心血管功能方面也起着关键作用2。与衰老相关的血管硬化是心血管疾病（CVD）的一个风险因素12。血管中的生物力学和血流动力学变化可通过超声成像进行观察。血管壁的分子组成是生物力学的重要组成部分，同时也对血流动力学力极为敏感。例如，振荡性管壁剪切应力已被认为与动脉粥样硬化斑块的形成有关3。后续将展示老年动物血管力学和血流动力学的初步数据。

该团队致力于研究不同疾病状态下生物力学与分子组成之间的关系。利用临床前超声成像和质谱成像（MSI）技术，确定组织中分子变化的空间分布以及疾病进展过程中相关的生物力学改变。本报告详细描述了这些方法，并展示了针对头颈部心脏及血管系统的初步研究数据。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所述动物实验已获得田纳西大学诺克斯维尔分校机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 超声成像13

  1. 设置与动物准备
    1. 实验开始前，检查异氟烷麻醉水平，必要时补充。打开气体前检查氧气罐压力。称量活性炭并记录其重量于容器上。
    2. 在成像平台附近放置所需物品，布置成像区域。物品包括预裁胶带、脱毛膏、纱布、棉签、高压灭菌水、角膜润滑剂、润滑凝胶、直肠温度探头、电极导线、超声耦合剂、电极凝胶（如适用）以及加热灯（图1A）。
    3. 打开超声设备并初始化电机（该系统也可采集4D超声图像数据）。在超声系统上建立新实验：选择新建研究或新建序列，并填写小鼠信息。打开生理监测平板。
    4. 检查三通阀，确保气流通向诱导箱，而通向鼻罩的通道关闭。通过将蒸发器氧气流量设为1 L/min，并将异氟烷旋钮调至3%-5%，预先填充麻醉诱导箱。
    5. 从小鼠饲养笼中取出动物。
    6. 将小鼠放入诱导箱，直至其完全麻醉，异氟烷浓度维持在3%-5%。
    7. 切换三通阀，使气流转向超声成像板上的鼻罩。将异氟烷旋钮调至1%-2%。
    8. 从小鼠诱导箱中取出动物并称重，记录体重。
    9. 将小鼠仰卧位放置于成像板上。
    10. 向动物眼睛涂抹角膜润滑剂。
    11. 如有毛发，使用市售脱毛膏和棉签去除成像区域的毛发。用浸水海绵擦拭皮肤，清除残留脱毛膏，防止灼伤。
    12. 根据动物体位，将心电图（ECG）电极导线皮下插入胸部两侧及后肢。
      1. 插入后，用胶带固定ECG导线。若不使用ECG导线（即未插入ECG导线），则通过动物成像板监测ECG。
      2. 为实现皮肤与成像板之间的电传导，在板上点涂导电凝胶，并固定动物四肢位置。
    13. 使用胶带或环绕成像板并覆盖四肢的弹性带固定动物四肢（图1B）。
    14. 使用润滑凝胶插入直肠温度探头，并用胶带固定探头。
    15. 在平板上检查ECG、呼吸和温度信号。确保心率约为350–600 bpm，呼吸频率约为50–100 次/分钟，直肠温度在35–37 °C之间。根据需要调整异氟烷浓度。
    16. 如有需要，打开加热灯（例如250 W红外加热灯泡）14，并调节高度以维持核心体温（图1C）。
      1. 加热灯与动物距离不得小于12英寸。在初步研究中为确定灯泡与动物之间的最佳距离，可调节高度，并使用红外测温仪记录皮肤温度，该温度不应超过42 °C15。
  2. 心脏4D超声
    1. 将换能器置于支架中，保持半锁定状态。
    2. 将换能器上的凸起点与屏幕上的蓝点对齐。通常将该点朝向动物右侧。
    3. 旋转换能器，使其沿小鼠矢状面方向定位，凸起切口指向尾侧。
    4. 使用超声板底部的杠杆调节动物倾斜角度；使用换能器底部的杠杆调节换能器角度。
    5. 在胸腔腹侧表面涂抹足量超声耦合剂，以实现皮肤与换能器之间的声学耦合。耦合前确保无残留毛发。
    6. 降低换能器，使其接触超声耦合剂。
    7. 使用成像板底部的X/Y调节旋钮进行微调，或移动整个成像板进行大幅调整。
    8. 确保胸骨旁长轴切面图像在屏幕上水平显示心尖、左心室流出道和主动脉，以便获得更准确的短轴图像（图2A、B）。
    9. 点击屏幕角落的命名图像，将图像保存至当前序列。
    10. 顺时针旋转换能器90°，切换至胸骨旁短轴切面（图2C）。
      注：为获得最佳4D图像质量，用户应尽量将步进电机沿心室的胸骨旁长轴对齐，该轴并不总是与胸骨完全平行。心脏/左心室通常呈向左下方倾斜的角度。
    11. 确保左心室位于屏幕右侧，右心室位于屏幕左侧（图2D）。
    12. 若小鼠呼吸节律稳定，点击图像左上角的EKG框，开启4D图像的呼吸门控。若节律不稳定，则在后期处理中完成此步骤。
    13. 点击屏幕左上角的立方体图标，设置4D图像采集。
    14. 在调整换能器的起始和终止位置前，重置换能器。
    15. 将起始位置调整至心尖稍下方，终止位置调整至主动脉弓。
    16. 设置步长为0.08–0.13 mm，帧率为200–300 Hz。
      注：较小的步长可提供更佳的图像分辨率，但会延长采集时间。若数据采集时左心室对齐近乎完美，且分析过程中无需或仅需极少重新定位，则可接受较大的步长。当动物心率较高（>450 bpm）时，应考虑提高帧率。
    17. 在开始扫描前，确保生命体征和EKG信号持续稳定（>350 bpm，呼吸频率高于50 次/分钟）。
    18. 扫描及处理完成后，开启保存EKV/4D数据用于后期处理和呼吸门控功能。
    19. 点击右下角的命名图像，并在名称中包含小鼠编号。
    20. 为检查图像质量，点击更多控制，选择加载至4D。
    21. 逐一切面查看心脏图像，确保在整个心动周期中心脏中心无移动。中心移动表明EKG和/或呼吸门控存在变异，从而增加分析难度。必要时重新调整监测设备并重复扫描。
  3. 心脏4D超声分析
    1. 进入研究浏览器。将所有B模式2D图像导出至Vevo Lab，并将4D数据以其他文件类型导出，选择“.raw”数据格式保存至硬盘。
      注：本研究中使用的4D图形用户界面工具箱目前尚未公开。如需获取访问权限及详细说明，请联系普渡大学Craig Goergen博士。
    2. 使用VevoLab软件对4D数据进行替代性分析。使用该框架时，需将4D数据从设备导出为Vevo Lab文件格式。
  4. 血管成像
    1. 对颈动脉进行B模式成像时，将超声换能器平行于颈动脉放置，靠近中线位置。
    2. 当颈动脉可见后，将换能器向头侧移动以寻找颈动脉分叉。
    3. 找到清晰的颈动脉分叉图像后，将增益设置为35 dB，并采集B模式图像。
      1. 向左或向右倾斜换能器可能改善图像质量。调整换能器或平台角度，使目标血管不与换能器完全平行，从而保持多普勒角度低于60°。否则，可能需要进行±15°的校正。
    4. 切换至脉冲波多普勒模式以获取速度测量值。
    5. 将取样容积置于血管中心。调整光标角度，使其与颈动脉平行。然后点击播放开始速度测量，点击保存记录数据。
    6. 对颈静脉进行B模式成像时，将超声换能器平行于颈静脉放置。颈静脉位于颈动脉的前外侧。
    7. 找到颈静脉后，将换能器移至颈内静脉与颈外静脉汇合处。当获得清晰图像后，将增益设置为35 dB，并采集B模式图像。
    8. 切换至脉冲波多普勒模式以获取速度测量值。
    9. 将取样容积置于血管中心。调整光标角度，使其与颈静脉平行。然后点击播放开始速度测量，点击保存记录数据。
  5. 血管超声分析
    1. 采集B模式图像和脉冲波多普勒测量数据后，使用软件测量血管直径和血流速度。
    2. 将图像加载至软件后，选择血管分析包。
    3. 选择血管两侧边界以获取完整直径。
    4. 对于颈动脉，使用血管分析包中的直径选项，在收缩期和舒张期分别测量直径。
    5. 使用血管分析包中的速度选项进行速度测量。
    6. 对于颈动脉，选择收缩期的最高峰值进行速度测量，选择舒张期的最低峰值进行速度测量。
    7. 利用直径测量值，通过以下公式计算格林-拉格朗日应变张量的周向分量：
      显示应变分析的公式；Eθθ = (1/2)((Ds²/Dd²) - 1)，与材料应力计算相关。     (1)
      其中Ds 表示收缩期直径，Dd 表示舒张期直径。
    8. 对于颈静脉，可在心动周期中任意点选取数据以获取速度测量值。

2. 安乐死与组织采集

  1. 准备铝箔船用于组织的速冻（图3）。
  2. 在研究结束时，通过5%浓度的异氟烷过量麻醉处死动物，并辅以双侧气胸或颈椎脱位（仅心脏研究）。
  3. 使用镊子将皮肤提起成帐篷状，在颈部区域用剪刀剪开帐篷状皮肤以暴露血管，或在胸骨下方剪开以暴露心脏。
  4. 切开皮肤和肌肉层以暴露血管，或切开骨骼以暴露心脏。
  5. 使用棉签进行钝性分离，将心脏或血管从周围组织（包括脂肪）中分离出来。务必分离颈动脉与神经。使用手术器械取出心脏和血管。
    注意：可在切除血管前，于近端和远端缝线，以辅助血管的移除。
  6. 将组织置于预先标记好的铝箔船上，并将铝箔船放入液氮中（图3）。
  7. 将组织储存于-80 °C，直至进行冷冻切片。运输过程中使用干冰以维持低温。

3. 质谱成像

  1. 冷冻切片及在载玻片上使用最佳切割温度（OCT）包埋
    1. 将冷冻切片机温度设为 -25 °C，并安装刀片。
    2. 在金属样品头（chuck）上涂抹OCT，放入冷冻切片机中冷冻，以备使用。
    3. 使用OCT将心脏基底部固定在已准备好的金属样品头上（图4A）。注意避免OCT接触待测组织区域，因为OCT会污染质谱信号（聚乙二醇[PEG]污染），并抑制目标脂质信号。
      注：可选择采用水贴片法以避免样本污染。详见下方附加方案。
    4. 由于本方法对空间对齐要求较高，应参考MATLAB图形用户界面（GUI）提供的标定后心脏数字图像来指导切片（图4B）。
    5. 切片过程中记录每次旋转（10 µm），并记录每片组织在载玻片上的切片深度（以毫米为单位）。
      注：为准确匹配MATLAB提供的超声数据数字图像，必须准确记录心脏或血管系统中的特定位置。
    6. 将组织切片（厚度10 µm）以融霜贴片法贴附于显微镜载玻片上。
      注：所用载玻片类型取决于所使用的质谱仪。每张载玻片应包含心脏各区域的一个切片。每组至少需要三张载玻片（正离子模式、负离子模式、备用）。
    7. 当每组n = 1时，沿心脏长轴方向切片，以观察从心尖至基底部的分子变化。
    8. 对于血管组织，切片前应将其包埋于明胶中并进行速冻11。
    9. 将载玻片存放在-80°C的玻片邮寄盒中，直至进行质谱成像实验。
    10. 若需进一步通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）鉴定和定量脂质或代谢物，应连续切取约60–100 µm厚的组织切片，并在冷冻前收集至0.5–2 mL离心管中。
  2. 冷冻切片及在载玻片上采用水贴片法
    1. 用高效液相色谱（HPLC）级水装满烧杯，并将5 mL和1 mL注射器置于一旁备用。
    2. 将冷冻切片机温度设为 -25 °C，并安装刀片。
    3. 将一对镊子放入冷冻切片机中预冷，以备贴片使用。
    4. 用注射器吸取5 mL HPLC水，放入冷冻切片机中。
    5. 在注射器内水即将完全冻结前，将水倒出至金属样品头表面，并使其完全冻结。
    6. 用注射器吸取1 mL HPLC水，并将注射器放回冷冻切片机中。
    7. 约30–60秒后，在样品头中心滴加一小滴部分固化的水。立即用镊子夹取心脏并将其置于水滴中，在水完全冻结前固定心脏位置，直至周围水完全冻结。
      注：可根据感兴趣区域选择用心尖或基底部贴片。本研究中，将基底部贴附，心尖朝外。
    8. 本方法其余步骤请参照步骤3.1中的描述进行。
  3. 基质喷涂
    1. 从冰箱中取出载玻片，放入干燥器中，直至玻片完全干燥。
    2. 开启HTX M3+喷雾仪，在笔记本电脑上打开HTX应用程序，点击屏幕中央的方法。标准基质浓度可在已存储的方法中找到（屏幕左侧的方法 > OI_usermethods > matrix）。
      1. 本实验中，喷嘴温度设为75 °C，流速设为100 µL/min，压力设为10 psi。
    3. 在实验记录本中记录样本名称、电离极性、基质种类、溶剂及浓度。计算每种浓度所需的基质量（例如，5 mL浓度为10 mg/mL的溶液需50 mg基质）。
    4. 配制溶剂（例如，70%甲醇）。
      1. 本实验中，正离子模式使用40 mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质溶液，负离子模式使用10 mg/mL的9-氨基吖啶（9AA）基质溶液。两种基质均使用70%甲醇作为溶剂。其他常用基质及喷涂参数请参照步骤3.3.2。
    5. 称取基质并加入15 mL锥形管中。确保质量接近步骤3.3.3中计算的所需量，但无需完全精确。根据实际称量质量计算所需溶剂量。
    6. 使用移液器将溶剂加入锥形管中。
      注：溶剂体积基于步骤3.3.5中测得的质量确定。
    7. 超声处理混合液10分钟。在基质超声过程中，从干燥器中取出载玻片。
    8. 打开喷雾仪托盘，将载玻片置于左下角，并用胶带固定边缘。
      注：胶带一端可折叠，便于后续移除。
    9. 选择样本喷涂区域。关闭托盘。
    10. 使用注射器和滤膜，将基质溶液倒入注射器，通过滤膜过滤至喷雾仪左侧带黑色盖子的样品瓶中。
    11. 将样品瓶放回喷雾仪原位，并将D型管插入瓶中。
      注：确保管子未接触瓶底，且完全浸入液体中。
    12. 开启惰性气体，确保喷雾仪压力表读数为10 psi。点击开始。待喷雾仪达到设定温度后，点击闪烁的开始按钮。
    13. 喷涂完成后，打开托盘，取出样本，放入MALDI载玻片架或重新放回干燥器中（图4C）。
    14. 使用扫描仪扫描MALDI载玻片架和载玻片，或用手机拍照。将图像保存至U盘，供质谱成像（MSI）使用。
    15. 在喷雾仪上选择适当的清洗或下一次喷涂程序。若进行清洗，需将D型管从基质瓶移至废液烧杯中。
    16. 向托盘喷洒甲醇并擦拭清洁。关闭氮气。
  4. MALDI质谱成像（MSI）
    1. 在计算机上进入Synapt软件，检查电离极性是否设置为所需模式，若未设置则进行更改。
    2. 将载玻片装入MALDI离子源，并在计算机上使用软件点击加载按钮。
    3. 将图像（步骤1.2.17）移至项目文件夹中的图像文件夹。
    4. 进入HD Imaging软件，打开先前项目（使用相同基质的项目）。
    5. 在实验记录本中记录质量范围、捕获和传输碰撞能量、激光能量、负/正离子模式。
    6. 在HD Imaging中，点击白色页面图标，然后点击下拉箭头并选择新建板。
    7. 浏览至项目文件夹 > 图像文件夹，找到图像并打开。
    8. 将板类型更改为MALDI标准，并定义板的边缘（选择下方以红色加号标示的四个角）。
      注：左上框用于导航至各角点，右上框用于选择角点，下方框用于整体观察载玻片。
    9. 在左上角找到较小的图案标签，点击铅笔或其他矩形或圆形选项以勾勒组织轮廓。使用左键点击勾勒组织，右键点击结束。
    10. 像素大小默认为50 µm。如有需要可进行更改。
    11. 点击另存为，导航至项目成像采集文件夹，以载玻片名称命名（YYYYMMDD格式），然后保存。
    12. 点击顶部中央的Mass Lynx按钮，导出至Mass Lynx软件。
    13. 进入Mass Lynx软件。
    14. 点击文件 > 打开项目文件夹。将文件名和文本名更改为载玻片名称（YYYYMMDD格式）。
    15. 右键点击MS文件，浏览并选择当前载玻片。
    16. 再次右键点击MS文件，点击编辑。双击蓝色框。
    17. 进入扫描条件设置。找到源设置并更改为用户自定义。然后导航至正确的项目文件夹 > 采集文件夹 > 当前载玻片 > 确定。
    18. 点击另存为进行保存，并包含载玻片名称。
    19. 使用参考化合物（例如红磷）对仪器进行校准
      1. 进入Synapt（校准）界面。点击播放按钮开始采集数据。命名为YYYYMMDD_cal1（例如：20230614_cal1）。
      2. 确保质量范围与项目一致（50–2000）。激光能量可设为约175。
      3. 点击发射激光的播放按钮，然后点击下一步。运行至约15或20次后，点击红色停止按钮。
      4. 进入W Console界面。
      5. 创建校准文件并点击开始。在校准谱图编辑器中，点击文件 > 新建。输入YYYYMMDD_cal1。
      6. 将质量范围编辑为项目所需的质量范围（例如50–2000）。
      7. 选择手动校准。选择分辨率模式并点击编辑。选择红磷作为参考化合物。
      8. 点击原始数据文件，并滚动至最底部（应为刚刚采集的数据）。
      9. 进入底部历史记录，选择精确质量 > 确定 > 确定。
      10. 持续点击下一步和确定，直至出现开始按钮，点击开始。
      11. 进入绿色对勾界面，查看未找到的峰。
    20. 进入Mass Lynx（开始实验样本的实际运行）。
    21. 点击播放按钮，检查样本数量是否正确。
    22. 进入HD Imaging软件。
    23. 检查像素大小是否仍为最初设定值。
    24. 进入Synapt软件检查电离极性。
    25. 点击相机按钮，确认仪器正在移动并发射激光。
    26. 检查是否正在采集数据。采集到的质谱应在Synapt页面上显示。
  5. 质谱分析
    1. 使用HD Imaging软件和Mass Lynx软件进行数据分析。
    2. 在HD Imaging中使用处理选项卡处理成像数据。
    3. 在HD Imaging的分析选项卡中查看分子离子图像（也称质谱图像）。分子离子图像的热图显示特定m/z离子在区域内的强度分布（图5）。使用质谱图像叠加图展示分子的空间分布（图6和图7）。
    4. 使用总离子流（TIC）或适用于成像的其他归一化方法对数据进行归一化。
    5. 识别与感兴趣区域在空间上相关的m/z峰。在HD Imaging中运行空间相关性分析（R > 0.65），以识别共定位峰。
    6. 使用LipidMaps16和METASPACE17对这些峰进行潜在脂质鉴定。
    7. 通过后续LC-MS数据验证脂质注释。使用Metaboanalyst对LC-MS数据进行统计分析。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上述成像方案已用于两项初步研究：心肌梗死（MI）重塑和血管老化。在心脏实验中，通过永久性冠状动脉结扎手术诱导急性心肌梗死18,19。对同一样本依次进行四维超声（4DUS）和基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI），以揭示其生理和分子层面的变化。代表性的心肌梗死心脏中的分子离子图像见图5。质荷比（m/z）577.52被初步鉴定为Cohibin C或D。尽管仍需进一步分析（如LC-MS或串联质谱）以确认分析物身份，但Cohibin已在牛心脏中被发现20，并可能提示组织重塑过程21,22。心室结构与功能的变化也可能与特定区域靶向脂质的上调或下调相关（图6）。在4DUS图像中，颜色谱的绿-黄色端表示表面应变幅度低于20%的组织，对应于梗死...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

超声成像可能受操作者影响，但通过使用解剖标志和充分的培训可减少操作者偏差。二维超声尤其容易受不同操作者之间的变异性影响，因为其成像角度依赖性强；而四维超声由于采集覆盖整个容积且不受角度影响，因此受影响较小。研究还发现，由于可调节的动物平台和探头支架的存在，图像的可重复性更容易实现。为了防止因技术差异导致数据变化，超声数据的采集 ideally 应在整个研究过程中由同一名研究人员完成。

维持核心体温非常重要，因为温度变化可能改变心血管血流动力学和生物力学测量结果28,29,30,31。 除了成像用的加热板外，还建议使用外部加热装置（如加热灯），如图1所示。用户可调节该加热灯，以维持直肠温度在37 °C。

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披露

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Craig J. Goergen 是 FUJIFILM VisualSonics 的付费顾问。

致谢

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Allison Jones 由田纳西大学机械与航空航天工程系支持 & 生物医学工程系研究生奖学金。本出版物中报告的研究（Conner Earl）得到了美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所F30HL162452基金的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,5-二羟基苯甲酸 （DHB）Supelco，  >99.0% （HPLC）85707-10MG-FDHB 基质物质，用于 MALDI-MS;https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/85707?cm_sp=Insite-_-wimsShippingEmailRecs_wims
EmailAPI_wimsGruCrossEntropy-_-wims电子邮件API10-3
9-氨基吖啶 （9AA）Supelco，  ≥99.5% （HPLC）92817-1G用于 MALDI-MS 的 9-氨基吖啶基质物质;https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/92817?srsltid=AfmBOooiQjQ4pWv_XxITkU
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水声波超声凝胶Parker LaboratoriesParker 01-02超声凝胶;https://www.parkerlabs.com/products/aquasonic-100-ultrasound-transmission-gel/
台式杜瓦瓶ThermoScientific 4150-2000液氮容器;https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4150-4000?gclid=Cj0KCQjwpvK4BhDUARIsA
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低温恒温器Leica BiosystemsCM 系列https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/
DessicatorVWR 89054-052https://us.vwr.com/store/product/9104882/desiccator-plastic-ace-glass-incorporated
Epredia MX35 Premier 一次性低调 切片机 叶片Fisher Scientific3052835低温恒温器叶片;https://www.fishersci.com/shop/products/mx35-premier-disposable-low-profile-microtome-blades/3052835
Falcon 15 mL 锥形离心管Fisher Scientific14-959-53A锥形管;https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/1495953A?gclid=Cj0KCQjwpvK4BhDUARIsA
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Flex-Tubes 微量离心管Eppendorf EP022364120离心管;https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ep022364120?utm_source=google%2Cgoogle&utm
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气体 氮空气N/A
玻璃显微镜载玻片显微镜科学71873-02https://www.emsdiasum.com/positive-charge-microscope-slides
液氮空气气N/A
质谱仪WatersSynapt G2-Sihttps://www.waters.com/waters/en_US/SYNAPT-G2-Si-Mass-Spectrometry/nav.htm?locale=en_mkcid=1000251Foodety%3C/a%3E&cid=134740653&bcid=
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基质喷雾器HTX TechnologiesM3+https://www.htximaging.com/htx-m3-sprayer
甲醇 （HPLC），>99.9%Fisher Chemical A4524甲醇;https://www.fishersci.com/shop/products/methanol-hplc-fisher-chemical-9/A4524?crossRef=A4524#?keyword=A4524
临床前超声系统 FUJIFILM VisualSonicsVevo 3100https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-3100;Vevo F2 已取代生产中的 Vevo 3100。系统包括异氟醚蒸发器和感应箱。
雷诺兹包装N/AN/A铝箔
标牌 电极凝胶Parker LaboratoriesParker 15-60导电凝胶;https://www.parkerlabs.com/products/signagel-electrode-gel/
无菌润滑果冻Medline MDS032273Z润滑凝胶;https://www.medline.com/ce/product/Sterile-Lubricating-Jelly/Lubricating-Jelly/Z05-PF03664?sku=MDPMDS032273H
手术器械：剪刀、镊子/镊子、缝合Fine Science Tools11252-00、11050-10、14016-14、14084-08、15000-08info@finescience.com
手术海绵 200 包 –纱布垫非无菌 - 急救伤口护理敷料海绵 –编织医用不粘，非粘附网状擦洗Medpride B08RZGQ5GW;https://www.amazon.com/Medpride-Surgical-Sponges-200-Pack/dp/B08RZGQ5GW/ref=asc_df_B08RZGQ5GW/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&h
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888d565a63b0
组织加O.C.T.化合物 Fisher Scientific23-730-571OCT; https://www.fishersci.com/shop/products/tissue-plus-o-c-t-compound-2/23730571
木柄棉签和涂抹器Fisherbrand 22-363-160棉签;https://www.fishersci.com/shop/products/wood-handled-cotton-swabs-applicators-8/p-7146852
气 电子电极线 纱布

参考文献

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