本方案描述了一种诱导三龄幼虫（预滞育幼虫，JⅢ的 松材线虫 通过氯化钾（KCl）离子的渗透调节进入隐生状态。该方法可为研究生物抗逆机制提供技术支持 B. xylophilus.
本文内容
摘要
摘要
隐生是一种生物在极端环境胁迫下几乎失去全部体内水分并进入干燥保存状态的现象。扩散性第三阶段幼虫（前dauer幼虫， 
的 Bursaphelenchus xylophilus 可通过脱水进入隐生状态，并在环境条件改善时通过再水化恢复活力。在此过程中，渗透调节对其生存至关重要。本研究中，样本 B. xylophilus 从死亡个体中收集 马尾松 中国浙江省宁波市因松材线虫病导致松树枯萎。经8%氯化钾（KCl）溶液浸泡后， B. xylophilus 在自然水分蒸发导致外部渗透压逐渐升高后，进入隐生状态。 B. xylophilus 能够耐受 - 的低温胁迫20 °C. B. xylophilus 在重新水化后能够复苏，存活率达到92.1%。该过程可调节物质进入 B. xylophilus 进入隐生状态，使其能够抵抗极端环境。本研究所述方法简便可靠，为研究生物抗逆机制提供了技术支持 B. xylophilus.
引言
松材线虫病是中国最严重的森林病害之一1。松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus，B. xylophilus）可在寄主植物内繁殖，对马尾松（Pinus massoniana，P. massoniana）等松树物种构成严重威胁，导致植株迅速萎蔫并死亡。当寄主死亡后环境条件不利时，B. xylophilus 的繁殖性幼虫可能转变为滞育型幼虫（）。这些幼虫会寻找昆虫媒介以实现进一步传播和扩散，从而导致大面积松林死亡2。
隐生是一种生物在极端环境胁迫下几乎失去全部体内水分并进入干燥休眠状态的现象3。在此过程中，生物体逐渐脱水，导致运动停止、代谢减缓以及生命周期的暂停4。在适宜条件下，它们可通过重新吸水恢复生命活动。隐生使生物能够抵抗低温等极端环境，并延长其寿命5。在南极永久冻土中已发现处于隐生状态存活达30,000年的线虫6。
先前的研究表明，线虫在脱水过程中可通过调节体表通透性来适应多种非生物胁迫，例如低温、干旱和高渗透压7。此外，线虫还可通过蜷缩身体以减小表面积，从而降低水分流失速率。例如，Caenorhabditis elegans 可调节渗透平衡，使离子和小分子自由通过其角质层，而大分子则不能8。 B. xylophilus 也表现出隐生现象。在隐生过程的脱水与再水化阶段，渗透调节对于控制物质经角质层的交换至关重要，是进入或恢复隐生状态的关键机制9。
本研究介绍了一种诱导隐生状态的方法 B. xylophilus 通过渗透调节。该方法简单、高效且高度可靠，为研究生物的抗逆机制提供了技术支持 B. xylophilus.
方案
1. 采集 JIII B. xylophilus
- 感染椎间盘的采集 P. massoniana
注意：所有操作均符合《松材线虫病疫区和疫木管理办法》及其他适用法规。 P. massoniana 受感染的森林 B. xylophilus 位于中国浙江省宁波市象山县的采样点被选为样本采集地点。 P. massoniana，因松材线虫病死亡的松树在采样点内被砍伐。- 从被砍伐树木主干的上部、中部和下部采集直径为5 cm的圆形原木。
- 切割采集的原木段 P. massoniana 切成0.5-1厘米厚的片状，然后修整成2-3厘米长的小条。
- 将小木条放入密封袋中，并在实验室中保存以备后续使用。
- 提取 B. xylophilus
- 将一根橡胶管连接到长约颈玻璃漏斗（直径约15 cm）的窄口端，用止水夹固定橡胶管，将组装好的漏斗置于漏斗架上。
- 用单层纸巾完全包裹小木条，然后将其放入漏斗中。向漏斗中加入蒸馏水，直至所有木条完全浸没。
注意：静置12–24小时后，线虫从木条中迁移出来并沉降至漏斗底部10卫生纸可防止木屑沉降，同时允许线虫通过。 - 缓慢打开漏斗底部的夹子，让2000-5000 µL 将混合物渗入一个直径为5 cm的培养皿中，用于显微镜检查和形态学鉴定。
- 识别 B. xylophilus 通过观察矛状结构、食道中球、脂滴以及“指状”尾部形态等特征11.
- 在显微镜下，转移单个 B. xylophilus 通过吸取至载玻片上 10 µL 液体以及一条线虫，使用一个 10 µL 每次移液，重复此过程30次，以收集约 300 µL 含有线虫的混合物。
- 提取后 B. xylophilus，对剩余的木条和受感染的木材材料进行灭菌，以防止进一步污染。
2. 渗透调节过程控制
- 渗透调节混合液的制备
- 配制8%的KCl水溶液。
- 用移液器将10 µL的8% KCl水溶液加入含有 B. xylophilus的载玻片中，得到约310 µL的线虫与KCl溶液混合液。
- B. xylophilus的渗透压升高与脱水调节
- 将载玻片置于显微镜载物台上，使水分自然蒸发。周围环境的渗透压将逐渐升高，导致线虫在约30–60分钟内脱水。
注：操作者只需等待水分自然蒸发至KCl晶体析出，并在显微镜下观察线虫状态。约310 µL的混合液自然蒸发至KCl晶体析出需时约30–60分钟。 - 在显微镜下观察 B. xylophilus的脱水过程（如虫体卷曲、聚集等）。当水分完全蒸发且KCl晶体析出时， B. xylophilus停止运动并进入隐生状态。
- 将载玻片置于显微镜载物台上，使水分自然蒸发。周围环境的渗透压将逐渐升高，导致线虫在约30–60分钟内脱水。
- 隐生状态 B. xylophilus的低温胁迫处理
- 将处于隐生状态的 B. xylophilus置于-20 °C恒温环境中处理24小时。
- 将处于隐生状态的
- B. xylophilus的渗透压降低与再水合调节
- 用移液器在经低温处理的幼虫周围加入约300 µL蒸馏水。再水合过程持续约30–60分钟，其周围环境的渗透压逐渐降低。
- 在显微镜下观察 B. xylophilus的再水合过程（如虫体伸展、恢复运动等）。24小时后计算存活率。
结果
在8% KCl溶液中，随着水分蒸发， B. xylophilus 最初表现出明显的“卷曲”现象，但仍保持活动能力（图1A）。当水分完全蒸发后，线虫停止运动并进一步卷曲，表面凹陷且脂滴聚集（图1B），表明其已进入隐生状态。当向其周围环境加入蒸馏水后，线虫重新吸水并恢复活动（图1C）。水分蒸发后，将出现KCl晶体（图1D）。图1E展示了 B. xylophilus 的形态学特征。
脱水实验表明，在初始浓度为8%的KCl溶液中，水分蒸发导致 B. xylophilus 失去水分。脱水后， B. xylophilus 在-20 °C下经受24小时的低温胁迫，平均存活率为92.1%11。与未进入隐生状态的对照组0%的存活率相比，上述数据表明脱水可显著提高 B. xylophilus 在低温条件下的存活率。
在隐生状态后的复水阶段 B. xylophilus，我们观察到，当线虫从40% KCl溶液转移至蒸馏水时，100%的线虫体内出现“气泡”现象图2).
图1：松材线虫（ B. xylophilus）的脱水—隐生—再水化过程。 本图像展示了松材线虫（ B. xylophilus）的隐生过程，包括（A）脱水阶段、（B）隐生阶段、（C）再水化阶段、（D）氯化钾结晶阶段，以及（E） B. xylophilus。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：未复苏状态下脂肪颗粒的积累 B. xylophilus. 此图像显示了状态 B. xylophilus 复水后，表现为存在 体内 泡状脂肪颗粒。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
本研究中，从浙江省宁波市的死亡P. massoniana中采集了 B. xylophilus。需要注意的是， B. xylophilus是从包含不同龄期的混合种群中筛选获得的。具体而言，选择含有高密度B. xylophilus的原木，随后进行 B. xylophilus的筛选。在冬季，当辽宁省日最低气温约为-20 °C时，可从死亡的Pinus tabuliformis中获得大量单一年龄阶段的 B. xylophilus，从而简化了本实验中的筛选过程12。
在隐生过程中，线虫缓慢的脱水速率有利于其存活，并防止其蛋白质结构受损13。脱水时间对决定 B. xylophilus的存活率至关重要。本研究中，初始使用浓度为8%的KCl溶液，并通过水分自然蒸发逐步提高其浓度，使 B. xylophilus缓慢脱水并进入隐生状态。若水分蒸发过快，或直接将线虫置于高浓度KCl溶液中，其存活率将显著下降。
本研究中描述的方法具有多项优势。实验材料易于获取，仅需氯化钾溶液和蒸馏水即可调控 B. xylophilus 的脱水与再水合过程。操作步骤简便：脱水通过自然蒸发完成，再水合则通过添加蒸馏水实现。整个过程可在2小时内完成。该方法具有较高的成功率和存活率，大多数 B. xylophilus 在脱水后进入隐生状态，且大部分个体在再水合后成功复苏11。
所提出的方法适用于调控两种隐生状态生物的生理状态 B. xylophilus 四龄扩散幼虫（
)14。然而，该方法可能对繁殖性 B. xylophilus.
近年来，由B. xylophilus引起的松材线虫病已从中国南方扩展至北方地区。 生活在这些较冷北方地区松树中的B. xylophilus，往往表现出更强的耐寒性15。本方法可诱导 B. xylophilus进入隐生状态，从而增强其对低温和干旱的抵抗能力。综上，该方法可为研究B. xylophilus的抗逆机制及松材线虫病的传播机制提供技术支持。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由林木遗传育种国家重点实验室中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（项目编号 CAFYBB2020ZY001-2）、企业科研项目（202404016-4320）和国家自然科学基金（NSFC 32271896）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 载玻片 | Bioland | GS7101-7525 | 75 mm × 25 mm × 1 mm |
| 长颈玻璃漏斗 | 南京康洛达实验技术 | N/A | 150 mm |
| 显微镜 | Phenix | XSP-35-1600X | PH100-2B41L-IPL |
| 培养皿 | 南京康洛达实验技术 | TB-624935792745 | 50 mm × 50 mm |
| 止水夹 | 南京康洛达实验技术 | TB-624973311743 | 36 mm × 11 mm × 55 mm |
| 移液器 | Eppendorf | 3123000012 | 10–100 µL |
| 氯化钾（KCL） | 索莱宝生物科技 | P9921 | 500 g |
| 橡胶管 | 南京康洛达实验技术 | TB-624923457094 | 7 mm × 5 mm |
| 灭菌器 | 滨江 | https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm= a2615.7691456.co_0_0_wangpu _score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0 | 75L |
| 纸巾 | 心心相印 | M3 | 22.5 cm × 21.5 cm |
参考文献
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