流式细胞术分析人血小板中组织因子的表达

摘要

本文概述了使用全血流式细胞术定量组织因子（TF）阳性血小板百分比的实验方案，用于检测该蛋白：（1）在静息状态下细胞内表达情况，以及（2）在静息和激活状态下细胞表面的表达情况。同时提供了在富血小板血浆中评估TF阳性血小板的指导方法。

摘要

一部分循环人血小板在细胞内储存组织因子（Tissue Factor, TF），TF是血液凝固级联反应和血栓形成的关键激活物。血小板活化后，TF暴露于细胞膜表面，与FVII结合，最终导致凝血酶的生成。鉴于（1）在多种临床情况下，TF阳性血小板水平升高，促进患者的促血栓表型；（2）不同药物可调节血小板相关TF的表达，因此建立一种评估TF阳性血小板的标准化方法具有重要价值，因为该指标的检测在过去存在争议。本文介绍了一种利用流式细胞术在全血及富血小板血浆（PRP）/洗涤血小板中测定TF阳性血小板百分比的实验方案。该方案旨在提供详细的实验步骤，用于定量检测TF阳性血小板的比例，包括在静息状态下检测细胞内TF蛋白表达，以及在静息和活化状态下检测细胞表面TF表达。第一部分提供了正确进行采血的关键信息，以确保分析前操作不影响实验结果。随后，方案重点介绍用于流式细胞术分析的样本制备与标记流程。详细说明了细胞刺激、标记、固定以及必要时的透化处理等步骤。最后，描述了流式细胞仪的设置方法，以准确识别血小板群体并分析TF阳性事件。此外，若需在分离的血小板中检测TF阳性血小板，本方法还包括制备PRP的操作步骤。由于仅有部分血小板含有TF，因此在制备PRP所需的离心步骤中，必须确保这些血小板不被丢失。

引言

组织因子（Tissue Factor，TF）是一种跨膜糖蛋白，是血液凝固级联反应的关键激活物，约20%-30%的循环人血小板亚群表达TF¹，尤其是体积较大的血小板²。当受到二磷酸腺苷（ADP）和凝血酶等经典血小板激动剂激活时，血小板以浓度依赖性方式在其表面暴露具有功能活性的TF，使其能够结合因子VII/VIIa，最终导致凝血酶的生成^1,3,4,5,6。值得注意的是，在冠状动脉疾病（CAD）⁷、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）感染⁸、伴有卵圆孔未闭的有先兆偏头痛（MHA-PFO）⁹、癌症¹⁰以及脓毒症¹¹等病理状态下，TF阳性血小板的数量显著增加，从而加剧了这些临床情况中观察到的血栓风险。

尽管存在这些有力的证据，血小板中组织因子（TF）阳性检测结果在科学界仍存在争议^6,12,13。文献中报道的结果相互矛盾，可能的原因包括方法学上的挑战，如分析前变量、样本制备以及抗体特异性等问题^2,4,12,14。因此，建立一种基于明确定义的操作流程、用于检测人血小板中TF的标准化检测方法至关重要。

在此背景下，全血流式细胞术是唯一能够在最小样本处理条件下分析组织因子（TF）阳性血小板的技术，这对于避免该血小板亚群的丢失至关重要。

本文提出了一种利用全血流式细胞术检测血小板相关组织因子（TF）的实验方案，该方案可评估（1）静息状态下血小板内的TF蛋白，以及（2）静息和激活状态下血小板表面的TF蛋白。此外，本文还提供了如需在富血小板血浆（PRP）中评估TF阳性血小板时的操作说明。

方案

本方案已获得机构伦理委员会批准（编号70/24，CE 18.06.24），并已从所有献血者处获得书面知情同意。该方案将指导使用者完成七个主要步骤（图1）。第一步介绍采血操作流程。步骤2和3概述了抗体滴定方案以及使用藻红蛋白（PE）标记的αCD142/HTF1单克隆抗体（mAb）分析细胞内组织因子（TF）表达的样本制备方法。步骤4描述了采用间接染色法，利用αCD142/HTF1单克隆抗体评估血小板表面暴露蛋白的方案。由于荧光染料的空间位阻效应，用于细胞内染色的PE标记单克隆抗体无法结合表面暴露蛋白的催化结构域。因此，提出使用Alexa Fluor 633标记的二抗进行间接染色的方案。步骤5和6详细说明了流式细胞术分析的各个阶段。最后一步概述了富血小板血浆（PRP）的制备流程，以避免大体积血小板亚群的丢失。所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。

1. 采血

注意：只有在获得伦理委员会批准后，方可进行人血采集。

1. 从未受外周静脉输液影响的手臂（优先选择肘前静脉）采集外周静脉血或通过针-套管采血。
   1. 进行外周静脉采血时，绑扎止血带，将19号蝶形针插入静脉后立即松开止血带，以防止血小板活化（图2）。
      注意：避免使用小于21号的蝶形针，以防血小板活化。
   2. 使用针-套管进行静脉采血时，采血过程中不得使用止血带。如有需要，采血前可用0.9%生理盐水冲洗管路。采集时务必弃去最初的5 mL血液，再开始收集用于检测的血样。
2. 将2 mL血液注入含EDTA的真空采血管（用于血细胞计数）。轻轻混匀试管3次，确保血液与抗凝剂充分混合。
3. 将血液注入含0.129 M枸橼酸钠的真空采血管，用于检测血小板相关组织因子（TF）的表达。需准确填充至管壁标注的刻度线，以维持正确的血液/抗凝剂比例。轻轻倒置试管5次，确保血液与抗凝剂充分混匀，防止凝血和溶血。
   注意：推荐使用0.129 M枸橼酸钠抗凝剂，以优化HTF1克隆的αCD142单克隆抗体对血小板相关TF的检测效果。若需从全血中分离血小板，应另采集一管0.129 M枸橼酸钠真空采血管，用于富血小板血浆（PRP）的制备。
4. 将真空采血管直立放置于试管架中。避免在旋转或倾斜的平台上振荡，禁止使用气动传送系统。切勿冷藏血液样本，以防血小板活化。
   注意：若需同时检测其他颗粒相关血小板活化标志物，建议在采血后15分钟内处理样本。否则，样本最迟应在采集后3小时内完成处理（图3）。

2. 抗组织因子抗体的滴定（用于细胞内组织因子评估）

注意：使用 PE-αCD142/HTF1 单克隆抗体检测细胞内储存的组织因子（TF）。

1. 使用微球进行抗体滴定
   注意：使用微球可确定应使用的正确抗体用量（即在阳性与阴性样本之间产生最大荧光峰分离度的抗体浓度）。该分析需使用两个样本，一个为真实阳性样本，另一个为真实阴性样本。由于制造商未提供抗体浓度信息（见材料表），因此需通过五个稀释梯度进行抗体滴定。
   1. 在 4 °C 条件下，以 17,000 × g 离心抗体 5 分钟。为制备五个抗体稀释梯度，用移液器将 40 µL 抗体加入第 1 管，将 20 µL PBS 加入第 2 至第 5 管。通过将 20 µL 液体从第 1 管转移至第 2 管，再依次进行后续转移，完成四次连续的 1:2 系列稀释。
   2. 为每个待测抗体体积准备一个测试管。向每根测试管中各加入一滴阴性微球和一滴阳性微球。向每根测试管中加入 20 µL 对应的抗体稀释液，立即涡旋混匀。室温避光孵育 20 分钟。
   3. 向每根管中加入 1 mL pH 7.4 的不含 Ca⁺⁺ 和 Mg⁺⁺ 的 1×PBS，涡旋混匀。
   4. 按照制造商说明在流式细胞仪上检测样本，并在“微球”门控中记录 10,000 个事件的数据文件。最佳抗体浓度即为能使阳性与阴性峰之间分离度最大的浓度。
2. 在血小板上进行抗体滴定
   注意：通常情况下，使用微球确定的最佳抗体浓度应在实际待染色细胞（本实验中为全血中的血小板）上进行验证。
   1. 固定
      1. 轻轻倒置含枸橼酸钠的真空采血管 5 次，充分混匀血液与抗凝剂。将 50 µL 血液转移至 1.5 mL 管中，加入 950 µL 1% 多聚甲醛（PFA），轻柔混匀后，室温孵育 90 分钟。
      2. 在室温下以 1,500 × g 离心 5 分钟（开启刹车）。
      3. 弃去上清液，用移液器轻柔吹打，将沉淀重悬于 1 mL pH 7.4 的不含 Ca⁺⁺ 和 Mg⁺⁺ 的 1×PBS 中。
   2. 透化
      1. 为每个待测抗体体积准备一根管（测试通过微球滴定确定的体积，以及更高和更低的稀释度，例如若确定体积为 5 µL，则测试 10 µL、5 µL 和 2.5 µL），另设一根管用于荧光减一（FMO）对照。
      2. 向每根管中加入 100 µL 固定后的血液，室温下以 1,500 × g 离心 5 分钟（开启刹车）。
      3. 弃去上清液，将沉淀重悬于 100 µL 0.1% Triton-PBS 中以实现样本透化，室温孵育 10 分钟。
   3. 染色
      1. 在 4 °C 条件下，以 17,000 × g 离心抗体 5 分钟。根据步骤 2.2.2.1 确定的体积，向各测试管中加入相应体积的抗体并混匀。
      2. 室温避光孵育 15 分钟。
      3. 向每根管中加入 300 µL pH 7.4 的不含 Ca⁺⁺ 和 Mg⁺⁺ 的 1×PBS，混匀。在流式细胞仪上检测样本（见步骤 5）。
      4. 根据以下公式计算染色指数¹⁵：
                                
         其中，MFI_pos 为阳性事件的平均荧光强度，MFI_neg 为阴性事件的平均荧光强度，SD 为阴性群体的标准差。
      5. 选择能够提供最高染色指数的最低抗体浓度。
         注意：在当前实验条件下，使用 5 µL 抗体时，PE-αCD142/HTF1 单克隆抗体可获得最高的染色指数。

3. 流式细胞术分析细胞内转录因子表达的样本制备

1. 全血固定与透化
   1. 对于细胞内组织因子（TF）分析，按照步骤2所述程序对全血进行固定和透化处理。
2. 染色步骤
   注意：在以下方案中，使用αCD61-PerCP染色来鉴定血小板群体。操作者可根据需要选择其他群体标记物。
   1. 准备一管用于荧光减一（FMO）对照，另一管用于TF染色。向每管中加入100 µL已固定并透化的全血，以及表1中列出的抗体。
   2. 将样本在室温下避光孵育15分钟。
   3. 向每管中加入300 µL不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的1x PBS缓冲液（pH 7.4），混匀。将染色后的样本避光保存，直至进行流式细胞术分析（见步骤5）。
      注意：为计算补偿矩阵，请按照表2中的说明制备样本。

4. 静息和活化血小板中细胞表面相关性组织因子表达的流式细胞术分析的样本制备

注意：检测细胞表面相关组织因子（TF）时，使用未标记的αCD142/HTF1单克隆抗体（1 mg/mL），并以Alexa Fluor 633标记的山羊抗小鼠IgG（2 mg/mL）作为二抗进行信号检测。采用腺苷5'-二磷酸（ADP）作为血小板激动剂，以诱导TF在细胞表面暴露。使用PE标记抗体作为血小板群体标记物，以最小化荧光信号溢出，该溢出将通过信号补偿进行校正。

1. 组织因子（TF）染色
   1. 将αCD142/HTF1单克隆抗体用不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的1×PBS（pH 7.4）按1:100稀释，获得工作浓度为10 µg/mL的溶液。将Alexa Fluor 633标记的山羊抗小鼠IgG用不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的1×PBS（pH 7.4）按1:10稀释，获得工作浓度为200 μg/mL的溶液。
   2. 准备三个样本管，并按照表3所示加入不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的1×PBS（pH 7.4）。
   3. 向每管中加入7.5 µL稀释后的αCD142/HTF1单克隆抗体，并加入5 µL ADP（200 μM），使ADP终浓度为10 μM。轻轻颠倒枸橼酸钠真空采血管5次，充分混匀血液与抗凝剂，然后向每管中加入5 µL全血。轻柔混匀各样本。
   4. 将样本在室温下孵育20分钟。
2. 样本固定
   1. 向每个样本中加入300 µL 1%多聚甲醛（PFA）进行固定，并在室温下孵育1小时。
      注：使用1% PFA固定的标记样本在4 °C保存可稳定长达4天。
   2. 向每管中加入300 µL不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的1×PBS（pH 7.4），在室温下以1500 × g离心5分钟（启用刹车）。
   3. 弃去上清液，用移液器轻柔吹打，将沉淀重悬于95 µL不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的1×PBS（pH 7.4）中。
3. 二抗染色
   1. 向每管中加入5 µL稀释后的Alexa Fluor 633标记IgG，在室温避光条件下孵育15分钟。
   2. 向每管中加入300 μL不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的1×PBS（pH 7.4），在室温下以1500 × g离心5分钟（启用刹车）。弃去上清液，将沉淀重悬于95 μL不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的1×PBS（pH 7.4）中。
   3. 向每管中加入5 µL αCD41-PE（见表4），在室温避光条件下孵育15分钟。
   4. 向每管中加入300 µL不含Ca⁺⁺和Mg⁺⁺的1×PBS（pH 7.4），并混匀。
   5. 将染色后的样本避光保存，直至进行流式细胞术分析（见步骤6）。
      ​注：为计算补偿矩阵，需根据步骤4.1–4.3以及表5和表6中所述方案制备样本。

5. 细胞内转录因子表达的流式细胞术分析

注意：以下操作步骤针对参考流式细胞仪进行的检测；因此，所报告的设置和图示应视为代表性参数。该方案可适用于任何高灵敏度的新一代流式细胞仪。在样品检测前应提前开启流式细胞仪，以确保激光器稳定性。彻底清洗流路系统和流动池，因为血小板体积较小，任何细胞碎片都可能干扰前向散射光/侧向散射光（FSC-A/SSC-A）点图中血小板群体的识别。根据制造商说明书使用质控微球进行质量控制，并再次清洗流路系统，以去除残留的微球。

1. 采集设置
   1. 在对数尺度上创建显示所有事件的FSC-A/SSC-A散点图（图4A）。在对数尺度上创建显示所有事件的CD61-A/SSC-A散点图（图4B）。
   2. 根据每日质量控制调整PE（Y-585）和PerCP（B690）的增益。将SSC-H的阈值设为约2000，PerCP（B690-H）的阈值设为约1000，以显示血小板群体。将流速设为低。
   3. 在10³至10⁵之间绘制一个名为“CD61⁺”的区域，以识别血小板群体。
   4. 采集单染对照样本以计算补偿矩阵，然后采集实验样本。在“CD61⁺”门控内记录包含10,000个事件的数据文件（图4D、E）。在样本采集开始后5-10秒再开始记录。

6. 表面组织因子表达的流式细胞术分析

1. 在对数刻度上制作显示所有事件的FSC-A/SSC-A散点图（图5A），以及在对数刻度上显示所有事件的CD41-A/SSC-A散点图（图5B）。
2. 根据每日质量控制调整Alexa Fluor 633增益和PE（Y-585）增益，将SSC-H的阈值设为约1000，PE（Y585-H）的阈值设为约2500，以可视化血小板群体，如图5B所示。将流速设置为LOW。
3. 在10⁴至10⁵之间绘制一个名为“CD41⁺”的区域，以识别血小板群体。
4. 采集单染对照样本以计算补偿矩阵，然后采集待测样本。在“CD41⁺”门控范围内记录包含10,000个事件的数据文件（图5D，E）。在样本采集开始后5-10秒再开始记录。

7. 富血小板血浆中组织因子阳性血小板的分析

1. 富血小板血浆（PRP）的制备
   注意：为防止血小板活化，血小板分离操作必须在室温下进行。确保试剂和仪器的温度保持在 18 °C 至 22 °C 之间。整个操作过程中避免快速移液和剧烈震荡。
   1. 轻轻混匀 0.129 M 枸橼酸钠真空采血管 5 次，使用血细胞计数仪对血小板计数进行两次测定，以计算回收血小板的百分比。
      注意：以两次测定结果的平均值作为血小板浓度。
   2. 将 0.129 M 枸橼酸钠真空采血管在室温下以 100 × g 离心 10 分钟（不启用刹车）（图 6）。收集所得 PRP，转移至 10 mL 聚丙烯管中，并记录收集的体积。
      注意：避免使用聚苯乙烯管，以防血小板活化。
   3. 使用血细胞计数仪对 PRP 中的血小板进行两次计数，并按以下公式计算血小板回收率：
      
      ​注意：若回收率低于 65%，则血小板群体不能完全代表全血中的情况。建议弃用该样本。
2. 用于流式细胞术分析 PRP 中组织因子（TF）胞内及表面相关表达的样本制备
   1. 为分析 PRP 中组织因子（TF）的胞内及表面相关表达，请采用与全血分析相同的实验方案（见步骤 3–6）。

结果

血小板相关组织因子（TF）表达分析的总结见 图1 所示的流程图。步骤包括：（1）血液采集：使用G19蝶形针或针套管，从人体外周静脉（优先选择肘前静脉）采血，避免使用止血带，并使用含抗凝剂的真空采血管。（2）样本处理：根据拟进行的TF检测类型对样本进行处理。（3）样本标记：使用特异性抗体对标本进行标记。（4）流式细胞术分析：分析样本以检测表面及细胞内TF表达。

在采血过程中，必须特别注意避免血小板活化。为此需采取两项预防措施：在将针头插入静脉后尽快松开止血带，并弃去第一管采集的血液。若不使用止血带，血小板群体在FSC-A/SSC-A散点图中呈现典型的形态，如图2A所示。相反，若使用止血带，血小板群体的物理特性会发生改变，呈现出类似经典血小板激动剂（如ADP）刺激后所观察到的拉长形态（图2B、C）。

为评估血小板相关组织因子（TF）表达随时间的稳定性而进行的实验表明，自采血后3小时内其表达保持稳定（图3）。当联合检测TF表达与血小板活化标志物（如P-选择素）时，建议尽快处理血液样本，以避免血小板脱颗粒。

为了分析血小板内储存的组织因子（TF），全血用1%多聚甲醛（PFA）固定，经PBS-Triton透化处理后，使用PE标记的抗体进行染色。血小板群体通过对数化的FSC-A/SSC-A图（图4 A,D）以及抗αCD61单克隆抗体染色（图4 B,E）进行鉴定。对健康个体（n = 377）血小板内TF的分析结果显示，循环血小板中约有26.8% ± 4.8%含有TF（图4F）。

在静息状态及使用10 µM ADP刺激细胞后，进行了表面相关组织因子（TF）表达的流式细胞术分析。通过αCD41单克隆抗体标记的全血血小板群体，在对数化的FSC-A/SSC-A图中被识别（图5A，B）。结果显示，在健康个体（n = 377）中，静息血小板中有2.8% ± 1.4%表达TF（图5D-F），激活后TF表达上升至24.5% ± 5.8%（图5G-I）。表达TF的血小板亚群具有最大的细胞体积（图5D，G，绿色点）。此外，成像流式细胞术分析表明，TF信号仅与αCD61阳性事件相关，而与αCD45阳性事件无关（图7）。

如前所述，组织因子（TF）储存在血小板的一个亚群中，这些血小板在整个血小板群体中体积最大。因此，在制备富血小板血浆（PRP）过程中，避免丢失这一血小板组分至关重要。按照方法部分（步骤7）所提供的操作说明，可从PRP中分离出能够代表全血中血小板组成的血小板群体。如图6所示，以100 × g 离心全血所获得的血小板群体的流式细胞术散点图，在前向散射光（FSC）分布方面与全血非常相似（图6 A,B）。相比之下，若采用更高的离心力和更长的离心时间（文献中常有报道^12,14,16），所获得的血小板群体其FSC值较全血中的血小板更低（图6C），提示体积较大的血小板（即TF高表达的血小板）已发生丢失。

图1：血小板相关组织因子表达分析及血小板分离的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：通过全血流式细胞术分析的血小板群体代表性密度图。（A）未使用止血带采集的血样中分析的血小板群体，或（B）使用止血带采集的血样中分析的血小板群体。（C）为便于比较，展示了经ADP刺激后的血小板群体。WBC：白细胞；RBC：红细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：细胞表面相关 TF 表达随时间的稳定性。 在采血后四个不同时间点检测静息血小板相关的血小板表面 TF 表达，x 轴所示如下：T0 = 采血后立即检测；T1 = 采血后 1 小时；T2 = 采血后 2 小时；T3 = 采血后 3 小时。数据以均值 ± 标准差表示，n = 3。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：全血中血小板内储存的组织因子（TF）的代表性流式细胞术分析。在FSC/SSC-A散点图（A,D）中并通过αCD61单克隆抗体染色（B,E）鉴定全血中的血小板群体（红色）。使用PE标记的αCD142/HTF1单克隆抗体（绿色点）分析TF表达。通过直方图识别阴性（C）和阳性（F）信号事件。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：表面相关TF阳性血小板的代表性流式细胞术分析。 新鲜全血用αCD142/HTF1单克隆抗体标记后，用1%多聚甲醛固定，并进一步标记二抗和αCD41单克隆抗体。血小板群体（红色）在全血的FSC/SSC-A散点图（A,D,G）以及通过αCD41单克隆抗体染色（B,E,H）进行鉴定。静息状态下（D-F）和ADP刺激后（G-I）的组织因子（TF）表达通过αCD142/HTF1单克隆抗体标记（绿色点）进行定量。代表性阴性（C）和阳性（F,I）样本的直方图显示于此。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：不同离心力对富血小板血浆（PRP）制备的影响。 （A-C）全血及在 100 × g 和 350 × g 条件下制备的富血小板血浆（PRP）中血小板群体的流式细胞术分析。FSC-H/SSC-H 上血小板群体的参考范围以虚线表示。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：通过成像流式细胞术评估血小板和白细胞中的组织因子（TF）表达。 显示了在60倍放大下获取的明场（BF，灰色）、组织因子（TF，绿色）、αCD61（红色）、αCD45（灰色）、Hoechst染色的细胞核（品红色）以及复合图像（合并）的代表性通道图像。请点击此处查看该图的放大版本。

样本管编号	固定/破膜全血 (µL)	αCD142-PE (µL)	αCD61-PerCP (µL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

表1：细胞内转录因子表达流式细胞术分析的染色方案。

样本管编号	固定/透化全血 (µL)	αCD142-PE (µL)	αCD61-PerCP (µL)
未染色	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

表2：细胞内转录因子表达补偿矩阵的单染对照。

样本管编号	PBS 1x (µL)	αCD142 (µL)	ADP (µL)	新鲜全血 (µL)	PFA 1% (µL)
FMO	95	-	-	5	300
静息状态	87.5	7.5	-	5	300
ADP 激活	82.5	7.5	5	5	300

表3：表面TF表达流式细胞术分析的染色方案。

样本管编号	PBS 1x (µL)	Alexa Fluor 633 IgG (µL)	αCD41-PE (µL)
FMO	90	5	5
静息状态	90	5	5
ADP 激活	90	5	5

表4：用于表面相关转录因子分析的二抗染色方案。

样本管编号	PBS 1x (µL)	αCD142 (µL)	ADP (µL)	新鲜全血 (µL)	PFA 1% (µL)
未染色	90	-	5	5	300
TF + Alexa Fluor 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

表5：细胞内转录因子分析的补偿矩阵制备。

样本管编号	PBS 1x (µL)	Alexa Fluor 633 IgG (µL)	αCD41-PE (µL)
未染色	100	-	-
TF + Alexa Fluor 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

表6：表面相关转录因子分析的补偿矩阵制备。

讨论

本论文报告了通过全血流式细胞术评估组织因子阳性血小板的详细方案，同时考虑了血小板内及血小板表面表达蛋白的分析。

在过去的20年中，人血小板中组织因子（TF）的存在已得到充分证实^{1,2,3,4,5,17,18}。其中一部分血小板，约占循环血小板总数的20%-30%²，表达该蛋白，这进一步支持了血小板异质性的概念，而这一概念在当前研究领域中正变得越来越重要^19,20。值得指出的是，TF阳性血小板具有较高的平均血小板体积，这一点此前已通过高灵敏度成像流式细胞术得到证实²。在分析从其他血细胞成分中分离出的血小板中TF表达时，尤其需要考虑这一特征。事实上，在用于血小板分离的离心步骤中，可能会丢失体积较大的血小板²。这一分析前问题可能是直到数年前关于血小板中是否存在TF的争议的主要原因之一^7,12,13。在此方面，全血流式细胞术是一种极为有效的方法，可实现对所有血小板亚群的分析而无需事先分离血小板。

促进关于血小板中组织因子（TF）存在争议的第二个原因，在于分析中所选用的抗人TF抗体。目前有多种 commercially available 的抗体被用于血小板相关TF的检测，这些抗体识别TF蛋白的不同表位。某些抗体（如TF9-10H10^3,21,22和VIC7^1,3克隆）结合于TF的非功能区，不影响FVII/FVIIa与TF的结合。而其他一些抗体，包括VD8^1,2,3和HTF1¹⁸克隆——后者为本实验方案中所使用的抗体——则识别TF的催化位点，与FVII/FVIIa竞争结合TF，从而阻断其促凝血功能。值得注意的是，根据TF胞外域的糖基化状态及其催化位点构象²³（这些可能在特定条件（如细胞活化或疾病状态）下发生改变），这些抗体在通过流式细胞术检测血小板表面TF表达时，其识别能力可能存在差异。此外，染色条件（即待检测样本是新鲜的、固定的和/或透化的）也可能影响表位构象，从而影响抗原-抗体结合¹⁴。

另一个值得关注的问题是抗体所结合的荧光染料的选择。由于仅有20%-30%的血小板群体表达组织因子（TF），若使用发射信号较弱的荧光染料，再结合低灵敏度的流式细胞仪，可能难以区分微弱的阳性信号。因此，应优先选用标记有高亮度荧光染料（如PE或APC）的抗体。然而需要注意的是，像PE这类荧光染料分子体积较大，可能会阻碍标记抗体与目标蛋白的结合²⁴。为克服这一问题，本实验方案采用间接标记法进行表面TF染色：首先使用未标记的一抗（αCD142/HTF1单克隆抗体），再通过二抗进行显色。PE引起的立体位阻不会影响αCD142/HTF1单抗与细胞内储存的TF结合，因为在细胞内TF的催化位点更易于抗体接近。显然，若条件允许，相较于间接标记法，采用直接标记法检测血小板相关TF的表面表达更可取，因其可缩短样本处理时间。然而，该方法必须充分考虑上述关键问题，包括市售各类抗体与血小板TF结合能力的差异，这些差异可能源于蛋白自身构象、染色条件，或所用不同荧光染料产生的立体位阻效应。因此，为避免出现假阴性结果，对表面表达的血小板相关TF进行直接标记时，必须进行严格的优化。这些方面目前正处于一项持续研究中，旨在评估使用各种市售抗体克隆、结合当前常用所有荧光染料进行直接染色的效率。

多项研究表明，在多种血栓风险较高的病理状态下，组织因子（TF）的表达水平升高^8,9,10,11,17。最近的研究证据表明，通过流式细胞术精确定量的TF阳性血小板水平，可用于识别那些尽管对阿司匹林和P2Y₁₂拮抗剂药物治疗反应良好但仍存在高血栓风险的心血管疾病患者²⁵。事实上，与血小板相关的TF具有功能活性，因此可能支持凝血酶的生成^1,3,4。在此背景下，仅需少量微升级血液即可完成流式细胞术分析，这一优势使得血小板相关TF的检测能够拓展至临床应用。值得一提的是，我们近期在国际止血与血栓学会的支持下牵头开展了一项国际项目，旨在对流式细胞术检测血小板相关TF的方法进行验证，以提供标准化的方法学指导。

与其他血小板活化经典标志物（如P-选择素和血小板-白细胞聚集体）不同，组织因子（TF）的表达更为稳定，后者需在采血后立即分析以避免产生人为假象。事实上，血液样本在采血后数小时内处理，血小板TF的表达水平不会发生显著变化；此外，样本固定后可随时进行标记或后续处理，这使得该分析方法适用于许多医院和实验室。值得注意的是，尽管本文所述方案相对简单易行，但流式细胞术仍需要专门的技术培训。因此，当前技术正朝着开发越来越简便、适用于床旁检测的细胞仪方向发展。

综上所述，本方案提供了正确分析血小板相关组织因子（TF）的方法，强调了基于流式细胞术检测技术在该蛋白检测中的优势。此外，本文还指出了可能影响该蛋白分析的分析前变量，并强调了应采取的措施以避免这些因素的干扰。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺苷5’-二磷酸（ADP）	Sigma-Aldrich	A-2754	血小板激动剂
Alexa Fluor 633 山羊 α-小鼠IgG	Invitrogen	A21052	二抗
10 mL Biotube	Biosigma	BSP048	用于富血小板血浆（PRP）采集
G19蝶形针	PIC solution	02044019030010	用于采血
CytExpert 软件	Beckman Coulter		流式细胞术数据分析
Cytoflex S	Beckman Coulter		流式细胞仪
1.5 mL Eppendorf 管	Eppendorf	1,20,086	血液固定
ImageStreamX Mk II	Cytek Biosciences		成像流式细胞仪
Kaluza 软件	Beckman Coulter		流式细胞术数据分析
多聚甲醛	Antibioticos – Carlo Erba Reagenti 分部	387507	用于血液和血小板固定
PerCP-αCD45	BD	345809	白细胞群体标记物
PerCP-αCD61	BD	347408	血小板群体标记物
PE-αCD142	BD	550312	抗人组织因子抗体
PE-αCD41	Beckman Coulter	A07781	血小板群体标记物
不含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010-015	用于抗体和样本稀释
10 µL移液器吸头	Gilson	F161630	用于样本制备
1000 µL移液器吸头	Gilson	F161670	用于样本制备
200 µL移液器吸头	Gilson	F161930	用于样本制备
5 mL圆底管	Corning	352052	用于流式细胞仪检测
0.9%氯化钠	BD	306575	采血后冲洗针头套管
Sysmex XN-450	Dasit		血细胞分析仪
Triton X-100	Carlo Erba Reagenti	9002-93-1	用于通透血细胞膜
0.129 M柠檬酸盐Vacutainer管	BD	363079	用于血液采集
Vacutainer K2 EDTA管	BD	368857	用于血液采集
Vacutainer多样本鲁尔接头	BD	367300	用于采血
Vacutainer一次性持针器	BD	364815	用于采血
Versacomp抗体捕获微球试剂盒	Beckman Coulter	B22804	抗体滴定
αCD142（克隆HTF-1）	Invitrogen	16-1429-82	抗人组织因子抗体