幼虫 RNA 通过壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒递送对 家蚕 Bombyx 的 干扰

家蚕 Bombyx mori 是一种 5000 多年前在中国驯化的昆虫。由于蚕能够生产蚕丝，蚕是中国农业和养蚕业中的重要经济昆虫。蚕是仅次于果蝇的模式昆虫。作为鳞翅目中的模式昆虫，蚕易于饲养，体型大，突变体多。同时，蚕是第一个完整基因组测序的鳞翅目昆虫¹.许多数据库也向公众提供基因组²、转录组³、表达序列标签 （EST）⁴、非编码 RNA⁵ 和微卫星⁶ 的信息。以上事实使蚕成为基因研究的完美模型。

RNA 干扰 （RNAi） 是一种细胞过程，其中双链 RNA （dsRNA） 分子结合并切片互补信使 RNA （mRNA），从而达到靶基因的沉默效果。这种机制天然存在于细菌中，以抵御病毒的入侵⁷。后来，发现 RNAi 在动物、植物和微生物中是保守的。由于其强大的序列特异性沉默作用，RNAi 在基础研究中用于操纵基因表达和研究基因功能。RNAi 是通过将 dsRNA 递送到细胞中来实现的。

在昆虫中，有三种常见的 dsRNA 递送方式，分别是显微注射、喂食和浸泡⁸。目前，通过 dsRNA 注射通过裸 dsRNA 递送在家蚕中成功报告^{RNAi 9}。显微注射的优点是 dsRNA 立即输送到血淋巴中，并精确控制 dsRNA 量。然而，显微注射也存在某些缺点。例如，它很耗时，并且需要精密的设备。优化注射针、注射体积和 dsRNA 量也很重要。因此，需要一种将 dsRNA 递送给家蚕的替代方法。因为昆虫的外骨骼是由几丁质制成的水密屏障，所以浸泡昆虫幼虫以获得 RNAi 的报道很少，这对于昆虫中的 RNAi 来说不是一个好的选择。dsRNA 的补料省力、成本效益高且易于执行¹⁰.该方法也适用于高通量基因筛选¹¹。然而，发现一种 DNA/RNA 非特异性核酸酶，即 BmdsRNase，存在于家蚕幼虫的中肠和中肠液^{中 12}。该核酸酶可消化 dsRNA，最好是¹³。因此，将裸露的 dsRNA 喂给家蚕以沉默基因表达似乎很困难。

最近，纳米颗粒屏蔽的 dsRNA 被证明是通过饲养¹⁴ 来提高 RNAi 效率的良好替代方案。壳聚糖是一种廉价、无毒且可生物降解的聚合物，可以通过甲壳素的脱乙酰化制备，甲壳素是一种天然存在的，是仅次于纤维素¹⁵ 的第二丰富的生物聚合物。由于壳聚糖中的氨基带正电，而 dsRNA 骨架上的磷酸基带负电，因此可以通过聚阳离子的自组装形成壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒¹⁶。壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒通过蚊子埃及伊 蚊 和冈 比亚按蚊¹⁷、棉斑棉铃虫 Earias vittella¹⁸ 和胭脂红蜘蛛螨 Tetranychus cinnabarinus¹⁹ 的幼虫摄食可有效获得 RNAi。

为了开发一种通过喂养家蚕来获得成功的 RNAi 效率的 dsRNA 递送方法，本报告侧重于描述如何制备壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒并将纳米颗粒喂给家蚕幼虫的分步程序。这种方法相对便宜、省力且易于遵循，可以适用于其他昆虫的基因沉默研究。我们的目标是为鳞翅目 dsRNA 递送方法提供一种更简单的方案，具有更高的 RNAi 效率。

1. 蚕种和饲养

1. 在 25 ± 1 °C，光周期 12 小时光照:12 小时黑暗和 75% ± 5% 相对湿度下，饲养至少 120 只新鲜孵化的 1 龄家蚕幼虫和新鲜桑叶。

2. 蚕幼虫的选择

1. 挑选^{第 5 龄} 幼虫的第 1 天进行 RNAi 实验;蚕幼虫在^第 3 龄后生长迅速，这是比较幼虫外观差异的理想选择。
   注:或者，较年轻的阶段，例如^第 3^{或第 4 龄} ，可用于 RNAi 实验。然而，它需要持续的 dsRNA 处理直到^{第 5 龄} ，这相对昂贵且材料成本高昂。

3. dsRNA 的合成

1. 鉴定 dsRNA 靶片段:选择靶基因的编码序列，并将其与其他同源基因比对，以确定保守区域。在非保守区域设计基因特异性引物，用于后续的 dsRNA 靶片段扩增。对于昆虫的 RNAi 实验，典型的 dsRNA 靶片段通常为 400-600 bp。最小大小可以是 200 bp。
   注:为了提高 RNAi 实验的效率和成功率，可以使用一些基于 Web 的工具来设计 dsRNA 靶标，例如 dsRNA Engineer （https://dsrna-engineer.cn/）。
2. 制备 PCR 产物模板:将 T7 RNA 聚合酶启动子 （5'-TAATACGACTCACTATAGG-3'） 添加到上述任一引物的 5'-末端。进行标准 PCR 以扩增 dsRNA 靶片段。在 1x TAE 中运行 1% 琼脂糖凝胶，以验证预期大小的单个 PCR 产物。之后，用纯化试剂盒（材料表）纯化 PCR 产物并将其用于后续转录。
   注:为了长期储存目标 PCR 产物并获得高产量，建议将 PCR 产物连接到质粒上。质粒应在 PCR 反应前线性化。
3. dsRNA 的生成:使用 T7 RNAi 系统（材料表）生成 dsRNA。根据制造商的说明，在室温下添加组分来设置反应。轻轻移液混合反应物，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   注意:为了最大限度地提高产量，在 37 °C 下的孵育可以延长至 2-6 小时。对于包含二级结构或富含 GC 的模板，可以在 42 °C 下进行孵育，以提高 dsRNA 的产量。
4. 退火形成 dsRNA:将反应物在 70 °C 下孵育 10 分钟，然后缓慢冷却至室温（~20 分钟）。这将使 dsRNA 退火。
5. DNase 和 RNase 处理:将 1 μL 提供的 RNase 溶液移液到 199 μL 无核酸酶的水中，制成新鲜稀释的 RNase 溶液。每 20 μL 反应体积加入 1 μL 新鲜稀释的 RNase 溶液和 1 μL 提供的不含 RQ1 RNase 的 DNase，轻轻混合，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。处理后，反应中的单链 RNA （ssRNA） 和模板 DNA 将被去除。
6. 醇沉淀:向反应中加入 1 体积的异丙醇或 2.5 体积的 95% 乙醇以及 0.1 体积的 3 M 乙酸钠 （pH 5.2）。涡旋混合反应物，并在冰上孵育 5 分钟，形成浑浊团块。在离心机中以最大速度旋转 10 分钟，以在试管底部收集白色颗粒。弃去上清液，用 0.5 mL 冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐。洗涤后去除乙醇。让沉淀在室温下风干 15 分钟。用不含核酸酶的水以初始反应体积的 2-5 倍重悬沉淀。储存在 -20 °C 或 -70 °C。
   注:dsRNA 沉淀不应过度干燥，因为这会使其难以完全重悬。为确保充分重悬，至少需要 2 个体积。
7. dsRNA 的数量和质量检查:用无核酸酶的水以 1:100 至 1:300 的比例稀释 dsRNA。根据制造商的说明，使用微量分光光度计（材料表）测定 dsRNA 的浓度。要定量 dsRNA，请将浓度乘以体积。要评估 dsRNA 的质量，请使用琼脂糖凝胶电泳。在 1x TAE 中制备 1% 琼脂糖凝胶，并用无核酸酶水以 1:50 稀释 dsRNA。每个泳道使用 5 μL 稀释的 dsRNA，并在 0.5 mg/mL 溴化乙锭中对凝胶染色至少 15 分钟以进行可视化。
   注意:dsRNA 的迁移速度比 dsDNA 慢。

4. 壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的制备

1. 在室温下制备 100 mM 乙酸钠（0.1 M NaC₂H₃O₂ 和 0.1 M 乙酸，pH 4.5 在去离子水中）和 100 mM 硫酸钠（100 mM Na₂SO₄ 在去离子水中）缓冲液。
2. 溶解市售壳聚糖（来自虾壳，≥75% 脱乙酰; 材料表）在 100 mM 乙酸钠缓冲液中制备 0.02% （w/v） 壳聚糖溶液。
3. 将 20 μg dsRNA 溶解在 50 μL 无核酸酶水中，并将其添加到 50 μL 100 mM 硫酸钠缓冲液中，制成 100 μL dsRNA 溶液。
4. 将 100 μL 壳聚糖溶液添加到 100 μL dsRNA 溶液中。同时，通过将 100 μL 壳聚糖溶液添加到 100 μL 50 mM 硫酸钠中来制备对照。混合混合物并在 55 °C 下加热 1 分钟。
5. 立即用高速涡旋将混合物涡旋 30 秒，以形成纳米颗粒。
6. 在室温下以 13,000 x g 离心混合物 10 分钟，以获得白色沉淀。将上清液转移至新的 1.5 mL 试管中。让沉淀在室温下风干 10 分钟。
7. 使用微量分光光度计测定上清液中 dsRNA 的浓度（材料表）。使用对照中的上清液作为空白。将浓度乘以体积以计算上清液中剩余的 dsRNA 总量。通过上清液中剩余的量除以 dsRNA 的起始量来计算纳米颗粒中封装的 dsRNA 的百分比。
   注意:尽管纳米颗粒可以在使用 4 之前在 37-14 °C 下保存至少¹⁵ 天，但建议尽快使用纳米颗粒。

5. 用壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒喂养家蚕幼虫

1. 挑选相同大小的新鲜蜕皮的 5^龄蚕幼虫（即 5 龄的第 1 天）进行摄食实验。将幼虫单独放入 6 孔板的每个孔中，然后关闭盖子并饥饿 24 小时。
2. 用去离子水冲洗新鲜的桑叶，然后用干净的厨房纸擦干。桑叶应该是干燥的，没有水滴。切成 1 厘米 x 1 厘米的桑叶片。
3. 使用前，将壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒以 500 ng/μL 的浓度溶解在无核酸酶的水中。用相同体积的无核酸酶水稀释对照壳聚糖纳米颗粒（以 4.4 制备）。在无核酸酶的水中制备 500 ng/μL 的裸 dsRNA。
4. 使用壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒进行 RNAi 敲低实验，对照壳聚糖纳米颗粒作为空白/阴性对照。使用裸露的 dsRNA 比较与壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的差异。
5. 在每个叶盘的表面分别涂覆 10 μL 壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒、壳聚糖和裸露的 dsRNA。在室温下将叶盘上的纳米颗粒溶液和 dsRNA 溶液风干 5 分钟。
6. 每天用一个纳米颗粒包被或 dsRNA 包被的叶盘喂养每个幼虫。向幼虫连续提供纳米颗粒包被或 dsRNA 包被的叶盘 5 天。每天被幼虫完全吃掉涂层叶盘后，可以提供新鲜的桑叶。
7. 第 6 天，在冰上麻醉幼虫，直到它们不移动并解剖幼虫进行采样。在干净的培养皿上用剪刀剪掉胸部。用镊子拉出中肠。去除中肠中的内容物，并在另一个装满无核酸酶水的培养皿中清洗中肠。将中肠储存在 1.5 mL 管中并保持在 -70 °C。

6. 确认基因沉默

1. 进行定量实时 PCR （qRT-PCR） 以计算相对转录本定量。每个生物重复至少需要 3 个生物学重复和 3 个技术重复。建议使用至少两个参考基因来标准化相对转录本。检测 Bombyx Toll9-2 （BmToll9-2） 基因。通过将相对转录本的平均值与对照组进行比较来评估基因沉默效率，并将其转换为百分比。
   注:qRT-PCR 扩增条件、引物信息和相对转录本计算可在我们最近的出版物²⁰ 中找到。
2. 分析 RNAi 表型以评估基因沉默效果。观察幼虫和茧的大小。每天拍照以记录外观。
   注:RNAi 可影响形态、、生理学和行为。RNAi 相关表型的观察取决于靶向基因。

为了评估 RNAi 效率，选择靶向 BmToll9-2 的免疫基因进行分析。 BmToll9-2 基因在实验室中得到了很好的表征，在我们最近的出版物20 中，通过 dsRNA 注射进行基因沉默导致幼虫更轻、更小。为了通过壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒摄入来确认 RNAi 功效，以壳聚糖纳米颗粒作为对照，同时比较裸露的 dsRNA。

与对照相比，不含 dsRNA 的壳聚糖纳米颗粒，靶向 BmToll9-2 基因的裸露 dsRNA 没有沉默作用。蚕中壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的喂养显着抑制转录本，敲低 79%（图 1）。相关转录本的抑制表明 BmToll9-2 基因通过壳聚糖/dsRNA 摄入成功沉默。

BmToll9-2 基因的敲除显着影响家蚕的生长。当观察幼虫时，BmToll9-2 沉默的幼虫比对照幼虫小（图 2A）。当比较茧时，BmToll9-2 沉默的茧也更小（图 2B）。壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒在家蚕的转录本和表型中均显示出成功的 RNAi 效应。

图 1:家蚕 5龄幼虫摄入壳聚糖/dsBmToll9-2 纳米颗粒后 BmToll9-2 的相对转录本。以壳聚糖纳米颗粒作为对照、裸露的 dsRNA 和壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒喂养的幼虫中 BmToll9-2 的相对 mRNA 水平。数据表示为 3 个生物复制±均值标准差。对于每个生物复制，有三个技术复制。条形上的不同字母表示基于单因子方差分析的显著差异。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:用壳聚糖/dsBmToll9-2 纳米颗粒喂养后的表型观察。 壳聚糖纳米颗粒用作对照。（A） 摄入纳米颗粒后家蚕幼虫的外观。（B） 摄入纳米颗粒后蚕茧的外观。 请单击此处查看此图的较大版本。

作者没有什么可披露的。