通过壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒递送实现家蚕 Bombyx mori 的幼虫RNA干扰

摘要

本文介绍了一种通过摄食途径在家蚕 Bombyx mori 幼虫中递送壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒以诱导基因沉默的实验方案。

摘要

家蚕（Bombyx mori）是一种在中国具有数千年历史的重要经济昆虫。同时，家蚕也是鳞翅目昆虫中的模式生物，其基础研究积累较为丰富。它是鳞翅目中首个完成全基因组测序与组装的昆虫，为基因功能研究提供了坚实的基础。尽管RNA干扰（RNAi）技术已广泛应用于基因功能的反向研究中，但在家蚕及其他鳞翅目物种中，该技术的应用仍较为困难。以往成功实现RNAi的相关研究仅通过显微注射方式递送双链RNA（dsRNA），尚无通过饲喂方式递送dsRNA的报道。本文详细描述了制备壳聚糖/dsRNA纳米颗粒并经口饲喂家蚕幼虫的逐步操作流程。本实验方案包括：（i）选择合适发育阶段的家蚕幼虫，（ii）合成dsRNA，（iii）制备壳聚糖/dsRNA纳米颗粒，以及（iv）通过饲喂方式将壳聚糖/dsRNA纳米颗粒给予家蚕幼虫。文中展示了代表性结果，包括基因转录水平的验证和表型观察。dsRNA饲喂是一种在家蚕幼虫中实现RNA干扰的简便技术。由于家蚕幼虫易于饲养且个体较大，便于操作，因此是展示昆虫幼虫期RNAi的理想模型。此外，该技术操作简便，有助于激发更多学生参与科研实践，使家蚕幼虫成为课堂教学中理想的遗传学实验体系。

引言

家蚕（Bombyx mori）是一种约5000多年前在中国驯化的昆虫。由于其产丝能力，家蚕在中国农业和蚕业中是一种重要的经济昆虫。在家用模式昆虫中，家蚕的重要性仅次于果蝇。作为鳞翅目中的模式昆虫，家蚕易于饲养，个体较大，且具有丰富的突变体资源。同时，家蚕是首个完成全基因组测序的鳞翅目昆虫¹。目前已有大量公开数据库，提供家蚕基因组²、转录组³、表达序列标签（EST）⁴、非编码RNA⁵以及微卫星序列⁶等相关信息。上述特点使家蚕成为遗传学研究的理想模式生物。

RNA干扰（RNAi）是一种细胞过程，其中双链RNA（dsRNA）分子结合并切割互补的信使RNA（mRNA），从而实现靶基因的沉默效应。该机制天然存在于细菌中，用于抵御病毒入侵⁷。随后发现，RNAi在动物、植物和微生物中均具有保守性。由于其强大的序列特异性沉默效应，RNAi被广泛应用于基础研究中，以调控基因表达并研究基因功能。RNAi通过将dsRNA递送至细胞内而实现。

在昆虫中，递送dsRNA的三种常用方法是显微注射、饲喂....

方案

1. 家蚕物种及饲养

1. 在 25 ± 1 °C、光周期 12 小时光照:12 小时黑暗、相对湿度 75% ± 5% 的条件下，用新鲜桑叶饲养至少 120 条新孵化的家蚕（B. mori）P50 品系 1^龄 幼虫。

2. 家蚕幼虫的选择

1. 选择第5天的第1天^th 用于RNAi实验的龄期幼虫；家蚕幼虫在5龄第3天后生长迅速^th 龄期，适用于比较幼虫形态的差异。
   注意：也可选用较年轻的阶段，例如3^rd 或 4^th 龄期幼虫可用于RNAi实验。然而，需要持续进行dsRNA处理直至5龄期^th 龄期，相对昂贵且材料成本较高。

3. 双链RNA的合成

1. 确定dsRNA靶片段：选择目标基因的编码序列，并与其他同源基因进行比对以确定保守区域。在非保守区域设计基因特异性引物，用于后续dsRNA靶片段的扩增。在昆虫中的RNAi实验中，典型的dsRNA靶片段长度通常为400–600 bp，最小可至200 bp。
   注意：为提高RNAi实验的效率和成功率，可使用一些基于网络的工具设....

结果

为评估RNAi效率，选择靶向免疫基因BmToll9-2进行分析。BmToll9-2基因在本实验室已有深入研究，且根据我们近期发表的研究结果²⁰，通过注射dsRNA可实现该基因的沉默，并导致幼虫体型变小、体重减轻。为验证通过壳聚糖/dsRNA纳米颗粒经口摄入途径实现RNAi的效果，实验设置了壳聚糖纳米颗粒作为对照组，同时比较了裸dsRNA的干扰效果。

与对照组相比，不含dsRNA的壳聚糖纳米颗粒以及裸露的靶向dsRNA BmToll9-2 基因未表现出沉默效应。通过饲喂壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒可显著抑制家蚕中该基因的转录水平，敲低效率达 79%图1相对转录本的抑制表明 BmToll9-2 通过壳聚糖/dsRNA 摄入成功实现了基因沉默。

BmToll9-2 基因的敲低显著影响家蚕的生长发育。观察幼虫时可见，BmToll9-.......

讨论

合适的观察阶段对于RNAi表型的观察至关重要，具体取决于靶向的基因。我们的初步结果表明 Toll9-2 参与家蚕的生长过程。五龄期家蚕幼虫的体型和体重迅速增加。^th 龄期²¹因此，5^th 选择三龄幼虫作为壳聚糖/dsRNA纳米颗粒饲喂实验的阶段。也可选择3^rd 或 4^th 用于饲喂实验的龄期幼虫，并观察其在5龄时的发育差异^th 龄期。然而，纳米颗粒喂养实验需要每日持续喂养¹⁴. 在幼虫较早阶段进行饲喂需要更多的dsRNA制备量，成本相对较高。基于上述原因，我们建议选择刚蜕皮的五龄家蚕幼虫作为实验材料^th 以龄期作为纳米颗粒喂养实验的起始点。

优化纳米颗粒的饲喂参数也十分重要。目前的研究中，通常采用持续5-7天的纳米颗粒饲喂以实现高效的RNA干扰^14,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	Sangon	F601620	用于 dsRNA 或纳米颗粒反应
10 μL 移液器	Eppendorf	P13473G	用于吸取或重悬液体
100 μL 移液器	Eppendorf	Q12115G	用于吸取或重悬液体
2.5 μL 移液器	Eppendorf	P20777G	用于吸取或重悬液体
20 μL 移液器	Eppendorf	H19229E	用于吸取或重悬液体
200 μL 移液器	Eppendorf	H20588E	用于吸取或重悬液体
6 孔透明 TC 处理多孔板	Costar	3516	用于单独饲养家蚕
乙酸	Aladdin	A116165	用于配制 TAE 缓冲液
琼脂糖 M	BBI Life Sciences	A610013	用于琼脂糖凝胶电泳
分析天平	Sartorius	BSA224S	用于称量试剂
离心机	Sartorius	Centrisart A-14C	用于离心形成 dsRNA 或纳米颗粒
壳聚糖	Sigma-Aldrich	C3646	与 dsRNA 结合用于制备纳米颗粒
EDTA	Sangon	A500895	用于配制 TAE 缓冲液
乙醇	Aladdin	E130059	用于配制 TAE 缓冲液或 dsRNA 沉淀
冷冻柜	Siemens	iQ300	用于储存 dsRNA 或纳米颗粒
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	用于 PCR 反应
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	用于 qRT-PCR 反应
异丙醇	Aladdin	I112011	用于 dsRNA 沉淀
NanoDrop 微量紫外-可见分光光度计	ThermoFisher	One	用于测定 dsRNA 浓度
pH 计	Sartorius	PB-10	用于缓冲液配制
SanPrep 柱式 PCR 产物纯化试剂盒	Sangon	B518141	用于 PCR 产物纯化
乙酸钠	Sigma-Aldrich	S2889	用于配制 100 mM 乙酸钠缓冲液
硫酸钠	Sigma-Aldrich	239313	用于配制 100 mM 硫酸钠缓冲液
T7 RiboMAX Express RNAi 系统	Promega	P1700	用于 dsRNA 合成
ThermoMixer 恒温混匀仪	Eppendorf	C	用于 dsRNA 制备或纳米颗粒加热
Tris	Sangon	A501492	用于配制 TAE 缓冲液
涡旋振荡器	IKA	Vortex 3	用于制备壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒