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通过壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒递送实现家蚕 Bombyx mori 的幼虫RNA干扰

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DOI：

10.3791/67360

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2024年10月4日

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Guangzhou University

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过摄食途径在家蚕 Bombyx mori 幼虫中递送壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒以诱导基因沉默的实验方案。

摘要

家蚕（Bombyx mori）是一种在中国具有数千年历史的重要经济昆虫。同时，家蚕也是鳞翅目昆虫中的模式生物，其基础研究积累较为丰富。它是鳞翅目中首个完成全基因组测序与组装的昆虫，为基因功能研究提供了坚实的基础。尽管RNA干扰（RNAi）技术已广泛应用于基因功能的反向研究中，但在家蚕及其他鳞翅目物种中，该技术的应用仍较为困难。以往成功实现RNAi的相关研究仅通过显微注射方式递送双链RNA（dsRNA），尚无通过饲喂方式递送dsRNA的报道。本文详细描述了制备壳聚糖/dsRNA纳米颗粒并经口饲喂家蚕幼虫的逐步操作流程。本实验方案包括：（i）选择合适发育阶段的家蚕幼虫，（ii）合成dsRNA，（iii）制备壳聚糖/dsRNA纳米颗粒，以及（iv）通过饲喂方式将壳聚糖/dsRNA纳米颗粒给予家蚕幼虫。文中展示了代表性结果，包括基因转录水平的验证和表型观察。dsRNA饲喂是一种在家蚕幼虫中实现RNA干扰的简便技术。由于家蚕幼虫易于饲养且个体较大，便于操作，因此是展示昆虫幼虫期RNAi的理想模型。此外，该技术操作简便，有助于激发更多学生参与科研实践，使家蚕幼虫成为课堂教学中理想的遗传学实验体系。

引言

家蚕（Bombyx mori）是一种约5000多年前在中国驯化的昆虫。由于其产丝能力，家蚕在中国农业和蚕业中是一种重要的经济昆虫。在家用模式昆虫中，家蚕的重要性仅次于果蝇。作为鳞翅目中的模式昆虫，家蚕易于饲养，个体较大，且具有丰富的突变体资源。同时，家蚕是首个完成全基因组测序的鳞翅目昆虫1。目前已有大量公开数据库，提供家蚕基因组2、转录组3、表达序列标签（EST）4、非编码RNA5以及微卫星序列6等相关信息。上述特点使家蚕成为遗传学研究的理想模式生物。

RNA干扰（RNAi）是一种细胞过程，其中双链RNA（dsRNA）分子结合并切割互补的信使RNA（mRNA），从而实现靶基因的沉默效应。该机制天然存在于细菌中，用于抵御病毒入侵7。随后发现，RNAi在动物、植物和微生物中均具有保守性。由于其强大的序列特异性沉默效应，RNAi被广泛应用于基础研究中，以调控基因表达并研究基因功能。RNAi通过将dsRNA递送至细胞内而实现。

在昆虫中，递送dsRNA的三种常用方法是显微注射、饲喂和浸泡8。目前，家蚕中通过裸露dsRNA递送实现成功RNA干扰的报道主要采用dsRNA注射方式9。显微注射的优点是可将dsRNA直接递送至血淋巴，并能精确控制dsRNA的用量。然而，显微注射也存在一些缺点，例如耗时较长，且需要精密的设备。此外，还需优化注射针头、注射体积以及dsRNA的用量。因此，有必要开发一种替代方法向家蚕递送dsRNA。由于昆虫的外骨骼是由几丁质构成的防水屏障，通过浸泡幼虫实现RNA干扰的报道极少，因此该方法在昆虫RNA干扰中并非理想选择。饲喂dsRNA具有省力、成本低且操作简便的优点10，也适用于高通量基因筛选11。然而，研究发现家蚕幼虫的中肠及中肠液中存在一种DNA/RNA非特异性核酸酶，即BmdsRNase12，该酶能够优先降解dsRNA13。因此，通过饲喂裸露dsRNA来沉默家蚕基因表达似乎较为困难。

最近，纳米颗粒包被的双链RNA被证明是通过饲喂方式提高RNA干扰效率的一种良好替代方法14。壳聚糖是一种廉价、无毒且可生物降解的聚合物，可通过甲壳素脱乙酰化制备；甲壳素是一种天然存在的生物聚合物，其丰度在自然界中仅次于纤维素15。由于壳聚糖中的氨基带正电荷，而双链RNA骨架上的磷酸基团带负电荷，因此壳聚糖/dsRNA纳米颗粒可通过多聚阳离子的自组装形成16。壳聚糖/dsRNA纳米颗粒在通过幼虫饲喂实现RNA干扰方面具有显著效果，已在埃及伊蚊Aedes aegypti和冈比亚按蚊Anopheles gambiae17、棉铃斑喙象Earias vittella18以及朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus19中得到验证。

为了建立通过饲喂法向家蚕递送双链RNA（dsRNA）并实现有效RNA干扰（RNAi）效率的方法，本文重点描述了制备壳聚糖/dsRNA纳米颗粒以及将这些纳米颗粒饲喂给家蚕幼虫的逐步操作流程。该方法成本相对较低、节省人力且易于操作，可适用于其他昆虫的基因沉默研究。本研究旨在为鳞翅目昆虫提供一种更简便且RNAi效率更高的dsRNA递送方案。

方案

1. 家蚕物种及饲养

  1. 在 25 ± 1 °C、光周期 12 小时光照:12 小时黑暗、相对湿度 75% ± 5% 的条件下，用新鲜桑叶饲养至少 120 条新孵化的家蚕（B. mori）P50 品系 1龄 幼虫。

2. 家蚕幼虫的选择

  1. 选择第5天的第1天th 用于RNAi实验的龄期幼虫；家蚕幼虫在5龄第3天后生长迅速th 龄期，适用于比较幼虫形态的差异。
    注意：也可选用较年轻的阶段，例如3rd 或 4th 龄期幼虫可用于RNAi实验。然而，需要持续进行dsRNA处理直至5龄期th 龄期，相对昂贵且材料成本较高。

3. 双链RNA的合成

  1. 确定dsRNA靶片段：选择目标基因的编码序列，并与其他同源基因进行比对以确定保守区域。在非保守区域设计基因特异性引物，用于后续dsRNA靶片段的扩增。在昆虫中的RNAi实验中，典型的dsRNA靶片段长度通常为400–600 bp，最小可至200 bp。
    注意：为提高RNAi实验的效率和成功率，可使用一些基于网络的工具设计dsRNA靶序列，例如dsRNA Engineer（https://dsrna-engineer.cn/）。
  2. 制备PCR产物模板：在上述设计的任一引物的5'端添加T7 RNA聚合酶启动子序列（5'-TAATACGACTCACTATAGG-3'）。通过标准PCR扩增dsRNA靶片段。使用1%琼脂糖凝胶（1x TAE缓冲液）电泳检测，确认获得预期大小的单一PCR产物。随后，使用纯化试剂盒（材料表）纯化PCR产物，并用于后续转录反应。
    注意：为长期保存靶标PCR产物并获得高产量，建议将PCR产物连接至质粒中。在PCR反应前，质粒应预先线性化。
  3. 生成dsRNA：使用T7 RNAi系统（材料表）生成dsRNA。按照生产商说明书，在室温下加入各组分。轻轻吹打混匀反应体系，于37 °C孵育30分钟。
    注意：为最大化产量，可在37 °C孵育延长至2–6小时。对于含有二级结构或GC含量较高的模板，可改用42 °C孵育，以提高dsRNA产量。
  4. 退火形成dsRNA：将反应体系于70 °C孵育10分钟，然后缓慢冷却至室温（约20分钟），以完成dsRNA的退火。
  5. DNase和RNase处理：取1 µL提供的RNase溶液加入199 µL无核酸酶水中，配制新鲜稀释的RNase溶液。每20 µL反应体系中加入1 µL新鲜稀释的RNase溶液和1 µL提供的RQ1无RNase DNase，轻轻混匀后于37 °C孵育30分钟。此步骤可去除反应中的单链RNA（ssRNA）和模板DNA。
  6. 醇沉淀：向反应体系中加入等体积异丙醇或2.5倍体积的95%乙醇，以及0.1倍体积的3 M醋酸钠（pH 5.2）。涡旋混匀后置于冰上孵育5分钟，形成浑浊沉淀物。在离心机中以最大速度离心10分钟，收集管底白色沉淀。弃去上清液，用0.5 mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀，以去除残留盐分。洗去乙醇后，将沉淀在室温下晾干15分钟。用无核酸酶水以初始反应体积的2–5倍重悬沉淀。储存于-20 °C或-70 °C。
    注意：dsRNA沉淀不宜过度干燥，否则难以完全重悬。为确保充分溶解，重悬体积至少应为沉淀体积的2倍。
  7. dsRNA的定量与质量检测：将dsRNA用无核酸酶水按1:100至1:300比例稀释。根据生产商说明书，使用微量分光光度计（材料表）测定dsRNA浓度。定量时，将测得浓度乘以体积即可。为评估dsRNA质量，采用琼脂糖凝胶电泳分析。配制1%琼脂糖凝胶（1x TAE缓冲液），将dsRNA用无核酸酶水按1:50稀释。每泳道上样5 µL稀释后的dsRNA，用0.5 mg/mL溴化乙锭染色至少15分钟进行可视化观察。
    注意：dsRNA在凝胶中的迁移速度比dsDNA更慢。

4. 壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的制备

  1. 在室温下，配制 100 mM 醋酸钠缓冲液（0.1 M NaC2H3O2 和 0.1 M 醋酸，pH 4.5，溶于去离子水）和 100 mM 硫酸钠缓冲液（100 mM Na2SO4 溶于去离子水）。
  2. 将市售壳聚糖（来源于虾壳，脱乙酰度 ≥75%；材料表）溶于 100 mM 醋酸钠缓冲液中，配制成 0.02%（w/v）的壳聚糖溶液。
  3. 将 20 µg 的 dsRNA 溶于 50 µL 无核酸酶水中，然后加入 50 µL 100 mM 硫酸钠缓冲液，最终得到 100 µL 的 dsRNA 溶液。
  4. 将 100 µL 壳聚糖溶液加入 100 µL dsRNA 溶液中。同时，通过将 100 µL 壳聚糖溶液加入 100 µL 50 mM 硫酸钠缓冲液中制备对照组。混合后，在 55 °C 下加热 1 分钟。
  5. 立即使用高速涡旋振荡器剧烈振荡混合物 30 秒，以促进纳米颗粒的形成。
  6. 在室温下以 13,000 x g 离心 10 分钟，获得白色沉淀。将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。让沉淀在室温下静置干燥 10 分钟。
  7. 使用微量分光光度计测定上清液中 dsRNA 的浓度（材料表），以对照组的上清液作为空白对照。将浓度乘以体积，计算上清液中残留的 dsRNA 总量。通过将上清液中残留的 dsRNA 量除以初始加入的 dsRNA 量，计算纳米颗粒中 dsRNA 的包封率。
    注意：尽管纳米颗粒可在 4–37 °C 下保存至少 15 天后再使用14，但仍建议尽快使用。

5. 用壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒饲喂家蚕幼虫

  1. 挑选刚蜕皮的5龄幼虫th 五龄蚕幼虫（即五龄第1天）th 选择相同大小的同龄幼虫用于摄食实验。将幼虫分别放入6孔板的每个孔中，盖上盖子后饥饿处理24小时。
  2. 用去离子水冲洗新鲜桑叶，并用干净的厨房纸巾擦干。桑叶应完全干燥，无水滴残留。将桑叶切成 1 cm × 1 cm 的叶盘。
  3. 将壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒在使用前溶于无核酸酶水，配制成 500 ng/µL 的溶液。用等体积的无核酸酶水稀释对照用壳聚糖纳米颗粒（按 4.4 步骤制备）。将裸 dsRNA 用无核酸酶水配制成 500 ng/µL 的溶液。
  4. 使用壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒进行RNAi基因沉默实验，以不含dsRNA的壳聚糖纳米颗粒作为空白/阴性对照。使用裸dsRNA与壳聚糖/dsRNA纳米颗粒进行比较，以分析两者之间的差异。
  5. 分别将10 µL的壳聚糖/dsRNA纳米颗粒、壳聚糖和裸露dsRNA涂布于每片叶盘表面。室温下将纳米颗粒溶液和dsRNA溶液在叶盘上风干5分钟。
  6. 每天为每只幼虫提供一片纳米颗粒包被或dsRNA包被的叶盘。连续5天持续向幼虫提供纳米颗粒包被或dsRNA包被的叶盘。每天待幼虫将包被叶盘完全食尽后，可补充新鲜的桑叶。
  7. 第6天，将幼虫置于冰上麻醉至不再活动，解剖幼虫进行取样。在洁净的培养皿中用剪刀剪下胸部，用镊子取出中肠。清除中肠内容物，并在另一含有无核酸酶水的培养皿中清洗中肠。将中肠置于1.5 mL离心管中，于-70 °C保存。

6. 基因沉默效果的验证

  1. 采用定量实时 PCR（qRT-PCR）进行相对转录本定量分析。每个生物学重复至少需要三个技术重复，且至少设置三个生物学重复。建议使用至少两个参考基因对相对转录本水平进行标准化。 家蚕 Toll9-2BmToll9-2) 基因进行检测。通过将相对转录本的平均值与对照组比较，并转换为百分比，评估基因沉默效率。
    注意：qRT-PCR 扩增条件、引物信息及相对转录本计算方法可参见我们近期的发表文章20.
  2. 分析RNAi表型以评估基因沉默效果。观察幼虫和茧的大小。每天拍照记录外观。
    注意：RNAi 可影响形态、变态、生理和行为。RNAi 相关表型的观察取决于所靶向的基因。

结果

为评估RNAi效率，选择靶向免疫基因BmToll9-2进行分析。BmToll9-2基因在本实验室已有充分表征，且根据我们近期发表的研究20，通过注射dsRNA可导致基因沉默，进而产生体形更小、体重更轻的幼虫。为验证通过壳聚糖/dsRNA纳米颗粒经摄食途径介导的RNAi效果，实验设置了壳聚糖纳米颗粒作为对照组，并同时比较了裸dsRNA的干扰效果。

与对照组相比，不含dsRNA的壳聚糖纳米颗粒以及裸露的靶向BmToll9-2基因的dsRNA均未表现出沉默效应。通过饲喂壳聚糖/dsRNA纳米颗粒可显著抑制家蚕中该基因的转录水平，敲低效率达79%（图1）。相对转录水平的抑制表明，通过摄食壳聚糖/dsRNA成功实现了BmToll9-2基因的沉默。

敲低 BmToll9-2 基因显著影响家蚕的生长。观察幼虫时可见，BmToll9-2 基因沉默的幼虫体型小于对照组幼虫（图2A）。在比较蚕茧时，BmToll9-2 基因沉默的蚕茧也更小（图2B）。壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒在家蚕的转录水平和表型水平均表现出成功的RNA干扰效应。

Bar graph comparing relative transcript levels: control, naked dsRNA, chitosan/dsRNA treatment.
图1：相对转录本 BmToll9-2 壳聚糖/dsBmToll9-2 纳米颗粒处理后 摄入 B. mori 5th 龄幼虫 相对mRNA水平 BmToll9-2 在以壳聚糖纳米颗粒作为对照、裸露的dsRNA以及壳聚糖/dsRNA纳米颗粒饲喂的幼虫中，数据表示为三次生物学重复的均值±标准差，每次生物学重复包含三次技术重复。柱状图上不同的字母表示基于单因素方差分析（one-way ANOVA）的显著性差异。 请点击此处以查看此图的放大版本。

对照组与壳聚糖/dsRNA处理下家蚕生长及茧形成；科学研究。
图 2：饲喂壳聚糖/dsBmToll9-2 纳米颗粒后的表型观察。以壳聚糖纳米颗粒作为对照。(A) 家蚕幼虫摄食纳米颗粒后的外观。(B) 家蚕幼虫摄食纳米颗粒后所结蚕茧的外观。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

合适的观察阶段对于RNAi表型的观察至关重要，具体取决于靶向的基因。我们的初步结果表明 Toll9-2 参与家蚕的生长过程。五龄期家蚕幼虫的体型和体重迅速增加。th 龄期21因此，5th 选择三龄幼虫作为壳聚糖/dsRNA纳米颗粒饲喂实验的阶段。也可选择3rd 或 4th 用于饲喂实验的龄期幼虫，并观察其在5龄时的发育差异th 龄期。然而，纳米颗粒喂养实验需要每日持续喂养14. 在幼虫较早阶段进行饲喂需要更多的dsRNA制备量，成本相对较高。基于上述原因，我们建议选择刚蜕皮的五龄家蚕幼虫作为实验材料th 以龄期作为纳米颗粒喂养实验的起始点。

优化纳米颗粒的饲喂参数也十分重要。目前的研究中，通常采用持续5-7天的纳米颗粒饲喂以实现高效的RNA干扰14,18,22,23。由于dsRNA是RNA干扰实验中最昂贵的组分，可考虑每隔一天饲喂一次纳米颗粒，这可能使dsRNA制备成本降低一半。另一种降低成本的方法是优化饲喂过程中使用的dsRNA用量。本实验方案中，每头幼虫使用5 µg壳聚糖/dsRNA纳米颗粒，该剂量是实验室中dsRNA注射的通用剂量。考虑到5 µg的dsRNA属于较高剂量，且通过纳米颗粒饲喂已能实现显著的基因沉默效果，建议在实验中减少dsRNA的使用量。然而，上述两个参数对RNA干扰效率的具体影响仍有待后续实验进一步评估。

壳聚糖与双链RNA的比例可以进行优化。在本方案中，将100 µL醋酸钠溶液中的20 µg壳聚糖与100 µL硫酸钠溶液中的20 µg双链RNA混合。在首篇关于壳聚糖/双链RNA纳米颗粒的报道中，将100 µL醋酸钠溶液中的20 µg壳聚糖与100 µL硫酸钠溶液中的32 µg双链RNA混合16。在其他一些报道中，将100 µL醋酸钠溶液中的1 µg壳聚糖与100 µL硫酸钠溶液中的1 µg双链RNA混合18,23。因此，壳聚糖和双链RNA的用量可进一步优化，以实现纳米颗粒最佳的载药效率和最优的RNA干扰沉默效果。

需要考虑壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒的保存条件。壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒应在饲喂实验前制备，并建议立即使用。最近有报道称，壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒在 4 °C、24 °C 和 37 °C 下保存 15 天后仍保持稳定19。因此，壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒可预先制备，并在冰箱中于 4 °C 保存，因为 dsRNA 在低温条件下更稳定。

除了双链RNA（dsRNA）外，一些小RNA分子，如小干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA（shRNA），也可用于制备RNA干扰实验中的纳米颗粒。例如，siRNA纳米颗粒可提高植物对Pseudomonas syringae24的抗性。递送shRNA纳米颗粒在新热带褐蝽Euschistus heros25中成功诱导了RNA干扰效应。因此，纳米颗粒可应用于RNA干扰实验中使用的任何RNA分子。

据报道，包括家蚕在内的鳞翅目昆虫的RNAi效率较低26。在家蚕中，dsRNA的递送只能通过注射方式进行，耗时且劳动成本高。采用这种壳聚糖/dsRNA纳米颗粒递送方法后，在家蚕幼虫和蚕茧中均观察到显著的转录水平或表型沉默效应，这可能得益于壳聚糖对dsRNA的保护作用，减少了其降解19。该方法操作简便、节省人力，可推广应用于其他昆虫。本实验方案的简便性不仅适用于科学研究，也可用于课堂教学演示与实践。纳米颗粒递送技术为未来的生物防治和害虫管理提供了新的方向27。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家自然科学基金（31501898）、广州市科技计划项目（202102010465）、广州市高等教育教学质量与教学改革工程（2022JXGG057）以及广东省高校在线开放课程教学指导委员会研究项目（2022ZXKC381）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管SangonF601620用于 dsRNA 或纳米颗粒反应
10 μL 移液器EppendorfP13473G用于吸取或重悬液体
100 μL 移液器EppendorfQ12115G用于吸取或重悬液体
2.5 μL 移液器EppendorfP20777G用于吸取或重悬液体
20 μL 移液器EppendorfH19229E用于吸取或重悬液体
200 μL 移液器EppendorfH20588E用于吸取或重悬液体
6 孔透明 TC 处理多孔板Costar3516用于单独饲养家蚕
乙酸AladdinA116165用于配制 TAE 缓冲液
琼脂糖 MBBI Life SciencesA610013用于琼脂糖凝胶电泳
分析天平SartoriusBSA224S用于称量试剂
离心机 SartoriusCentrisart A-14C用于离心形成 dsRNA 或纳米颗粒
壳聚糖Sigma-AldrichC3646与 dsRNA 结合用于制备纳米颗粒
EDTASangonA500895用于配制 TAE 缓冲液
乙醇AladdinE130059用于配制 TAE 缓冲液或 dsRNA 沉淀
冷冻柜SiemensiQ300用于储存 dsRNA 或纳米颗粒
GoTaq Green Master MixPromegaM712用于 PCR 反应
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002用于 qRT-PCR 反应
异丙醇 AladdinI112011用于 dsRNA 沉淀
NanoDrop 微量紫外-可见分光光度计ThermoFisherOne用于测定 dsRNA 浓度
pH 计Sartorius PB-10用于缓冲液配制
SanPrep 柱式 PCR 产物纯化试剂盒SangonB518141用于 PCR 产物纯化
乙酸钠Sigma-AldrichS2889用于配制 100 mM 乙酸钠缓冲液
硫酸钠 Sigma-Aldrich239313用于配制 100 mM 硫酸钠缓冲液
T7 RiboMAX Express RNAi 系统PromegaP1700用于 dsRNA 合成
ThermoMixer 恒温混匀仪EppendorfC用于 dsRNA 制备或纳米颗粒加热
TrisSangonA501492用于配制 TAE 缓冲液
涡旋振荡器 IKAVortex 3用于制备壳聚糖/dsRNA 纳米颗粒

参考文献

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RNA RNAi RNA

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