方法文章

使用荧光染料带和 45S 和 5S rDNA-FISH 对 金黄色石蒜 草本种群进行比较核型分析

DOI：

10.3791/67363

⸱

2024年11月29日

 ,  , 
1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

本文内容

摘要

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该方案使用 PI 和 DAPI 染色体染色、荧光原位杂交 （FISH） 与 18S-5.8-26S rRNA 基因区域（45S rDNA 区域）和 5S 核糖体 DNA 探针。

摘要

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为了了解 8 个群体的核型变异，使用染色体测量、荧光条带和 rDNA FISH 信号精心建立了详细的核型。45S rDNA 位点的数量从每个群体 1 到 5 对不等，每个核型最常见的数量是 4 对。45S rDNA 位点主要位于染色体的短臂和末端区域，而 5S rDNA 位点主要位于短臂和末端或近端区域。群体 HBWF 、 HNXN 、 HBBD 和 HNZX 显示出相似的 45S rDNA 位点分布，GXTL、 HBFC 和 SCLS 也是如此，表明具有相似 45S rDNA 位点分布的群体之间存在密切关系。所有研究人群的核型都是对称的，包括稳定和亚稳态着丝粒或完全稳定的着丝粒。MCA 和 CVCL 的散点图有效地区分了它们的核型结构。分析包括六个定量参数（x、2n、TCL、MCA、CVCL、CVCI）。此外，结果表明，基于这六个参数的 PCoA 是确定八个种群之间生物核型关系的稳健方法。 石蒜 种群中的染色体数为 x = 6-8。根据目前的研究和文献，从基因组大小、异染色质、45S 和 5S rDNA 位点以及核型不对称性方面讨论了这些群体的基因组分化。

引言

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石蒜 （Lycoris ） 是一个包括几种重要园艺植物的科1. 石蒜 （L'Hér.）药草。是一种历史悠久的传统中药材植物。植物化学分析表明， Lycoris aurea （L′Her.）草药含有加兰他敏和其他生物碱，可以提高乙酰胆碱敏感性，并有可能作为胆碱酯酶抑制剂治疗阿尔茨海默病2。

在高等植物中，核型分析对于整合遗传和物理图谱至关重要，对植物生物学具有重要的实际意义。该分析允许染色体水平的基因组表征、阐明种群之间的细胞分类关系、鉴定遗传畸变以及了解染色体进化趋势 3,4,5。通常，核型描述包括染色体数量、绝对和相对染色体长度、初级和次级收缩位置、异色性片段分布、rDNA 位点编号和位置以及其他 DNA 序列特征，以及核型不对称性 6,7,8。在核型参数中，不对称性由染色体长度（染色体间不对称）和着丝粒位置（染色体内不对称）的变化决定。核型不对称是反映染色体形态的重要特征，广泛用于植物细胞分类学 9,10,11,12。

通常，染色体标记物的缺失会限制核型分析并阻碍单个染色体的鉴定。近年来，Giemsa 染色、荧光条带和荧光原位杂交 （FISH） 在植物染色体分析中越来越受欢迎。双重荧光染色方法，如 CMA（色霉素 A3）/DAPI（4,6-二氨基-2-苯基吲哚）染色和 PI（碘丙酯）/DAPI 染色（称为 CPD 染色），揭示了染色体上富含 GC 和富含 AT 的异色性区域 4,13。在植物有丝分裂的中期或厚层中，重复的 DNA 序列或长 DNA 片段可通过 FISH 杂交在植物种群中产生特异性信号 14,15,16。

荧光条带和 FISH 信号为染色体鉴定提供了有用的标记物。通过测量染色体长度、分析荧光条带特征和比较 FISH 信号差异，可以构建不同植物种质或群体的详细分子细胞遗传学核型。这些核型有效地显示了各种种质或群体中的染色体形态，从而能够比较异染色质分布和 DNA 序列定位，并鼓励进一步研究 4,8,17。分子细胞遗传学核型比较可以为相关群体的系统发育关系和染色体进化提供有价值的见解 8,14,18,19。

石蒜属是孤挺花科中一个多样化且有趣的群体，以其多年生鳞茎而闻名。它由大约 20 个物种组成，其中 15 个是中国特有物种，展示了丰富的生物多样性。该属仅分布在东亚的暖温带和亚热带地区，包括中国西南部、韩国南部和日本，少数种群延伸到印度北部和尼泊尔20。早期的细胞遗传学研究主要涉及染色体计数，以确定该属的基本染色体数并描述特定种群的染色体形态，主要集中在 Lycoris radiata21 上。在该属中观察到的总染色体数从 12 到 33 或 44 不等，分别代表二倍体、异常二倍体、三倍体、四倍体和非整倍体水平。基本染色体编号 x 是 6、7、8 和 11。

石蒜 （L'Hér.）草本植物是 石蒜 属的一个著名物种，广泛分布于中国22.它在轻松、潮湿的环境中茁壮成长，并通过小球茎繁殖。这些球茎含有石蒜碱和加兰他敏（两种关键的药物化合物）几个世纪以来一直用于传统中医。 Lycoris aurea 还以其秋天醒目的红色花朵和冬季常绿叶子吸引着园艺家。然而，所有研究的 Lycoris aurea （L'Hér.） 的形态相似性草药种群对使用传统细胞学方法进行染色体鉴定提出了重大挑战。

在中期或厚皮染色体上用重复的 DNA 序列和寡核苷酸探针克隆 FISH、fosmid 或 BAC（细菌人工染色体）已用于核型分析 23,24,25、比较细胞遗传学分析26,27、细胞遗传学图谱构建28,29 和染色体特异性测定30.最近，FISH 技术已应用于石蒜种群的染色体分析31。尽管石蒜种群中的染色体数量和核型不同，但总染色体数量保持不变，观察到三种基本类型:中央着丝粒染色体 （M-）、远端着丝粒染色体 （T-） 和近端着丝粒染色体 （A-）。此外，在自然种群中观察到不同的染色体形状和大小32。

RNA 荧光原位杂交 （FISH） 可用于检测染色体变化，例如着丝粒融合、倒位、基因扩增和片段缺失。荧光原位杂交 （RNA-FISH） 技术能够对染色体进行高分辨率视觉分析，以检测和识别多种复杂变化，包括染色体中心区域的融合、新染色体结构的形成、染色体区域的反转、基因或基因片段的扩增以及特定染色体区域的基因序列丢失33.500 个克隆中有 5 个在中央着丝粒染色体 （M-） 的着丝粒区域显示强烈的 FISH 信号，但在远端着丝粒染色体 （T-）上没有显示强 FISH 信号34。每条染色体上独特的 FISH 信号分布模式能够识别单个染色体，这在以前使用传统染色方法在 Lycoris 种群中具有挑战性31。目前，关于 金黄色石蒜 （L'Hér.） 分子细胞遗传学的研究很少。Herb 的文章中，强调迫切需要在该领域进行进一步研究。

在这项研究中，金 黄色石蒜 （L'Hér.） 的 8 条分化良好的中期染色体使用酶浸和火焰干燥 （EMF） 方法制备草药种群。CPD 染色和 45S 和 5S rDNA 探针用于 FISH 鉴定。使用来自染色体测量、荧光条带以及 45S 和 5S rDNA FISH 信号的组合数据构建这些群体的详细分子细胞遗传学核型。为每个群体计算 6 种不同的核型不对称指数，以确定它们之间的核型关系。分子细胞遗传学核型数据的评估为八个群体的基因组分化和进化关系提供了重要的见解，有可能重塑对 石蒜 染色体的理解。

方案

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本研究中使用的试剂和设备在 材料表中有详细说明，而使用的探针在 补充文件 1 中提供。

1. 顶端染色体的制备

  1. 通过水培生根。去除球茎的地上部分后，将其放入装满水的锥形瓶中，按照 Song 等人 35 描述的方法每 3 天更换一次水。
  2. 当它们达到约 1.0-2.0 厘米的长度时，切除积极生长的根尖，并在 28°C 的饱和α - 溴萘中处理它们 1.0 小时。
  3. 将根尖切成约 1 厘米，并将它们在室温（约 20-25 °C）下以 3:1 的体积比放入新鲜制备的甲醇和冰醋酸混合物中 2-3 小时。然后，将它们储存在 4 °C 的冰箱中，如 She 等人 36 所述。
  4. 用双蒸水彻底清洗固定的根尖 （2-3 mm）。
  5. 在 pH 值为 4.5 的 0.01 mM 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中制备纤维素酶和果胶水解酶的混合物，其中纤维素酶和果胶水解酶各为 1%。将预处理过的根尖放入混合物中，并在 28 °C 下消化 1.0-1.5 小时。
  6. 用双蒸水清洗消化的根尖，将它们转移到载玻片上，然后用细尖镊子用固定剂彻底捣碎。
  7. 在酒精灯的火焰上擦干玻片，直到水雾消失。在相差显微镜下，选择具有 5 个以上分裂期且没有重叠染色体的载玻片。将载玻片储存在 -20 °C 以备将来使用。

2. CPD 染色

  1. 通过将 PI 和 DAPI 添加到 30% （v/v） 抗荧光衰减器中制备 CPD 溶液，其中 PI 的浓度为 0.6 μg·mL-1，DAPI 的浓度为 3 μg·mL-1。
  2. 将染色体载玻片在 65 °C 下干燥 30 分钟。
  3. 每个染色体载玻片添加 100 μL RNase A 稀释剂（RNase A 储存溶液用 2x SSC（盐水柠檬酸钠）稀释 100 倍，最终浓度为 100 μg/mL）。盖上载玻片并在 37 °C 潮湿的腔室中加热 30-60 分钟。
  4. 在室温下用 2x SSC 洗涤染色体载玻片，间隔 3 次，每次 5 分钟。
  5. 在室温下洗涤染色体载玻片 1-2 分钟。
  6. 每个染色体载玻片添加 200 μL 胃蛋白酶稀释剂（胃蛋白酶储存溶液用 0.01 N HCl 稀释 100 倍，以达到 5 μg/mL 的最终浓度）。盖上载玻片并在 37 °C 的潮湿室中孵育 5-20 分钟。
  7. 在室温下用超纯水洗涤染色体切片 2 分钟，然后在室温下用 2 xSSC 洗涤两次，每次 5 分钟。
  8. 用甲醇:冰醋酸 （3:1） 溶液固定载玻片 10 分钟。
  9. 在室温下用 2x SSC 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  10. 用 70%、95% 和 100% 乙醇在 -20 °C 下各处理 5 分钟，然后在室温下干燥。
  11. 取处理过和干燥的染色体载玻片，向每张载玻片中加入 30 μL CPD 染色液，用 24 mm x 50 mm 盖玻片覆盖，在黑暗中染色 30 分钟以上。广泛的染色体材料应在一夜之间染色。
  12. 在荧光显微镜下观察染色体载玻片，使用绿色激发滤光片 （WG） 进行 PI 染色，使用紫外线滤光片 （UV） 进行 DAPI 染色。使用兼容的软件捕获图像。
    1. 通过两个滤光片调整曝光时间，以在图像捕获过程中获得相似的红色和蓝色荧光强度。CPD 图像是从用 PI 和 DAPI 染色的灰度图像中获得的。使用 Adobe Photoshop 软件进行染色体测量和图像处理。

3. 荧光原位杂交

  1. 制备杂交溶液:FAD （10 μL）、ssDNA （2 μL）、20× SSC （2 μL）、5S rDNA （1 μL）、45S rDNA （1 μL） 和 50% 硫酸葡聚糖 （4 μL）。制备后，离心混合溶液（2500 x g ，5-10 分钟，在室温下）并将其置于冰上。
  2. 将扫描的载玻片放入 65 °C 的烘箱中 30-60 分钟。
  3. 取出烘烤的载玻片，加入 100 μL 70% FAD 变性溶液，盖上盖玻片，在 85 °C 分子杂交炉中变性 2.5 分钟。
  4. 取下盖玻片，立即将载玻片浸入 70%、90% 和 100% 冷乙醇中，连续脱水 5 分钟。
  5. 取出载玻片，让它们在室温下干燥 30 分钟以上。
  6. 向载玻片中加入 20 μL 混合溶液，将盖玻片轻轻放在顶部，直到液体完全扩散，然后在室温下放置 10 分钟以润湿载玻片的覆盖区域。
  7. 将载玻片放入浸泡有 2× SSC 的杂交培养皿中（杂交培养皿应是一个大培养皿，盖子用锡箔包裹，以便于避光作）并在 37 °C 下孵育过夜（至少 6 小时）。
  8. 用 3 μg·mL-1 DAPI 封植在 30% （v/v） 的 Vectashield H-100 溶液中，对染色体进行复染。使用兼容的软件捕获图像，分别由滤光片的紫光激发 DAPI 的蓝色荧光和 PI 的红色荧光由绿光激发。
    注:按照 She 等人 36 描述的方法，在先前 CPD 染色的载玻片上使用 45S 和 5S rDNA 探针进行 FISH 杂交。

4. 核型分析

  1. 按照 She 等人描述的方法，为每个群体选择五个中期有丝分裂细胞，其中染色体分散良好（无重叠）且适度浓缩（染色体不应最大聚集，但末端不应聚集在一起）。
  2. 通过选择细胞分裂过程中浓度最高的五条染色体来确定每条染色体的绝对长度。
  3. 细致而精确地测量每条染色体的长臂 （L） 和短臂 （S） 的长度，以及染色体上每条荧光色素带的大小。
  4. 计算以下参数:（1） 相对染色体长度（RL，单倍体百分比）;（2） 臂比（AR = L/S，长臂/短臂）;（3） 单倍体染色体总长度 （TCL;核型长度）;（4） 平均染色体长度 （C）;（5） 荧光带的大小（荧光带相对于染色体长度的百分比）;（6） 从着丝粒到 rDNA 位点的距离;（7） 平均着丝粒指数 （CI，计算方法是每条染色体的短臂长度除以该染色体的总长度，然后取这些值的平均值）;（8） 核型不对称的 4 个不同指标，包括着丝粒指数 （CVCI）、变异系数 （CV）、染色体长度变异系数 （CVCL）、平均着丝粒不对称系数 （MCA） 和 Stebbins 不对称类别。
    注意:参考 Paszko10 和 Peruzzi 等人 11 的方法计算不对称指数。根据 Levan 的 5 种分类方法对不同臂比的染色体进行分类。排列 Lycoris aurea （L'Hér.） 的染色体草本按长度降序排列，如 Han 等人方案37 中所述。
  5. 根据染色体测量数据结合荧光带信息以及 rDNA-FISH 的位置和大小绘制染色体核型模式，确保方法的精度和准确性。
  6. 可视化 8 个群体的核型不对称关系是提供清晰见解的关键步骤。这是通过二维散点图实现的，二维散点图用于获取其 MCA 和 CVCL。
  7. 按照 She 等人 38 的方法，使用 Gower 相似系数（一个关键组成部分）执行主坐标分析 （PCoA）。
  8. 计算六个定量参数（x、2n、TCL、MCA、CVCL、CVCI）以确定八个群体的细胞遗传学核型。
  9. 使用数据分析和可视化程序进行统计分析，以生成基于 UPGMA 的树状图和 PCoA 散点图。

结果

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通过采用细致的酶浸和火焰干燥 （EMF） 方法，分散且分化良好的金黄色石蒜 （L'Hér.） 中期染色体获得草药，并构建了 Lycoris aurea 的细胞遗传学染色体核型 （图 1）。由于形态差异减少，具有最高凝聚程度的中期染色体不适合进行核型分析。然而，由于单倍体染色体 （TCL） 的总长度在种群之间是可比的，因此可以通过比较 TCL 值的差异来区分不同金黄色石蒜种群的核型。表 1 显示了 8 个金黄色石蒜种群的核型特征和核 DNA 含量。荧光条带的分布以及 45S 和 5S rDNA 位点的位置如表 2 所示。图 2 显示了染色体的测量值以及荧光条带特性以及 45S 和 5S rDNA FISH 信号的位置和大小。

二倍体染色体数如下:GXTL 的 2n = 16 = 8m + 8t，HBFC 的 2n = 14 = 8m + 6t，GZDS 的 2n = 14 = 8m + 6t，HNZX 的 2n = 16 = 6m + 10t，HBBD 的 2n = 14 = 8m + 6t，HNXN 的 2n = 14 = 8m + 6t，HBWF 的 2n = 16 = 6m + 10t，SCLS 的 2n + 1 = 15 = 7m + 8t（表 1）。正如 She 等人 4 的方案中所述，八个 金黄色 乳杆菌种群的中期染色体很小，平均染色体长度范围为 1.01 μm （HNZX） 至 2.08 μm （GZDS），TCL 范围为 16.14 μm （HNZX） 至 29.13 μm （GZDS）。八个种群的 TCL 与报道的核 DNA 含量相关（表 1）。在 HNXN （1.52-3.81） 中观察到最小的相对长度范围 （RRL），而在 GZDS （2.73-5.86） 中观察到最大。群体 HNXN 和 GZDS 的染色体长度变化最小和最大。基因组的平均着丝粒指数 （CI） 在 61.02 ± 5.63 （群体 HBFC） 和 70.70 ± 4.63 （群体 HBWF） 之间变化。群体 HBFC 显示着丝粒指数的变化最小，而群体 HBWF 表现出最广泛的变化。

核型由中着丝粒 （m） 和端着丝粒 （t） 染色体组成（表 1; 图 2），代表了所研究的 8 个群体中最常见的染色体形式。 表 1 提供了八种不同的核型不对称指数。在这些指标中，着丝粒指数的变异系数 （CVCI） 和平均着丝粒不对称性 （MCA） 表征了染色体内的不对称性，而染色体长度的变异系数 （CVCL） 测量染色体间的不对称性。CVCI 和 MCA 的范围如下:CVCI = 10.97 （HBBD） 到 18.25 （HBWF），MCA = 28.85 （HNZX） 到 39.30 （HBWF）。这些值一致表明 HBBD 具有最低的染色体内不对称性，而 HBWF 具有最高的染色体内不对称性。CVCL 的范围为 14.98 （GZDS） 至 23.32 （HBWF），表明 GZDS 表现出最不对称的核型，而 HBWF 在八个种群中表现出最不对称的核型。根据 Stebbins9 的分类原则，这些核型属于 1B 类，表明所有研究的人群都具有相对对称的核型。

八种 Lycoris aurea （L'Hérit.） 之间的核型不对称关系。使用 CVCI 与 CVCL 和 MCA 与 CVCL 的二维散点图来说明草药种群（图 3）。这些群体的核型结构，如三对参数 CVCI 、 CVCL 和 MCA 所揭示的那样，具有重要的意义。这些参数表现出类似的核型不对称性。散点图的结果突出了该研究的潜在影响，表明群体 HNXN 具有最对称的核型，而群体 HBFC 和 HBWF 分别表现出最多的染色体内和染色体间不对称性（图 3）。

本研究根据具有 5 个核型参数的 UPGMA 树图，将 8 个 金黄色 石蒜种群细致地分为三大类（图 4）。第一个集群由群体 SCLS 表示，形成一个独立的分支。第二组由 HNXN 和 HBWF 组成。第三个聚类分为两个子组:一个仅包含群体 HBFC，而另一个包括群体 HBWF、GZDS 和 GXTL，群体 HBBD 和 GZDS 聚集在一个较小的分支中。主坐标分析 （PCoA） 揭示的研究人群之间的 karyological 关系如图 5 所示。PCoA 散点图表明可以将 8 个总体分为两组，置信水平为 68.36%。第一组包括 HBWF 、 HBBD 和 GXTL ，前三个群体紧密聚集在一起。第二组由 HBFC、HNXN、HNZX 和 SCLS 组成，其中 HBFC 占据两组之间的中间位置，而 SCLS 位于最孤立的位置（图 5）。

CPD（碘化丙啶和 DAPI 的组合）和 DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）反向染色是用于观察核结构和染色质分布的标准技术。这项研究的结果揭示了 8 个金 黄色石蒜 种群 （L'Hérit.） 中明显的异染色质现象。草本植物（图 1 和 图 2; 表 2）。每个群体的 FISH 杂交结果表明，所有染色体区域对应于 45S 和 5S rDNA 基因座。CPD 频段的特性如图 1A、C、E、G、I、K、M、O 所示。

在 HBFC 和 HBBD 人群中，在着丝粒和着丝粒周围区域观察到 CPD 条带（图 1G，K;图 2D，F）。然而，某些染色体没有显示 CPD 条带:SCLS 中的第 3 和第 8 条染色体，HNXN 中的第 1 条染色体，HNZX 中的第 1 条染色体，HBWF 中的第 1 条染色体，GZDS 中的第 2 条染色体，以及 GXTL 中的第 2 条染色体（图 1A，C，E，I，J，M，O;图 2A-C，E，G，H）。值得注意的是，在 SCLS 和 HNXN 中，在 5 、 6 和 7 对染色体的短臂末端，在 HNZX 中，在 4 、 5、6、7 和 8 对上，以及在 HBFC 中，在第 5 、 6 和 7 对上也发现了 CPD 条带。此外，CPD 条带存在于 HBWF 中 4 、 5 、 6 、 7 和 8 号染色体的短臂端，HBBD 中 5 、 6 和 7 号染色体的短臂末端，以及 GXTL 中 5 、 6、 7 和 8 号染色体的短臂末端（图 1A 和图 2A）。

FISH 杂交后，DAPI 反向染色在 GZDS 中 5 、 6 和 7 号染色体的中心颗粒周围形成明亮的荧光条带。这些条带称为后 FISH DAPI + 条带，表明这些异染色质区域包含大量 A-T 碱基对（图 2G）。在 8 个人群中观察到的（周围）着丝粒 CPD 条带的范围为 25.00% 至 57.14%（表 2），而末端 CPD 条带的总数量范围为 40.00% 至 71.43%（表 2）。在群体 GZDS 中，后 FISH DAPI+ 条带与核型长度相关，占总量的 42.86%。FISH 后 rDNA CPD 条带、非 rDNA CPD 条带和 DAPI+ 条带的大小在 金黄色石蒜 （L'Hérit） 的各种染色体对之间显著不同。草本植物（图 2; 表 2）。

使用 FISH 技术将 45S 和 5S rDNA 探针插入 CPD 染色的染色体中，如图 1 所示。金 黄色石蒜 （L'Hérit） 八个种群中 45S 和 5S rDNA 位点的数量和位置摘要。草本如 表 2 所示，如图 2 所示。值得注意的是，八个群体之间 rDNA 基因座的数量、大小和位置的显着差异突出了这些发现的重要性。八个种群总共有 30 个 45S rDNA 位点。其中，4 个基因座 （13.33%） 位于中央着丝粒区域，9 个基因座 （30.00%） 位于近中央着丝粒区域，17 个基因座 （56.67%） 位于各自染色体臂的末端区域（图 2; 表 2）。

在 GXTL 群体中，在 4 号染色体短臂的着丝粒区域发现一个 45S rDNA 基因座信号，而另一个信号位于 5、6、7 和 8 号染色体长臂的着丝粒区域（图 1P; 图 2G）。在 HBFC 群体中，一个 45S rDNA 基因座位于 4 号染色体短臂的着丝粒区域，三个基因座位于 5 、 6 和 8 号染色体短臂的着丝粒周围异染色质区域（图 1H; 图 2D）。在 GZDS 群体中，45S 基因座位于偏着丝粒 4 号染色体短臂的着丝粒区域（图 1N; 图 2G）。在 HNZX 中，在染色体对 4、5、6、7 和 8 的短臂末端区域观察到五个 45S rDNA 位点（图 1H; 图 2D）。HBBD 中 45S 位点的分布（图 1J; 图 2E）和 HNXN（图 1L; 图 2F）相似，在 4 号染色体短臂的着丝粒区有一个位点，在 5 、 6 和 7 号染色体短臂的着丝粒区有 3 个位点。

在 HBWF 中，5 个 45S rDNA 基因座信号出现在染色体对 4、5、6、7 和 8 的短臂着丝粒区域（图 1N; 图 2G）。在 SCLS 中，在染色体对 1 和 2 的短臂着丝粒区域以及染色体对 5 和 6 的短臂着丝粒周围区域发现一个 45S rDNA 基因座信号（图 1P; 图 2H）。对于 5S rDNA 位点，在 8 个分类群中共鉴定出 9 个，其中 3 个 （33.33%） 位于近端区域，3 个 （33.33%） 位于着丝粒周围区域，3 个 （33.33%） 位于相应染色体臂的末端区域（图 2; 表 2）。在 GXTL 中，一个 5S rDNA 基因座信号出现在 6 号染色体对长臂的末端附近（图 1P; 图 2G）。5S 位点在 HBFC 中的分布相似（图 1H; 图 2D）和 GZDS（图 1N; 图 2G），两者在 7 号染色体短臂的近端区域包含一个 5S rDNA 位点。在 HNZX 中，在 8 号染色体长臂的末端附近发现了一个 5S rDNA 位点（图 1H; 图 2D），而在 HBBD 中，在 7 号染色体中鉴定出 5S rDNA 位点（图 1J; 图 2E）。在 HBWF 中，两个 5S rDNA 位点出现在 4 号和 8 号染色体长臂的末端附近，另外两个出现在 7 号染色体的长臂中，一个在着丝粒区域，一个在末端附近（图 1N; 图 2G）。

45S 和 5S rDNA FISH 信号的组合，以及末端 CPD 片段特征，有效地区分了来自不同金 黄色石 蒜 （L'Hérit） 种群的所有有丝分裂染色体。药草。在 SCLS 、 HBFC 、 HBBD 、 GZDS 和 GXTL 群体中，1 号染色体在着丝粒区域表现出强烈的 CPD 信号。2 号染色体在着丝粒区域表现出较强的 CPD 信号，GZDS 和 GXTL 除外。3 号染色体在着丝粒区域显示强 CPD 信号，SCLS 除外。4 号染色体在着丝粒区域始终表现出强烈的 CPD 信号。对于 5 、 6 和 7 号染色体，在短臂末端观察到强烈的 CPD 信号。4 号染色体在短臂末端也显示出强烈的 45S rDNA 信号，而 5 号和 6 号染色体在其末端区域具有很强的 45S 信号，GZDS 除外。值得注意的是，GZDS 群体中存在强烈的 DAPI 信号。此外，在 HBFC、HBWF、HBBD 和 GZDS 群体中，7 号染色体近端区域出现微弱的 5S rDNA 信号。

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图 1:八条 Lycoris aurea （L' Hér.） 的有丝分裂染色体草本种群。 检查来自八种不同的 Lycoris aurea （L' Herit.） 的有丝分裂中期染色体。显示了草药种群，包括种群 SCLS （A，B）、种群 HNXN （C，D）、种群 HNZX （E，F）、种群 HBFC （G，H）、种群 HBWF （I，J） 和种群 HBBD （K，L）。CPD 染色后，使用 FISH 与生物素标记的 45S 和地高辛标记的 5S rDNA 探针进行 GZDS （M，N） 和 GXTL （O，P） 杂交。CPD 染色后生成的染色体图像显示 45S（绿色）和 5S（红色）rDNA 信号。用 DAPI 染料对总 DNA 进行逆向染色，得到蓝色。比例尺 = 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 2:八个 Lycoris aurea （L' Hér.） 的染色体核型图草本种群。八个金黄色石蒜种群 （L' Herit.） 的染色体模式图Herb 揭示了荧光条带特征，以及 45S 和 5S rDNA FISH 信号的位置和大小。种群 SCLS 、 HNXN 、 HNZX 、 HBFC 、 HBWF 、 HBBD 、 GZDS 和 GXTL 分别用 （A-H） 表示。纵坐标刻度表示染色体的相对长度（该染色体在单倍体基因组中的百分比），顶部的数字表示染色体的序列号。请单击此处查看此图的较大版本。

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图 3:8 种 Lycoris aurea （L' Hér.） 的散点图基于三个核型参数的草本种群。 （A） CVCI 指数是相对于 CVCL 指数绘制的。（B） MCA 指数是相对于 CVCL 指数绘制的。显示了人群 SCLS 、 HNXN 、 HNZX 、 HBFC 、 HBWF 、 HBBD 、 GZDS 和 GXTL 。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 4:8 种 Lycoris aurea （L' Hér.） 的 UPGMA 树状图草本种群。 UPGMA 树状图基于八个金黄色石蒜 （L' Hér.） 的参数 x、2n、TCL、MCA、CVCL 和 CVCI。草药种群:SCLS、HNXN、HNZX、HBFC、HBWF、HBBD、GZDS 和 GXTL。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 5:8 种 Lycoris aurea （L' Hér.） 的 PCoA基于六个核型参数的草本品种。 PCoA 基于参数 x、2n、TCL、MCA、CVCL 和 CVCI，分别表示 SCLS、HNXN、HNZX、HBFC、HBWF、HBBD、GZDS 和 GXTL。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1:八种 Lycoris aurea （L' Hér.） 的名称草本种群。请点击此处下载此表格。

表 2:荧光染料条带和 rDNA 位点在 8 种金黄色石蒜 （L' Hér.） 中的分布草本种群。请点击此处下载此表格。

补充文件 1:本研究中使用的探针。请点击此处下载此文件。

讨论

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Lycoris aurea （L'Hér.） 的制备草本根染色体涉及几个关键步骤:（1） 通过水培培养根，（2） 用饱和的 α-溴萘处理根尖，（3） 使用醇-乙酸溶液固定根，（4） 用酶溶液对根尖进行酶解，以及 （5） 彻底压扁消化的根并在酒精灯火焰上干燥载玻片。

准确的染色体测量对于细胞遗传学研究中的核型分析至关重要。染色体应表现出明显的浓缩和明确定义的边界;否则，准确计算染色体参数将变得具有挑战性5.先前的细胞遗传学研究表明，有丝分裂染色体的形态分化取决于凝聚的程度 4,36。当浓缩不充分时，染色体臂的末端可能仍会去凝集，导致染色体边界不明确。然而，当染色体达到最大浓缩时，染色体之间的形态差异会减小。因此，选择具有适度浓缩的染色体对于染色体鉴定和测量至关重要，尤其是在染色体较少的群体中。

探针标记对于成功的 FISH 原位杂交至关重要，特别是对于 5S rDNA 探针溶液。由于 5S rDNA 序列短，PCR 标记的靶序列浓度通常较低，导致杂交信号较弱。然而，直接合成荧光素标记的探针会产生更强的杂交信号并简化过程。对于 45S rDNA 探针溶液，将 拟南芥 5.8S、18S 和 25S rRNA 编码区的部分序列用 6-羧基四甲基罗丹明 （TAMRA） 标记在 5' 和 3' 末端，然后混合。使用来自 拟南芥 5S rRNA 基因编码区的 1-59 和 60-118 个核苷酸序列获得荧光素 5S rDNA 探针溶液，每个序列在 5' 端用 6-羧基荧光素 （6-FAM） 标记，然后混合。

在这项研究中，我们利用 DAPI 和 PI 染料在 DNA 结合方面的差异，并将它们组合以获得清晰的荧光条带。PI（碘化丙啶）染料可以穿透细胞膜并与细胞内的 DNA 分子结合。相比之下，DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）优先与富含 AT 的 DNA 区域结合，提供清晰、高对比度的染色。由于这些互补特性，DAPI 和 PI 经常一起使用，称为 CPD 染色，以同时收集细胞核和细胞质的信息。CPD 和 DAPI+ 条带的存在、位置和大小的差异揭示了 8 个金石蒜种群的显著异染色质分化。CPD 染色显示，在着丝粒和着丝粒周围区域以及末端着丝粒染色体内均富含 GC 含量的异染色质区域。

核型不对称性的研究是一种流行、经济实惠且广泛使用的细胞遗传学分类学方法，它包含一系列参数和指标，包括定性和定量测量、Stebbins 分类参数和各种定量指标（例如，Paszko10;Peruzzi 等人 11）。其中，R 比值和 CVCL 用于测量染色体不对称性，而 CVCI 和 MCA 代表染色体不对称的关键指标。值得注意的是，CVCL 被认为是估计染色体间不对称性10 的稳健统计参数，而染色体不对称性度量 （MCA） 被认为是评估染色体内不对称性11 的有效指标。为了最好地表示群体之间的核型不对称性，建议使用二维散点图，在 x 轴和 y 轴上分别放置两个不对称估计器，其中每个样本表示为一个点11,12。结果表明，CVCL vs.CVCI 以及 MCA 与CVCL 有效地说明了 Lycoris aurea （L′Herit） 八个不同种群之间的核型不对称关系。Herb，支持这些指数在评估染色体不对称性方面的可靠性。

为了比较 8 个人群之间的核型并重建核型关系，本研究应用了 Peruzzi 等人 11 提出的方法，使用参数 x、2n、TCL、MCA、CVCL 和 CVCI。研究结果显示，HBWF 、 GZDS 、 HBBD 和 GXTL 人群密切相关，HBFC 位于这些群体之间。因此，基于这六个参数的 PCoA 被证明是区分八个群体之间关系的非常有效的方法。然而，某些复杂的模式也从构建的分子进化树中出现。例如，虽然 HNZX 在分子系统发育树中与 HBWF 密切相关，但在 PCoA 散点图中则更远。这种复杂性凸显了采用多种定量方法来预测 Lycoris 内核型进化趋势的重要性，以补充分子分类特征。

本研究的植物取样于中国中西部，包括广西田林县 （GXTL）、湖北省方县 （HBFC）、贵州省独山县 （GZDS）、湖南省紫兴县 （HNZX）、湖北省巴东县 （HBBD）、湖南省新宁县 （HNXN）、湖北省五峰县 （HBWF） 和四川省庐山县 （SCLS）。凭证标本保存在怀化大学植物标本馆。本研究发现，45S 和 5S rDNA FISH 信号与末端 CPD 片段特征的组合有效地区分了来自不同金 石蒜 （L′Herit） 种群的所有有丝分裂染色体。药草。此处介绍的方案旨在研究不同种群 Lycoris aurea （L'Herit） 之间的异染色质分布。药草。CPD （PI 和 DAPI 的组合） 和 DAPI （4′，6-二脒基-2-苯基吲哚） 反向染色是观察核结构和染色质分布的既定技术。用于染色体 FISH 杂交的 18S-5.8-26S rRNA 基因区域（45S rDNA 区域）和 5S 核糖体 DNA 的直接荧光标记非常简单，并提供可靠的杂交信号。这种定性区分在分析各种人群时将越来越有价值。

这种方法最适合能够快速培养根尖培养的植物物种，因为在活跃的有丝分裂期间需要根尖培养。由于 5S 序列短，本研究使用 拟南芥 5S rRNA 基因编码区的 1-118bp 核苷酸序列作为 5S rDNA 探针。由于其序列短且信号弱，该方法仅对鉴定 5S rRNA 基因 1-118bp 区碱基相对保守的物种有效。选择具有中等浓缩的中期染色体对于该方法的成功至关重要。染色体凝结与根收割的时间、预处理持续时间和火焰烘烤密切相关。因此，该技术需要对每个步骤进行精确控制，以确保实验成功。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者已声明不存在相互竞争的利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了中国自然科学基金 （32070367） 的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
醇尚康生物科技（上海）有限公司A500737-0005（70%， 90%， 100%）
1&次;TNTSangon Biotech （Shanghai） Co.， Ltd. 天地桑贡生物科技（上海）有限公司B5481081×， 10×
2&次;SSCSangon Biotech （Shanghai） Co.， Ltd. 尚贡生物科技（上海）有限公司B5481092&次;， 20&次;
45S rDNA桑贡生物科技（上海）有限公司TAMRA 添加到两端（5 ' 和 3' 端）
4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Sangon Biotech （Shanghai） Co.， Ltd.E60730320 毫升
5S rDNA桑贡生物科技（上海）有限公司5寸端加6-FAM（FITC）
Adobe Photoshop软件Adobe Systems IncorporatedCS6
阿尔法溴萘贡生物科技（上海）有限公司A602718饱和
防倦怠剂尚贡生物科技（上海）有限公司Vectashield H-100010 mL
生化培养箱上海逸恒科学仪器有限公司LRH-70
纤维素酶桑贡生物科技（上海）有限公司A42606810 克
柠檬酸尚贡生物科技（上海）有限公司A50170210 克
去离子甲酰胺 （FAD）Sangon Biotech （Shanghai） Co.， Ltd.A600211-05000.7
硫酸葡聚糖尚工生物科技（上海）有限公司A42822910 mL
荧光原位杂交仪美国/Abbott ThermoBriteS500-24
荧光显微镜奥林巴斯 中国 Co.ltdBX60
冰醋酸桑贡生物科技（上海）有限公司A501931500 mL
HCl 阿拉丁试剂 上海有限公司H399657500 mL
制冰机丹鼎 上海国际贸易有限公司ST-70
徕卡生物显微镜德国徕卡仪器有限公司DM6000B
甲醇桑贡生物科技（上海）有限公司A601617500 mL
MetMorph 软件Molecular Devices版本 7.35
烘箱Thermo Scientific™赫拉特姆™THM#51028152
果胶酶桑贡生物科技（上海）有限公司A00429710 克
胃蛋白酶生奥生物科技（上海）有限公司1.07185100 克
碘化丙啶（PI）尚能生物科技（上海）有限公司A4252591 g
RNaseASangon Biotech （Shanghai） Co.， Ltd.R464210 毫克
鲑鱼精子 DNA（ssDNA）阿拉丁试剂 Co. Ltd. （上海）D1198711 克
酸钠阿拉丁试剂 Co. Ltd. （上海）S18918310 g
Windows 10.0 统计资料 用于统计分析
桑柠檬

参考文献

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