本实验方案利用PI与DAPI联合染色法、针对18S-5.8-26S核糖体RNA基因区域（45S rDNA区域）的荧光原位杂交（FISH）以及5S核糖体DNA探针，研究了忽地笑（Lycoris aurea (L′Her) Herb）八个种群中的异染色质分布情况。
本文内容
摘要
摘要
为了了解八个群体的核型变异，通过染色体测量、荧光带型以及rDNA FISH信号，系统建立了详细的核型。每个群体中45S rDNA位点的数量从一对到五对不等，最常见的核型含有四对45S rDNA位点。45S rDNA位点主要位于染色体的短臂及末端区域，而5S rDNA位点则主要分布在短臂的末端或近端区域。HBWF、HNXN、HBBD和HNZX群体表现出相似的45S rDNA位点分布模式，GXTL、HBFC和SCLS群体亦如此，表明具有相似45S rDNA位点分布的群体之间存在较近的亲缘关系。所有研究群体的核型均为对称型，包含稳定的和亚稳定的着丝粒，或完全由稳定的着丝粒组成。MCA与CVCL的散点图可有效区分它们的核型结构。分析共包含六个定量参数（x、2n、TCL、MCA、CVCL、CVCI）。此外，结果表明，基于这六个参数的主坐标分析（PCoA）是确定这八个群体间生物学核型关系的可靠方法。Lycoris群体的染色体基数为x = 6–8。结合本研究结果与已有文献，从基因组大小、异染色质、45S和5S rDNA位点以及核型不对称性等方面讨论了这些群体的基因组分化。
引言
Lycoris 是一个包含多种重要园艺植物的科1。Lycoris aurea (L'Hér.) Herb. 是一种具有悠久历史的传统中草药植物。植物化学分析表明，Lycoris aurea (L′Her.) Herb. 含有加兰他敏及其他生物碱，可增强乙酰胆碱敏感性，作为胆碱酯酶抑制剂在治疗阿尔茨海默病方面具有潜在应用价值2。
在高等植物中，核型分析对于整合遗传图谱与物理图谱具有重要意义，并在植物生物学中具有重要的实际应用价值。该分析可用于染色体水平的基因组表征、明确种群间的细胞分类学关系、鉴定遗传异常以及理解染色体演化趋势3,4,5。通常，核型描述包括染色体数目、染色体的绝对长度与相对长度、主缢痕和次缢痕的位置、异染色质片段的分布、rDNA位点的数量与位置以及其他DNA序列特征，还包括核型不对称性6,7,8。在诸多核型参数中，不对称性由染色体长度的变异（染色体间不对称性）和着丝粒位置的差异（染色体内部不对称性）决定。核型不对称性是反映染色体形态的重要特征，广泛应用于植物细胞分类学研究9,10,11,12。
通常，染色体标记的缺失会限制核型分析，并阻碍单个染色体的识别。近年来，吉姆萨染色（Giemsa staining）、荧光带型分析（fluorescence banding）以及荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）已广泛应用于植物染色体分析。双荧光染色方法，如染色霉素A3（chromomycin A3, CMA）/ DAPI（4,6-二氨基-2-苯基吲哚）染色和碘化丙啶（propyl iodide, PI）/ DAPI染色（称为CPD染色），可揭示染色体上的富含GC和富含AT的异染色质区域4,13。在植物有丝分裂的中期或粗线期，重复DNA序列或长片段DNA可通过FISH杂交在植物群体中产生特异性信号14,15,16。
荧光带和FISH信号为染色体鉴定提供了有用的标记。通过测量染色体长度、分析荧光带型特征以及比较FISH信号差异，可构建不同植物种质或群体的详细分子细胞遗传学核型。这些核型能够有效展示各种种质或群体中的染色体形态，便于比较异染色质分布和DNA序列定位，并推动进一步研究4,8,17。分子细胞遗传学核型的比较可为相关群体的系统发育关系和染色体演化提供有价值的见解8,14,18,19。
Lycoris 属是石蒜科中一个多样且引人关注的类群，以其多年生鳞茎而著称。该属约包含 20 个物种，其中 15 个为中国特有，展现出丰富的生物多样性。该属仅分布于东亚的暖温带和亚热带地区，包括中国西南部、韩国南部和日本，少数种群延伸至印度北部和尼泊尔20。早期的细胞遗传学研究主要通过染色体计数来确定该属的基本染色体数目，并描述特定种群的染色体形态，研究重点主要集中于 Lycoris radiata21。在该属中观察到的总染色体数目范围为 12 至 33 或 44，分别代表二倍体、异常二倍体、三倍体、四倍体以及非整倍体水平。其基本染色体数目 x 分别为 6、7、8 和 11。
Lycoris aurea （L'Hér.）Herb.，该属内一个显著的物种 石蒜属 属，广泛分布于中国各地22它在湿润、温和的环境中生长旺盛，通过小鳞茎进行繁殖。这些鳞茎含有两种重要的药用成分——加兰他敏和石蒜碱，已在传统中医中应用了数个世纪。 Lycoris aurea 也因其秋季醒目的红色花朵和冬季常绿的叶片而受到园艺学家的青睐。然而，所有被研究对象在形态上的相似性 Lycoris aurea (L'Hér.) Herb 种群在使用常规细胞学方法进行染色体鉴定时存在重大挑战。
利用含有重复DNA序列的FISH、fosmid或BAC（细菌人工染色体）以及中期或粗线期染色体上的寡核苷酸探针，已广泛应用于核型分析23,24,25、比较细胞遗传学分析26,27、细胞遗传图谱构建28,29以及染色体特异性检测30。近年来，FISH技术已被应用于Lycoris种群的染色体分析31。尽管Lycoris种群的染色体数目和核型存在变异，但总染色体数目保持恒定，观察到三种基本类型：具中部着丝粒的染色体（M-型）、具远端着丝粒的染色体（T-型）和具近端着丝粒的染色体（A-型）。此外，在自然种群中还观察到多样的染色体形态和大小32。
RNA 荧光原位杂交（FISH）可用于检测染色体变化，例如着丝粒融合、倒位、基因扩增和片段缺失。荧光原位杂交（RNA-FISH）技术能够对染色体进行高分辨率的可视化分析，以检测和识别多种复杂的染色体改变，包括染色体中心区域的融合、新染色体结构的形成、染色体区段的倒置、基因或基因片段的扩增，以及特定染色体区域上的基因序列丢失33。在500个克隆中，有5个克隆在中央着丝粒染色体（M-）的着丝粒区域显示出强烈的FISH信号，但在远端着丝粒染色体（T-）上则无信号34。每条染色体上独特的FISH信号分布模式使得能够识别单个染色体，而此前在Lycoris种群中使用传统染色方法难以实现这一目标31。目前关于忽地笑（Lycoris aurea (L'Hér.) Herb）的分子细胞遗传学研究仍十分有限，凸显出该领域亟需进一步深入研究。
本研究采用酶解浸提与火焰干燥法（EMF）制备了Lycoris aurea (L'Hér.) Herb 的八个良好分裂中期染色体样本。通过CPD染色以及45S和5S rDNA探针进行FISH鉴定。结合染色体测量数据、荧光带型以及45S和5S rDNA的FISH信号，构建了这些种群的详细分子细胞遗传学核型。针对每个种群计算了六种不同的核型不对称性指数，以揭示它们之间的核型关系。对分子细胞遗传学核型数据的分析为这八个种群的基因组分化及进化关系提供了重要见解，可能重塑对Lycoris染色体的认知。
方案
本研究中使用的所有试剂和设备详见材料表，所用探针列于补充文件1中。
1. 顶端染色体的制备
- 采用水培法获取根系。去除鳞茎地上部分后，将其置于装有水的锥形瓶中，每3天更换一次水，具体方法参照Song等人的描述35。
- 当根尖生长至约1.0–2.0 cm时，切取活跃生长的根尖，用饱和α-溴萘溶液在28 °C下处理1.0 h。
- 将根尖截取至约1 cm，放入新配制的甲醇与冰醋酸按3:1体积比混合的固定液中，在室温（约20–25 °C）下固定2–3 h，随后按照She等人的方法36，于4 °C冰箱中保存。
- 用重蒸水充分清洗固定后的根尖（2–3 mm）。
- 在pH 4.5的0.01 mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中配制含1%纤维素酶和1%果胶酶的混合酶液。将预处理后的根尖放入该混合液中，在28 °C下酶解1.0–1.5 h。
- 用重蒸水清洗酶解后的根尖，转移至载玻片上，用尖头镊子加入固定液并充分压碎。
- 将载玻片在酒精灯火焰上烘干，直至水雾刚好消失。在相差显微镜下挑选分裂相多于五个且染色体无重叠的片子，于-20 °C保存备用。
2. CPD 染色
- 通过将PI和DAPI加入30%（v/v）抗荧光淬灭剂中，配制CPD染色液，其中PI的浓度为0.6 µg·mL-1，DAPI的浓度为3 µg·mL-1。
- 将染色体玻片在65 °C下干燥30分钟。
- 每张染色体玻片加入100 µL RNase A稀释液（将RNase A储存液用2×SSC（柠檬酸钠盐溶液）稀释100倍，终浓度为100 µg/mL）。盖上玻片，在37 °C湿盒中孵育30–60分钟。
- 用2×SSC在室温下洗涤染色体玻片，每次5分钟，共洗三次。
- 在室温下用2×SSC洗涤染色体玻片1–2分钟。
- 每张染色体玻片加入200 µL胃蛋白酶稀释液（将胃蛋白酶储存液用0.01 N HCl稀释100倍，终浓度为5 µg/mL）。盖上玻片，在37 °C湿盒中孵育5–20分钟。
- 用超纯水在室温下洗涤染色体切片2分钟，随后用2×SSC在室温下洗涤两次，每次5分钟。
- 用甲醇：冰醋酸（3:1）溶液固定玻片10分钟。
- 用2×SSC在室温下洗涤三次，每次5分钟。
- 依次在-20 °C下用70%、95%和100%乙醇各处理5分钟，然后在室温下干燥。
- 取处理并干燥后的染色体玻片，每张加30 µL CPD染色液，覆盖24 mm × 50 mm盖玻片，在避光条件下染色超过30分钟；大量染色体材料建议过夜染色。
- 在荧光显微镜下观察染色体玻片，PI染色使用绿色激发滤光片（WG），DAPI染色使用紫外滤光片（UV），并使用配套软件采集图像。
- 通过调节两种滤光片的曝光时间，使图像采集时红色和蓝色荧光强度相近。CPD图像由PI和DAPI染色的灰度图像合并获得。染色体测量和图像处理使用Adobe Photoshop软件完成。
3. 荧光原位杂交
- 配制杂交液：FAD（10 µL）、ssDNA（2 µL）、20× SSC（2 µL）、5S rDNA（1 µL）、45S rDNA（1 µL）和50%葡聚糖硫酸盐（4 µL）。配制完成后，离心杂交液（2500 x g，室温下5–10分钟），并置于冰上。
- 将扫描后的载玻片放入65 °C的烘箱中，加热30–60分钟。
- 取出烘烤后的载玻片，加入100 µL 70% FAD变性液，盖上盖玻片，在85 °C的分子杂交炉中变性2.5分钟。
- 移去盖玻片，立即将载玻片依次浸入70%、90%和100%的冷乙醇中，每次脱水5分钟。
- 取出载玻片，在室温下干燥30分钟以上。
- 向载玻片上加入20 µL杂交液，轻轻盖上盖玻片，直至液体完全扩散，室温下静置10分钟，使载玻片覆盖区域充分润湿。
- 将载玻片放入盛有2× SSC的杂交盒中（杂交盒应为带盖的大培养皿，外层用锡箔纸包裹，以便避光操作），在37 °C下孵育过夜（至少6小时）。
- 用含3 µg·mL-1 DAPI的30%（v/v）Vectashield H-100封片剂对染色体进行反染色。使用配套软件采集图像，其中DAPI的蓝色荧光由滤光片的紫光激发，PI的红色荧光由绿光激发。
注意：FISH杂交使用45S和5S rDNA探针，在先前经CPD染色的载玻片上进行，方法参照She等36所述。
4. 核型分析
- 根据 She 等人4所述的方法，为每个种群选择五个染色体分散良好（无重叠）且中等凝缩（染色体不应完全聚集，但末端不应成团）的中期有丝分裂细胞。
- 通过在细胞分裂过程中选择五条浓度最高的染色体，确定每条染色体的绝对长度。
- 仔细而精确地测量每条染色体长臂（L）和短臂（S）的长度，以及染色体上每条荧光色素带的大小。
- 计算以下参数：（1）染色体相对长度（RL，单倍体百分比）；（2）臂比（AR = L/S，长臂/短臂）；（3）单倍体染色体总长度（TCL；核型长度）；（4）平均染色体长度（C）；（5）荧光带大小（荧光带长度占染色体总长度的百分比）；（6）着丝粒至 rDNA 位点的距离；（7）平均着丝粒指数（CI，计算方法为每条染色体短臂长度除以其总长度，再对这些值取平均）；（8）四种不同的核型不对称性指标，包括着丝粒指数变异系数（CVCI）、变异系数（CV）、染色体长度变异系数（CVCL）、平均着丝粒不对称系数（MCA）以及 Stebbins 不对称类别。
注意：参照 Paszko10 和 Peruzzi 等人11的方法计算不对称指数。根据 Levan 的五类分类法对具有不同臂比的染色体进行分类。按照 Han 等人方案37将忽地笑（Lycoris aurea (L'Hér.) Herb）的染色体按长度降序排列。 - 结合染色体测量数据、荧光带信息以及 rDNA-FISH 的位置和大小绘制核型图，以确保方法的精确性和准确性。
- 可视化八个种群的核型不对称关系是关键步骤，可提供清晰的洞察。通过二维散点图实现，用于获取它们的 MCA 和 CVCL 值。
- 采用 Gower 相似性系数作为关键组分，按照 She 等人38的方法进行主坐标分析（PCoA）。
- 计算六个定量参数（x、2n、TCL、MCA、CVCL、CVCI），以确定八个种群的细胞遗传学核型。
- 使用数据分析与可视化程序进行统计分析，生成基于 UPGMA 的聚类树状图和 PCoA 散点图。
结果
通过采用精细的酶浸解与火焰干燥（EMF）方法，获得了分散良好且分化清晰的中期染色体 Lycoris aurea （L'Hér.）Herb 的细胞遗传学染色体核型被获得，并进行了分析。 石蒜 构建了（图1）。凝缩程度最高的中期染色体由于形态学差异减小，不适合用于核型分析。然而，由于单倍体染色体总长度（TCL）在不同群体间具有可比性，因此可用于区分不同核型 Lycoris aurea 通过比较TCL值的差异，可以实现对种群的区分。八个种群的核型特征和核DNA含量 Lycoris aurea 如图所示 表1荧光带的分布以及45S和5S rDNA位点的位置如图所示。 表2. 图2 显示染色体的测量数据，以及荧光带型特征和45S与5S rDNA FISH信号的位置及大小。
二倍体染色体数目如下：GXTL为2n = 16 = 8m + 8t，HBFC为2n = 14 = 8m + 6t，GZDS为2n = 14 = 8m + 6t，HNZX为2n = 16 = 6m + 10t，HBBD为2n = 14 = 8m + 6t，HNXN为2n = 14 = 8m + 6t，HBWF为2n = 16 = 6m + 10t，SCLS为2n + 1 = 15 = 7m + 8t（表1）。如She等人的实验方案所述。4，八条中期染色体 L. aurea 种群规模较小，平均染色体长度范围为 1.01 µm （HNZX）到 2.08 µm （GZDS）和一个 TCL 范围从 16.14 µm （HNZX）到 29.13 µm （GZDS）。这八个群体的TCL与已报道的核DNA含量相关（表1). 湘南（HNXN）群体的相对长度范围（RRL）最小（1.52–3.81），而贵州独山（GZDS）群体的相对长度范围最大（2.73–5.86）。HNXN和GZDS群体分别表现出最小和最大的染色体长度变异。基因组的平均着丝粒指数（CI）在61.02 ± 5.63（HBFC群体）至70.70 ± 4.63（HBWF群体）之间变化。HBFC群体的着丝粒指数变化最小，而HBWF群体的变化最为显著。
核型由中着丝粒（m）和端着丝粒（t）染色体组成（表1；图2），代表了所研究的八个居群中最常见的染色体形态。八种不同的核型不对称性指数见于表1。其中，着丝粒指数的变异系数（CVCI）和平均着丝粒不对称性（MCA）用于表征染色体内不对称性，而染色体长度的变异系数（CVCL）则用于衡量染色体间不对称性。CVCI 和 MCA 的取值范围如下：CVCI = 10.97（HBBD）至 18.25（HBWF），MCA = 28.85（HNZX）至 39.30（HBWF）。这些数值一致表明，HBBD 的染色体内不对称性最低，而 HBWF 的最高。CVCL 的范围为 14.98（GZDS）至 23.32（HBWF），表明 GZDS 的核型最对称，而 HBWF 在八个居群中核型最不对称。根据 Stebbins9 的分类原则，这些核型属于 1B 类，说明所有被研究的居群均具有相对对称的核型。
利用CVCI与CVCL以及MCA与CVCL之间的二维散点图，展示了八个 Lycoris aurea (L'Hérit.) Herb 种群的核型不对称性关系（图3）。通过三对参数——CVCI、CVCL 和 MCA——揭示了这些种群的核型结构，具有重要意义。这些参数显示出相似的核型不对称性。散点图的结果突显了本研究的潜在影响，表明HNXN种群具有最对称的核型，而HBFC和HBWF种群则分别表现出最显著的染色体内和染色体间不对称性（图3）。
本研究基于UPGMA树状图及五项核型参数，将八种Lycoris aurea种群精确划分为三大类群（图4）。第一类群由SCLS种群代表，形成一个独立的分支。第二类群包括HNXN和HBWF。第三类群进一步分为两个亚群：其中一个仅包含HBFC种群，另一个则包括HBWF、GZDS和GXTL种群，其中HBBD与GZDS聚于一个较小的分支上。通过主坐标分析（PCoA）揭示的受试种群间的核型关系如图5所示。PCoA散点图表明，这八个种群可在68.36%的置信水平下划分为两个组别。第一组包括HBWF、HBBD和GXTL，前三个种群紧密聚集在一起；第二组由HBFC、HNXN、HNZX和SCLS组成，其中HBFC位于两组之间居中位置，而SCLS则处于最孤立的位置（图5）。
CPD（碘化丙啶与DAPI的组合）和DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）反向染色是用于观察细胞核结构和染色质分布的标准技术。本研究结果揭示了八种Lycoris aurea（L'Hérit.）Herb群体中明显的异染色质现象（图1 和 图2；表2）。各群体的FISH杂交结果显示，所有染色体区域均对应于45S和5S rDNA位点。CPD带型的特征如图1A、C、E、G、I、K、M、O所示。
在HBFC和HBBD群体中，着丝粒和近着丝粒区域观察到CPD带（图1G、K；图2D、F）。然而，某些染色体未显示CPD带：SCLS中的第3和第8号染色体，HNXN中的第1号染色体，HNZX中的第1号染色体，HBWF中的第1号染色体，GZDS中的第2号染色体，以及GXTL中的第2号染色体（图1A、C、E、I、J、M、O；图2A-C、E、G、H）。值得注意的是，在SCLS和HNXN中，第5、6和7对染色体的短臂末端也发现了CPD带；在HNZX中，第4、5、6、7和8对染色体上存在CPD带；在HBFC中，第5、6和7对染色体上也存在CPD带。此外，在HBWF中，第4、5、6、7和8号染色体的短臂末端存在CPD带；在HBBD中，第5、6和7号染色体的短臂末端存在CPD带；在GXTL中，第5、6、7和8号染色体的短臂末端存在CPD带（图1A和图2A）。
FISH 杂交后，DAPI 反向染色在 GZDS 的 5、6 和 7 号染色体着丝粒周围形成明亮的荧光带。这些带被称为 FISH 后 DAPI+ 带，表明这些异染色质区域含有大量的 A-T 碱基对（图 2G）。在八个种群中观察到的（近）着丝粒 CPD 带范围为 25.00% 至 57.14%（表 2），而末端 CPD 带总量范围为 40.00% 至 71.43%（表 2）。在 GZDS 种群中，FISH 后 DAPI+ 带与核型长度相关，占总数的 42.86%。FISH 后，Lycoris aurea (L'Hérit.) Herb 不同染色体对之间的 rDNA CPD 带、非 rDNA CPD 带以及 DAPI+ 带的大小存在显著差异（图 2；表 2）。
采用FISH技术将45S和5S rDNA探针导入经CPD染色的染色体中，如图1所示。Lycoris aurea (L'Hérit.) Herb八个种群中45S和5S rDNA位点的数量与位置汇总见表2，并在图2中展示。值得注意的是，八个种群间rDNA位点在数量、大小和位置上的显著差异凸显了这些发现的重要性。总体而言，八个种群中共有30个45S rDNA位点，其中4个位点（13.33%）位于着丝粒中央区域，9个（30.00%）位于着丝粒近中央区域，17个（56.67%）位于相应染色体臂的末端区域（图2；表2）。
在 GXTL 种群中，一个 45S rDNA 位点信号位于第 4 号染色体短臂的着丝粒区域，另外四个信号位于第 5、6、7 和 8 号染色体长臂的着丝粒区域（图 1P；图 2G）。在 HBFC 种群中，一个 45S rDNA 位点位于第 4 号染色体短臂的着丝粒区域，另外三个位点位于第 5、6 和 8 号染色体短臂的着丝粒周围异染色质区域（图 1H；图 2D）。在 GZDS 种群中，一个 45S rDNA 位点位于中部着丝粒染色体 4 号短臂的着丝粒区域（图 1N；图 2G）。在 HNZX 中，观察到五个 45S rDNA 位点，分别位于第 4、5、6、7 和 8 号染色体对短臂的末端区域（图 1H；图 2D）。HBBD（图 1J；图 2E）和 HNXN（图 1L；图 2F）的 45S 位点分布相似，均在第 4 号染色体短臂的着丝粒区域有一个位点，以及在第 5、6 和 7 号染色体短臂的着丝粒区域有三个位点。
在HBWF中，五个45S rDNA位点信号出现在第4、5、6、7和8对染色体的短臂着丝粒区域（图1N；图2G）。在SCLS中，一对45S rDNA位点信号出现在第1和第2对染色体的短臂着丝粒区域，以及第5和第6对染色体短臂的近着丝粒区域（图1P；图2H）。对于5S rDNA位点，在八个分类群中共鉴定出九个，其中3个（33.33%）位于相应染色体臂的近端区域，3个（33.33%）位于近着丝粒区域，3个（33.33%）位于末端区域（图2；表2）。在GXTL中，一个5S rDNA位点信号出现在第6对染色体长臂末端附近（图1P；图2G）。5S位点的分布模式在HBFC（图1H；图2D）和GZDS（图1N；图2G）中相似，二者均在第7号染色体短臂的近端区域含有一个5S rDNA位点。在HNZX中，一个5S rDNA位点位于第8号染色体长臂末端附近（图1H；图2D）；而在HBBD中，一个5S rDNA位点位于第7号染色体上（图1J；图2E）。在HBWF中，两个5S rDNA位点出现在第4和第8号染色体长臂末端附近，另外两个位于第7号染色体的长臂上，一个位于着丝粒区域，一个靠近末端（图1N；图2G）。
通过45S和5S rDNA的FISH信号结合末端CPD片段特征，可有效区分不同居群的忽地笑（Lycoris aurea (L'Hérit.) Herb.）的所有有丝分裂染色体。在SCLS、HBFC、HBBD、GZDS和GXTL居群中，染色体1在着丝粒区域表现出强烈的CPD信号。染色体2在着丝粒区域也显示强烈的CPD信号，但GZDS和GXTL居群除外。染色体3在着丝粒区域呈现强烈的CPD信号，但SCLS居群除外。染色体4在着丝粒区域始终表现出强烈的CPD信号。对于染色体5、6和7，其短臂末端均观察到强烈的CPD信号。染色体4还在其短臂末端显示出强烈的45S rDNA信号，而染色体5和6在其末端区域具有强烈的45S rDNA信号，但GZDS居群除外。值得注意的是，GZDS居群中存在强烈的DAPI信号。此外，在HBFC、HBWF、HBBD和GZDS居群中，染色体7的近端区域出现微弱的5S rDNA信号。
图 1：八种中国台湾红花石蒜（Lycoris aurea (L' Hér.) Herb）群体的有丝分裂染色体。 展示了来自八个不同中国台湾红花石蒜（Lycoris aurea (L' Herit.) Herb）群体的有丝分裂中期染色体观察结果，包括 SCLS 群体（A,B）、HNXN 群体（C,D）、HNZX 群体（E,F）、HBFC 群体（G,H）、HBWF 群体（I,J）和 HBBD 群体（K,L）。对 GZDS（M,N）和 GXTL（O,P）群体进行了荧光原位杂交（FISH），在 CPD 染色后使用生物素标记的 45S 和地高辛标记的 5S rDNA 探针进行杂交。CPD 染色后的染色体图像显示 45S（绿色）和 5S（红色）rDNA 信号。总 DNA 用 DAPI 染料反向染色，呈现蓝色。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。
图2：八种石蒜（Lycoris aurea (L' Hér.) Herb）种群的染色体核型图谱。 八个石蒜（Lycoris aurea (L' Herit.) Herb）种群的染色体模式图展示了荧光显带特征，以及45S和5S rDNA FISH信号的位置与大小。种群SCLS、HNXN、HNZX、HBFC、HBWF、HBBD、GZDS和GXTL分别由图（A-H）表示。纵坐标表示染色体的相对长度（该染色体在单倍体基因组中所占百分比），顶部的数字表示染色体的序号。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：基于三个核型参数的八种忽地笑（Lycoris aurea (L' Hér.) Herb）种群的散点图。（A）CVCI 指数对 CVCL 指数的散点图。（B）MCA 指数对 CVCL 指数的散点图。图中标识了 SCLS、HNXN、HNZX、HBFC、HBWF、HBBD、GZDS 和 GXTL 种群。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：八种石蒜（Lycoris aurea (L' Hér.) Herb）种群的UPGMA树状图。 该UPGMA树状图基于八个石蒜（Lycoris aurea (L' Hér.) Herb）种群（SCLS、HNXN、HNZX、HBFC、HBWF、HBBD、GZDS 和 GXTL）的参数 x、2n、TCL、MCA、CVCL 和 CVCI 构建。请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：基于六项核型参数的八种忽地笑（Lycoris aurea (L' Hér.) Herb）品种的主坐标分析（PCoA）。 该PCoA基于参数x、2n、TCL、MCA、CVCL和CVCI，分别代表SCLS、HNXN、HNZX、HBFC、HBWF、HBBD、GZDS和GXTL。请点击此处查看该图的放大版本。
表1：8个忽地笑（Lycoris aurea (L' Hér.) Herb）种群的名称。 请点击此处下载该表格。
表2：八种忽地笑（Lycoris aurea (L' Hér.) Herb）种群中荧光染料带和rDNA位点的分布。 请点击此处下载该表格。
补充文件1：本研究中使用的探针。 请点击此处下载该文件。
讨论
Lycoris aurea（L'Hér.）Herb 根染色体的制备包含多个关键步骤：（1）通过水培法培养根系，（2）用饱和的 α-溴萘处理根尖，（3）使用乙醇-乙酸混合液固定根组织，（4）用酶解液对根尖进行酶解处理，（5）充分压片消化后的根组织，并在酒精灯火焰上烘干载玻片。
准确的染色体测量对于细胞遗传学研究中的核型分析至关重要。染色体应表现出明显的凝缩状态和清晰可辨的边界；否则，将难以准确计算染色体参数5。既往的细胞遗传学研究表明，有丝分裂染色体的形态分化程度取决于其凝缩程度4,36。当凝缩不足时，染色体臂的末端可能仍处于去粘连状态，导致染色体边界模糊不清。然而，当染色体达到最大程度凝缩时，不同染色体之间的形态差异会减小。因此，在染色体数目较少的物种中，选择具有中等凝缩程度的染色体对于染色体的识别与测量尤为关键。
探针标记对于成功的FISH原位杂交至关重要，尤其是5S rDNA探针溶液。由于5S rDNA序列较短，通过PCR标记的靶序列浓度通常较低，导致杂交信号较弱。然而，直接合成荧光素标记的探针可产生更强的杂交信号，并简化实验流程。对于45S rDNA探针溶液，采用拟南芥（Arabidopsis thaliana）5.8S、18S和25S rRNA编码区的部分序列，分别在5'端和3'端用6-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）进行标记，然后混合。荧光素标记的5S rDNA探针溶液则通过使用拟南芥（Arabidopsis）5S rRNA基因编码区的1-59和60-118核苷酸序列制备，每条序列均在5'端用6-羧基荧光素（6-FAM）标记，随后混合而成。
本研究利用DAPI与PI染料在DNA结合特性上的差异，将二者结合使用以获得清晰的荧光带型。PI（碘化丙啶）染料可穿透细胞膜并与细胞内的DNA分子结合；相比之下，DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）则优先结合富含AT的DNA区域，从而实现清晰且高对比度的染色。由于这些互补特性，DAPI与PI常联合使用，称为CPD染色，可同时获取细胞核与细胞质的信息。CPD与DAPI+带的存在与否、位置及大小差异揭示了八种Lycoris aurea群体间显著的异染色质分化。CPD染色显示，在着丝粒及近着丝粒区域以及端着丝粒染色体内部，均存在富含GC的异染色质区域。
核型不对称性研究是一种流行、经济且广泛应用的细胞遗传学分类方法，该方法结合了多种参数和指标，包括定性与定量测量、Stebbins分类参数以及各种定量指数（例如，Paszko10；Peruzzi 等11）。其中，R 比值和 CVCL 用于衡量染色体不对称性，而 CVCI 和 MCA 则代表染色体不对称性的关键指标。值得注意的是，CVCL 被认为是评估染色体间不对称性的可靠统计参数。10，染色体不对称性度量（MCA）被公认为评估染色体内不对称性的有效指标11为了最佳地展示不同种群间的核型不对称性，建议使用二维散点图，将两个不对称性估算指标分别置于横轴和纵轴上，每个样本以一个点表示。11,12二维散点图分析结果显示了CVCL 与CVCI 以及 MCA 与. CVCL，有效阐明了八个不同种群之间的核型不对称性关系 Lycoris aurea （L′Herit.）Herb，支持这些指数在评估染色体不对称性方面的可靠性。
为比较8个种群的核型并重建其核型关系，本研究采用了Peruzzi等人11提出的方法，利用x、2n、TCL、MCA、CVCL和CVCI六个参数。研究结果表明，HBWF、GZDS、HBBD和GXTL种群之间亲缘关系较近，而HBFC位于这些类群之间。因此，基于这六个参数的主坐标分析（PCoA）是区分这8个种群间关系的有效方法。然而，构建的分子进化树也呈现出某些复杂的模式。例如，在分子系统发育树中，HNZX与HBWF关系较近，但在PCoA散点图中却表现出较远的关系。这种复杂性凸显了采用多种定量方法来预测石蒜属（Lycoris）核型进化趋势的重要性，以补充分子分类特征。
本研究的植物材料采自中国中西部地区，包括广西壮族自治区田林县（GXTL）、湖北省房县（HBFC）、贵州省独山县（GZDS）、湖南省资兴县（HNZX）、湖北省巴东县（HBBD）、湖南省新宁县（HNXN）、湖北省五峰县（HBWF）以及四川省芦山县（SCLS）。凭证标本保存于怀化学院标本馆。本研究发现，45S和5S rDNA荧光原位杂交（FISH）信号与端部CPD区段特征的结合可有效区分不同居群的忽地笑（Lycoris aurea (L′Herit.) Herb.）所有有丝分裂染色体。本文所述实验方案旨在研究忽地笑（Lycoris aurea (L′Herit.) Herb.）不同居群间的异染色质分布。CPD（PI与DAPI的组合）和DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）反向染色是观察细胞核结构和染色质分布的成熟技术。对18S-5.8-26S rRNA基因区域（45S rDNA区域）和5S核糖体DNA进行直接荧光标记，用于染色体FISH杂交，操作简便且可产生稳定的杂交信号。这种定性区分方法在分析各类居群时将日益显现其重要价值。
该方法最适合用于能够快速培养根尖的植物物种，因为需要在有丝分裂活跃期进行根尖培养。Arabidopsis thaliana 的5S序列较短，因此本研究采用其5S rRNA基因编码区的1-118bp核苷酸序列作为5S rDNA探针。由于该序列较短且信号较弱，该方法仅适用于5S rRNA基因1-118bp区域碱基相对保守的物种的鉴定。选择染色体适度凝缩的中期细胞对该方法的成功至关重要。染色体凝缩程度与根尖采集时间、预处理时长以及火焰烘烤过程密切相关。因此，该技术要求对每一步骤进行精确控制，以确保实验成功。
披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本工作受到国家自然科学基金（32070367）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酒精 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737-0005 | (70%, 90%, 100%) |
| 1× TNT | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | B548108 | 1×, 10× |
| 2× SSC | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B548109 | 2×, 20× |
| 45S rDNA | 生工生物工程（上海）股份有限公司 | TAMRA 被添加到两端（5' 和 3' 端） | |
| 4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E607303 | 20 ml |
| 5S rDNA | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 5'端加6-FAM（FITC） | |
| Adobe Photoshop 软件 | Adobe 系统公司 | CS6 | |
| α-溴代萘 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A602718 | 饱和度 |
| 抗倦怠剂 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Vectashield H-1000 | 10 mL |
| 生化培养箱 | 上海伊恒科学仪器有限公司 | LRH-70 | |
| 纤维素酶 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A426068 | 10 g |
| 柠檬酸 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501702 | 10 g |
| 去离子甲酰胺（FAD） | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600211-0500 | 0.7 |
| 葡聚糖硫酸盐 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A428229 | 10 mL |
| 荧光原位杂交仪器 | 美国/雅培 ThermoBrite | S500-24 | |
| 荧光显微镜 | Olympus 中国 有限公司 | BX60 | |
| 冰醋酸 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | 500 mL |
| HCl | Aladdin 试剂 公司 有限公司（上海） | H399657 | 500 mL |
| 制冰机 | Dan Ding 上海国际贸易有限公司 | ST-70 | |
| 徕卡生物显微镜 | 德国徕卡仪器有限公司 | DM6000B | |
| 甲醇 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A601617 | 500 mL |
| MetMorph 软件 | Molecular Devices | 版本 7.35 | |
| 烘箱 | 赛默飞世尔科技™ Heratherm™ | THM#51028152 | |
| 果胶酶 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A004297 | 10 g |
| 胃蛋白酶 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 1.07185 | 100 g |
| 碘化丙啶（PI） | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A425259 | 1 g |
| RNaseA | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | R4642 | 10 mg |
| 鲑鱼精子DNA（ssDNA） | Aladdin 试剂 公司 有限公司（上海） | D119871 | 1 g |
| 柠檬酸钠 | Aladdin 试剂 公司 有限公司（上海） | S189183 | 10 g |
| Statistica for Windows 10.0 | 用于统计分析 |
参考文献
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