本文介绍一种通过从运营中的渡轮及其他商业船只采集海水样本并进行过滤，从而获取海洋环境DNA（eDNA）的新方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
用于从环境DNA痕迹中获取信息的遗传工具，已在靶向性和广泛分类学水平的生物多样性表征中得到充分确立。然而，在海洋环境中，从难以到达的区域（如深海或远海海域）采集环境DNA样本仍可能存在限制。利用定期航行的渡轮或穿越广阔开阔海域的商船，可作为采集环境样本的重要机会性平台。这种方法优势显著，不仅能够在任何天气条件和全天任何时段进行数据采集，而且由于航线固定，可实现长期重复采样，同时大幅降低费用和燃料排放。先前的研究已证明该方法可行且成功。然而，从这些大型船舶内部获取样本的过程可能并非即时可行。本文详细阐述了如何在大型船舶上准备、组织并实施海水样本的采集与过滤过程。
引言
近几十年来，环境DNA（eDNA）分析，即检测生物体在环境中遗留的遗传物质，已迅速发展成为监测淡水和海洋动物群落的一种有前景的工具。这种分子技术能够在单个样本中同时鉴定多个分类单元（即采用宏条形码方法），从而实现对栖息或经过采样区域的生物群落的检测1,2,3,4,5。
目前，真正的挑战在于到达采样点，因为在大范围地理区域内采集样本往往在经济上和/或后勤上不可行，导致远洋区域的采样通常比更容易进入的沿海区域更少6。利用渡轮或其他商业船只可以实现高度可重复的采样断面，因为这些船只遵循特定的航线，通常在季节内保持稳定，并覆盖广阔区域7,8。此外，使用渡轮航线作为采样手段，可以在一天中的任何时间以及每个季节进行样本采集，不受天气和海况的影响，同时还具有众多其他优势（补充图1）。初步研究已证明该方法在评估生物多样性指数方面的可行性和准确性9,10。水样可通过渡轮机舱内的引水管从发动机上游的海水冷却水系统中采集。LIFE-CONCEPTU MARIS（地中海鲸类与远洋海龟保护：可持续恢复管理行动）是首个大规模实施该概念验证的项目：该项目计划在两年内采集500份样本，并联合了不止一家而是多家渡轮公司和承运商，从而能够揭示潜在的关键问题，并优化采样策略，以更好地适应船上可能遇到的各种不同环境。下文将介绍该项目中与大规模海洋环境DNA样本采集相关的组成部分（如需了解项目详情，请访问 https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707）。
决定利用定期渡轮开展采样活动，意味着必须在实际采样前采取一些措施，而实际采样正是本研究直接关注的内容。在此，我们简要提及从任何商业船只上开展船上采样之前必须完成的准备工作。
这是一个不容忽视的方面，它决定了采样工作的成功与否。航运公司属于商业实体而非科研机构，因此它们既不熟悉也无需了解拟在船上开展的科学研究的目标与目的。这意味着必须经历一个关键而敏感的初始阶段，即需要由航运公司的高层管理人员来传达并阐明所提议科学项目的目标，而这些目标可能是多学科的。以CONCEPTU MARIS项目为例，之所以能够实现这一目标，得益于长达数十年的合作关系，在此期间，这些航运公司已参与过视觉监测项目（例如固定航线断面监测 [FLT]7），从而建立了相互尊重的关系，这种关系对于获得进入机舱的许可至关重要，而进入机舱是本研究采样方法所必不可少的前提条件。
CONCEPTU MARIS 项目采用的采样方式分为两种：既在固定采样站（FSS，见下文）进行采样，也在发现目标生物时进行采样 "罕见" 鲸类动物。这些物种在 FTL 样线调查期间被观察到的频率最低11，即：普通海豚（Delphinus delphis），柯氏喙鲸（Ziphius cavirostris），领航鲸（Globicephala melas），里氏海豚（Grampus griseus），抹香鲸（Physeter macrocephalus）和长须鲸（Balaenoptera physalus）。仅当目视普查团队（FLT团队）报告发现稀有物种的时间比任意一次FSS早超过半小时或晚超过半小时时，才额外采集一份水样。与目击记录同步进行的采样必然均为昼间采样。
固定采样站（FSS）的地理位置在各次航次中保持不变，需事先确定并获得整个工作团队的确认。FSS地理点的选择依据如下：1）根据以往观测或文献资料，选择具有生物学研究价值的区域；2）优先考虑在测深图上显示生境变化的点位（如大陆架边缘）；3）对指定航线进行均匀覆盖，因此选择大致等间距的采样点（相距约35-45海里），以确保覆盖整个航线，并兼顾夜间样品的采集。
为确保相邻样本在一天中的不同时间采集，并且两次连续采样之间有足够时间完成样本处理，建议在去程和返程途中分别采集相邻FSS的样本。这意味着，如果FSS按照实际采样的时间顺序编号，它们在地图上的排列将不会是连续的。例如，若选择了6个FSS，则其中3个在去程途中采样，另外3个在返程途中采样。它们在地图上沿路线的顺序将为 PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortB，其中三个采样站为斜体（FSS4， FSS5 和 FSS6 在返程期间接受调查 旅程 （参见 图1).
每个单个FSS都有一个唯一的识别编号（即在不同路线上识别的FSS之间不会共享相同的识别编号）。编号在首次对FSS进行采样时分配，并按顺序连续编号。因此，在项目结束时，编号较小的FSS将是那些已测试多年或拥有最久远数据的FSS。
每个样品由在各个采样站采集的大约13升海水组成。海水直接从渡轮的取水管线中倒入 "盒中袋" （BiB）容器，即无菌铝箔复合塑料袋，直至样品处理（见下文）。Bag-in-Box取样系统（BiBSS）的特征与优势由Valsecchi等（2021）进行了详细阐述。9 并在本文中一并报告 图2 为方便起见。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 在实验室中做好准备
- 装备清单
- 查阅清单，确认采样和样品过滤所需携带的物品。清单见补充文件1。每项物品及其用途将在下文各节中详细说明。
- 打印一份补充文件1，并在采样任务出发前填写完毕。
- 准备袋中盒采样系统
- 尽可能在登船前于实验室内的通风橱中准备袋中盒。使用封口膜密封三个开口（袋口、用于封闭袋口的盖子部分以及出水阀的出口）（图3，材料表）。
- 将袋子卷紧，盖子拆下后密封置于袋内，并用胶带封好，防止运输过程中意外打开（图3）。
- 操作时应确保在上述密封过程中避免空气进入袋内，原因有二：(i) 防止空气中可能携带的污染物进入袋内；(ii) 防止袋内含气导致折叠后的袋子体积增大。
2. 登船前的准备工作
- 与船员协调
- 登船后，立即向船长及其船员告知所选的采样点，以便确定渡轮最接近每个被选为"固定采样站"（FSS）的位置的时间。
- 记录每个固定采样站的采样时间以及该航线上渡轮当前（或可获得时的平均）巡航速度：这有助于估算所采样海域的范围（km）。
- 由于渡轮从不会精确经过同一位置，应在实际采样后校正每份海水样品采集点的坐标。
注：精确的采样时间间隔是准确识别实际采样海域的最重要数据；因此，建议打印一张粗略点位图，并标注实际采样坐标（例如见补充文件2）。 - 如果公司允许进入机舱，请请求安排人员陪同进入。
- 进入机舱前必须穿戴个人防护装备（PPE）。机舱环境恶劣（噪音震耳欲聋、温度高），并存在诸多潜在危险点（陡峭楼梯、地板上的大缝隙）。在获得进入许可后，必须配备所有必要的安全设备，如安全鞋、头盔和听力保护耳机。
- 若过滤工作台面由航运公司提供（通常建议自带可折叠桌），需检查该区域是否可在样品之间使用10%次氯酸钠溶液进行消毒。
- 在机舱内安顿设置
- 由于船舶上存在多个海水进水口，需与机舱管理人员共同确认哪一个进水口能使海水在船内管道中的流动路径最短，以尽量减少管道中可能存在的物质和生物对水样的污染。
- 确定最适合采集入流水样的位置/进水口后，询问工作人员是否可在整个航程期间保持采样阀门微开，以便用"本地"海水持续冲洗采样所用管道。将从阀门持续流出的海水排入舱底污水舱。
3. 水样采集（在机舱内）
注意：图4展示了海水样品采集的各个阶段。
- 水样采集准备
- 将所有必要装备（见补充文件1清单第一部分）带至机舱。至少在计划采样时间前15分钟到达机舱，使用10%次氯酸钠溶液对处理BiB的区域进行消毒。
- 若专用取水阀未在整个航程中保持开启状态，则在采集海水样品前打开该阀，并让水流至少5分钟（水流排入舱底）后再正式取水（图4A）。
- 准备过滤工作站。
注意：设置过滤工作站时可采取若干措施，显著提高过滤效率（见步骤4.3）：1）使用大容量真空抽滤瓶（2 L、4 L或5 L，根据待取水样体积选择）。这不仅节省了在1 L样品之间清空滤瓶所需的时间，还减少了对过滤柱的操作，从而降低污染风险；2）可将多个抽滤瓶串联使用，以便同时过滤多个样品（袋）。在采样时间紧张的情况下建议采用此方法，否则可能存在在抵达靠泊港口前无法及时处理所有样品袋的风险。 - 使用永久性记号笔在BiB上进行准备和标记，内容包括：1）在BiB两侧书写样品唯一的字母数字编号（尤其重要的是，若BiB未在船上立即处理，而是在陆地上进行过滤时）；2）日期；3）开始填充BiB的准确时间。
- 水样采集
- 移除BiB开口处的密封膜，开始注水直至完全充满（约13 L）（图4B）。
- 当袋子接近充满时，移除瓶盖上的密封膜，但不要移除取水阀口的密封膜：保持密封膜围绕取水阀安全锁扣（红色塑料卡扣）直至过滤前（图4C）。用瓶盖密封BiB，并用力压紧直至完全闭合。
- 记录样品采集完成的准确时间：用于计算样品采集的总时长（分钟）。
- 水样采集后处理
- 使用永久性记号笔在BiB上标注样品采集完成的准确时间，并将所有数据填写至样品采集/过滤记录表（补充文件2）。
- 将已装满的BiB转移至储存室或过滤区域（可在机舱内指定区域或舱室内）。
- 将所有数据转录至样品采集/过滤记录表（补充文件2）。
注意：补充文件2展示了需在船上完整填写的样品采集/过滤记录表。- 针对与样品采集相关的部分（绿色区域），填写从机舱开始和结束采集海水样品的时间。
- 随后，经与船员核对或查阅GPS记录后，填写采样起止位置的地理坐标以及航行速度。这有助于后续计算所采样海域段的长度。
注意：关于过滤部分（蓝色区域），需注明过滤是在船上进行还是之后在陆地上进行，并分别记录三个滤膜的过滤时间。
4. 海水样品过滤
- 准备过滤
注意：从此时起，过滤过程可根据研究项目的具体目标，按照不同的方案进行操作。此处描述的方案允许在船上直接高效过滤大量海水（超过10升），避免了其他常用商业试剂盒或方案中存在的体积限制。如条件允许，应在船上过滤水样：过滤可在机舱内或专用舱室内进行，建议选择靠近机舱的位置。采集海水样品后应尽快进行过滤，这不仅有助于减少环境DNA（eDNA）的降解，也更为便捷，可避免携带大量待处理海水下船。若无法立即过滤，可将样品暂存于袋中袋（Bag-in-Box）容器中，运至后续地点再进行过滤。- 在船上指定的过滤区域（机舱或专用舱室）内，准备好补充文件1 第二部分清单中所列的所有物品，并按照图5所示组装过滤系统。
- 按照图6和图7所示准备过滤筒（材料表）。每个采样站应使用新的过滤筒、新的一次性镊子，或已灭菌的镊子。
注意：同一过滤筒可用于同一地点的多个样品过滤，但每次使用后需用10%次氯酸钠溶液灭菌，随后用淡水冲洗，在实验室中自然风干后单独包装，保存至下一次采样活动使用。 - 开始过滤前，填写样品采集/过滤数据记录表（补充文件2）。该记录对于追踪已处理的升数以及测量过滤时间（反映样品中颗粒物含量的指标）至关重要。一旦启动真空泵，立即开始计时以记录过滤时间。
- 船上过滤
- 为尽量减少污染风险（尤其是在同时处理多个袋子时，见下文），通过在水龙头与过滤筒之间放置一个绝缘套（塑料袋），将待过滤水流与周围环境隔离（见图7）。
注意：此措施极为重要，因为环境DNA分析所用技术具有高灵敏度，极易受到环境污染物（来自操作人员或样品间交叉污染）的影响。 - 启动真空泵，每张滤膜过滤最多4 L水。过滤过程中应始终保持过滤筒内充满水，以防止空气进入系统，减缓过滤速度。
注意：关于滤膜孔径的选择，应根据研究目的、目标分类群以及计划处理的水量而定。此前已有研究9,12 对不同孔径滤膜进行了比较。在针对脊椎动物的研究中，若选择每张滤膜处理4升水，则0.45 µm孔径的滤膜为最佳方案，可在避免滤孔堵塞饱和的前提下处理较大体积的水样。 - 当接收瓶内过滤水位达到4 L刻度线时，关闭真空泵并停止计时，将过滤时间记录在数据表中。
注意：每个12/13 L的袋中袋（BiB）可获得3个技术重复样品，每个4 L（分别标记为A、B和C）。 - 此时，使用镊子（必要时可用无菌牙签辅助抬起滤膜边缘）， 从过滤筒中取出第一张滤膜（滤膜A），如图8所示，注意避免对滤膜造成任何损伤。
- 将滤膜对折（使截留生物材料的一面朝内折叠），用铝箔包裹，并立即在包裹上标注样品编号及滤膜重复编号（例如15A）。随后将其存放在船上冷冻箱中，直至下船。
- 在过滤筒内安装新滤膜（滤膜B），用于处理下一个4 L样品（图9）。清空接收瓶后，重新开始第二次重复样品的过滤，直至完成4 L过滤。按上述方法回收滤膜B，并对滤膜C重复相同步骤。
- 为尽量减少污染风险（尤其是在同时处理多个袋子时，见下文），通过在水龙头与过滤筒之间放置一个绝缘套（塑料袋），将待过滤水流与周围环境隔离（见图7）。
- 良好操作规范
- 为缩短过滤时间，应使用容量足够大的真空接收瓶，以容纳单张滤膜所处理的全部滤液（本方案中至少需4 L容量）。
- 通过并联设置多个过滤装置（即多个真空接收瓶共用一台泵），可同时过滤多个袋子，显著缩短过滤时间。
注意：在CONCEPTU MARIS航次中，上述两种策略均被采用（图10）。由于航线上采集的样品数量可能较多，最大化过滤效率极为重要。因此，必须在短时间内完成所有袋子的处理，以避免样品积压，防止因时间不足而不得不携带未处理样品下船。 - 为监控假阳性（污染）的发生情况，应在每次航次的过滤过程中至少设置一次“空白袋”（"blank-bag"），即使用密封瓶中的饮用水装入袋子，与样品并行过滤。该对照样品无需设置重复，应与其他样品同样处理，并纳入后续的高通量测序（NGS）分析。
- 滤膜的储存与运输
- 过滤完成后，将所有滤膜在-4 °C至-20 °C条件下保存，直至后续实验室处理。
- 在下船前，从船上冷冻箱中取出样品，并使用便携式冷藏箱在低温条件下运输，如图11所示。
注意：若样品未在船上过滤，则海水袋在运输过程中应保持直立，瓶盖朝上，并成对放置于塑料箱内的购物袋中以提供支撑，便于运输（图12）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
按照所述方案执行操作后，操作人员将收集到数量等于FSS数量乘以3个重复的滤膜。每张滤膜会在其两侧之一上保留生物痕迹（环境DNA）。eDNA提取后的分析步骤在很大程度上取决于具体的研究问题、目标生物和研究目的。例如，在Valsecchi等人9开展的初步研究中，所描述的eDNA采集方案支持设计一项可重复且系统的海洋大型动物调查。通过采用宏条形码技术并选择两个不同的脊椎动物特异性标记进行分析，成功检测出多种脊椎动物物种（硬骨鱼类、软骨鱼类和鲸类）。这些结果使我们能够推断物种的相对丰度（图13）及其空间分布，从而重建采样路线沿线的脊椎动物群落组成及其营养结构9。这仅是一个示例，因为通过该方法获得的海洋环境DNA既可用于即时分析，也可在多年后进行分析（所采集的eDNA可存入专用样本库以供未来使用），适用于任何生物类群（真菌、细菌、无脊椎动物、浮游植物）的研究。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
由于实验方案步骤简单直接，在商业渡轮上操作时仍需考虑一些相关事项。冷却水取样管通常位于机舱区域，该区域的进入可能受到限制或需要事先获得授权。因此，确保获得相应授权并配备适当的个人防护装备至关重要（图4）。此外，水样的采集与过滤应尽可能在无菌条件下进行，以避免任何污染。在过滤前，维持冷链条件进行样品保存和转运是另一个必须确保的关键步骤。最好在采集后立即过滤袋装水（BiB）中的水样，这也便于样品运输。然而，若无法立即过滤，样品可在不影响其质量的情况下保存长达2周9。为有效保存样品，BiB在运输过程中应置于阴凉处，并避免阳光直射。此外，水样绝不可冷冻，以免破坏细胞组分，导致胞外DNA释放，而胞外DNA在过滤过程中更容易丢失。
尽管许多海洋环境DNA（eDNA）研究依赖于小体积（1–2 L）的海水样品，但我们选择过滤大体积（12 L）的海水样本（直至达到滤膜饱和），以尽可能多地保留eDNA，从而支持更多当前和未来（样品储存于海洋eDNA库MeDB）的分析。BiB的整个体积被均分为三个...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢那些允许本文所述方法得以测试和开发的人士，特别是 Antonella Arcangeli（ISPRA），她数十年来一直领导着“海上渡轮监测”（FLT）项目，通过密集的渡轮网络对地中海（以及非地中海）的鲸类动物进行持续的视觉监测，并且她坚信在渡轮航线中搜寻DNA这一雄心勃勃的设想；感谢来自科西嘉与撒丁尼亚渡轮公司（Corsica and Sardinia Ferries）的 Cristina Pizzutti，她满怀热情地接受了这一挑战，为我们首次在该公司船队的一艘运输船上测试该方法提供了后勤支持（同时也接待了前来拍摄的视频制作团队）；感谢 Fulvio Maffucci 为协调多家航运公司、获取船上采样许可所付出的努力。我们感谢 Roberto Lombardo，他的硕士论文项目开启了对环境DNA与渡轮结合应用的探索。最后，我们感谢那些允许我们登船并开展环境DNA采样的航运公司，这些支持源于 LIFE-CONCEPTU MARIS 项目，使我们有机会在地中海多艘不同船只上测试本方法：Grimaldi Lines、Minoan Lines、Tirrenia、Balearia、Corsica and Sardinia Ferries 以及 Grandi Navi Veloci（GNV）。当前由欧盟资助的 LIFE-CONCEPTU MARIS 项目，不仅验证了该方法大规模可复制性的概念可行性，同时也资助了本视频出版物的制作，使得标准化操作规程（SOP）能够广泛传播至更广泛的科学界和公众。我们感谢 Mattia Nocciola 和 Francesco Tommasinelli（Triton Research）提供了部分本操作规程的影像资料。最后，我们感谢过去五年中所有与我们合作并协助我们完成采样的船员们。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4.7 厘米直径滤膜 | Biosigma S.p.A. | https://www.biosigma.com/ | 孔径为 0.45 μm 的滤膜，独立包装 |
| 4/5 升抽滤瓶 | Duran | https://www.duran-bottle-system.com/ | 5 升玻璃抽滤瓶，带塞 |
| 吸水纸垫 | Advantec MFS, Inc. | https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1 | 滤纸材质吸水垫，尺寸 47 毫米 |
| 袋中袋（BiB） | G.M.V. Agricenter S.r.l. | https://www.gmvagricenter.it/ | 10 升袋中袋，带出水阀 |
| 过滤筒 | Sartorius AG | https://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors# | Biostart 100 Monitor 过滤筒，包含 0.45 μm 滤膜 |
| 封口膜 | Merck | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium= cpc&utm_campaign=all+product_ dsa_WW_%28bing+ebizpfs%29& utm_id=626946489&utm_content= 1166583023365595&msclkid= d2b55b82440b1aef56fc3ca803c 6486f&utm_term=%2Fproduct%2F | 4 英寸 × 125 英尺卷装实验室封口膜 |
| 真空泵 | KNF Group | https://knf.com/en/us | Laboport 便携式真空泵 N. 96 |
参考文献
- Andruszkiewicz, E. A., et al. Biomonitoring of marine vertebrates in Monterey Bay using eDNA metabarcoding. PLoS One. 12 (4), e0176343(2017).
- Djurhuus, A., et al. Environmental DNA reveals seasonal shifts and potential interactions in a marine community. Nat Commun. 11 (1), 254(2020).
- DiBattista, J. D., et al. Environmental DNA can act as a biodiversity barometer of anthropogenic pressures in coastal ecosystems. Sci Rep. 10 (1), 8365(2018).
- Beng, K. C., Corlett, R. T. Applications of environmental DNA (eDNA) in ecology and conservation: Opportunities, challenges, and prospects. Biodivers Conserv. 29 (7), 2089-2121 (2020).
- He, X., et al. eDNA metabarcoding enriches traditional trawl survey data for monitoring biodiversity in the marine environment. ICES J Mar Sci. 80 (5), 1529-1538 (2023).
- Pawlowski, J., et al. The future of biotic indices in the ecogenomic era: Integrating (e)DNA metabarcoding in biological assessment of aquatic ecosystems. Sci Total Environ. 637 - 638, 1295-1310 (2018).
- Arcangeli, A., Marini, L., Crosti, R. Changes in cetacean presence, relative abundance and distribution over 20 years along a trans-regional fixed line transect in the central Tyrrhenian sea. Mar Ecol. 34 (1), 112-121 (2013).
- Matear, L., Robbins, J. R., Hale, M., Potts, J. Cetacean Biodiversity in the Bay of Biscay: Suggestions for environmental protection derived from citizen science data. Mar Policy. 103672, 109(2019).
- Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels provides new opportunities for systematic genetic surveys of marine biodiversity. Front Mar Sci. 8, 704786(2021).
- Boyse, E., Beger, M., Valsecchi, E., Goodman, S. J. Sampling from commercial vessel routes can capture marine biodiversity distributions effectively. Ecol Evol. 13 (2), e9810(2023).
- Arcangeli, A., et al. Testing indicators for trend assessment of range and habitat of low-density cetacean species in the Mediterranean Sea. Front Mar Sci. 10, 1116829(2023).
- Valsecchi, E., et al. Novel universal primers for metabarcoding environmental DNA surveys of marine mammals and other marine vertebrates. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
- Hunter, M. E., et al. Improving eDNA yield and inhibitor reduction through increased water volumes and multi-filter isolation techniques. Sci Rep. 9 (1), 5259(2019).
- Capo, E., et al. Effects of filtration methods and water volume on the quantification of brown trout (Salmo trutta) and Arctic char (Salvelinus alpinus) eDNA concentrations via droplet digital PCR. Environ DNA. 2 (2), 152-160 (2020).
- Li, J., et al. The effect of filtration method on the efficiency of environmental DNA capture and quantification via metabarcoding. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
- Collins, R. A., Wangensteen, O. S., O'Gorman, E. J., Mariani, S., Sims, D. W., Genner, M. J. Persistence of environmental DNA in marine systems. Commun Biol. 1, 185(2018).
- Kelly, R. P., Gallego, R., Jacobs-Palmer, E. The effect of tides on nearshore environmental DNA. PeerJ. 6, e4521(2018).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
