本文介绍一种通过从运营中的渡轮及其他商业船只采集海水样本并进行过滤，从而获取海洋环境DNA（eDNA）的新方法。
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本文内容
摘要
摘要
用于从环境DNA痕迹中获取信息的遗传工具，已在靶向性和广泛分类学水平的生物多样性表征中得到充分确立。然而，在海洋环境中，从难以到达的区域（如深海或远海海域）采集环境DNA样本仍可能存在限制。利用定期航行的渡轮或穿越广阔开阔海域的商船，可作为采集环境样本的重要机会性平台。这种方法优势显著，不仅能够在任何天气条件和全天任何时段进行数据采集，而且由于航线固定，可实现长期重复采样，同时大幅降低费用和燃料排放。先前的研究已证明该方法可行且成功。然而，从这些大型船舶内部获取样本的过程可能并非即时可行。本文详细阐述了如何在大型船舶上准备、组织并实施海水样本的采集与过滤过程。
引言
近几十年来，环境DNA（eDNA）分析，即检测生物体在环境中遗留的遗传物质，已迅速发展成为监测淡水和海洋动物群落的一种有前景的工具。这种分子技术能够在单个样本中同时鉴定多个分类单元（即采用宏条形码方法），从而实现对栖息或经过采样区域的生物群落的检测1,2,3,4,5。
目前，真正的挑战在于到达采样点，因为在大范围地理区域内采集样本往往在经济上和/或后勤上不可行，导致远洋区域的采样通常比更容易进入的沿海区域更少6。利用渡轮或其他商业船只可以实现高度可重复的采样断面，因为这些船只遵循特定的航线，通常在季节内保持稳定，并覆盖广阔区域7,8。此外，使用渡轮航线作为采样手段，可以在一天中的任何时间以及每个季节进行样本采集，不受天气和海况的影响，同时还具有众多其他优势（补充图1）。初步研究已证明该方法在评估生物多样性指数方面的可行性和准确性
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方案
1. 在实验室中做好准备
- 装备清单
- 查阅清单，确认采样和样品过滤所需携带的物品。清单见补充文件1。每项物品及其用途将在下文各节中详细说明。
- 打印一份补充文件1，并在采样任务出发前填写完毕。
- 准备袋中盒采样系统
- 尽可能在登船前于实验室内的通风橱中准备袋中盒。使用封口膜密封三个开口（袋口、用于封闭袋口的盖子部分以及出水阀的出口）（图3，材料表）。
- 将袋子卷紧，盖子拆下后密封置于袋内，并用胶带封好，防止运输过程中意外打开（图3）。
- 操作时应确保在上述密封过程中避免空气进入袋内，原因有二：(i) 防止空气中可能携带的污染物进入袋内；(ii) 防止袋内含气导致折叠后的袋子体积增大。
2. 登船前的准备工作
- 与船员协调
- 登船后，立即向船长及其船员告知所选的采样点，以便确定渡轮最接近每个被选为"固定采样站"（FSS）的....
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结果
按照所述方案执行操作后，操作人员将收集到数量等于FSS数量乘以3个重复的滤膜。每张滤膜会在其两侧之一上保留生物痕迹（环境DNA）。eDNA提取后的分析步骤在很大程度上取决于具体的研究问题、目标生物和研究目的。例如，在Valsecchi等人9开展的初步研究中，所描述的eDNA采集方案支持设计一项可重复且系统的海洋大型动物调查。通过采用宏条形码技术并选择两个不同的脊椎动物特异性标记进行分析，成功检测出多种脊椎动物物种（硬骨鱼类、软骨鱼类和鲸类）。这些结果使我们能够推断物种的相对丰度（图13）及其空间分布，从而重建采样路线沿线的脊椎动物群落组成及其营养结构9。这仅是一个示例，因为通过该方法获得的海洋环境DNA既可用于即时分析，也可在多年后进行分析（所采集的eDNA可存入专用样本库以供未来使用），适用于任何生物类群（真菌、细菌、无脊椎动物、浮游植物）的研究。
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讨论
由于实验方案步骤简单直接，在商业渡轮上操作时仍需考虑一些相关事项。冷却水取样管通常位于机舱区域，该区域的进入可能受到限制或需要事先获得授权。因此，确保获得相应授权并配备适当的个人防护装备至关重要（图4）。此外，水样的采集与过滤应尽可能在无菌条件下进行，以避免任何污染。在过滤前，维持冷链条件进行样品保存和转运是另一个必须确保的关键步骤。最好在采集后立即过滤袋装水（BiB）中的水样，这也便于样品运输。然而，若无法立即过滤，样品可在不影响其质量的情况下保存长达2周9。为有效保存样品，BiB在运输过程中应置于阴凉处，并避免阳光直射。此外，水样绝不可冷冻，以免破坏细胞组分，导致胞外DNA释放，而胞外DNA在过滤过程中更容易丢失。
尽管许多海洋环境DNA（eDNA）研究依赖于小体积（1–2 L）的海水样品，但我们选择过滤大体积（12 L）的海水样本（直至达到滤膜饱和），以尽可能多地保留eDNA，从而支持更多当前和未来（样品储存于海洋eDNA库MeDB）的分析。BiB的整个体积被均分为三个.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢那些允许本文所述方法得以测试和开发的人士，特别是 Antonella Arcangeli（ISPRA），她数十年来一直领导着“海上渡轮监测”（FLT）项目，通过密集的渡轮网络对地中海（以及非地中海）的鲸类动物进行持续的视觉监测，并且她坚信在渡轮航线中搜寻DNA这一雄心勃勃的设想；感谢来自科西嘉与撒丁尼亚渡轮公司（Corsica and Sardinia Ferries）的 Cristina Pizzutti，她满怀热情地接受了这一挑战，为我们首次在该公司船队的一艘运输船上测试该方法提供了后勤支持（同时也接待了前来拍摄的视频制作团队）；感谢 Fulvio Maffucci 为协调多家航运公司、获取船上采样许可所付出的努力。我们感谢 Roberto Lombardo，他的硕士论文项目开启了对环境DNA与渡轮结合应用的探索。最后，我们感谢那些允许我们登船并开展环境DNA采样的航运公司，这些支持源于 LIFE-CONCEPTU MARIS 项目，使我们有机会在地中海多艘不同船只上测试本方法：Grimaldi Lines、Minoan Lines、Tirrenia、Balearia、Corsica and Sardinia Ferries 以及 Grandi Navi Veloci（GNV）。当前由欧盟资助的 LIFE-CONCEPTU MARIS 项目，不仅验证了该方法大规模可复制性的概念可行性，同时也资助了本视频出版物的制作，使得标准化操作规程（SOP）能够广泛传播至更广泛的科学界和公众。我们感谢 Mattia Noccio....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4.7 厘米直径滤膜 | Biosigma S.p.A. | https://www.biosigma.com/ | 孔径为 0.45 μm 的滤膜，独立包装 |
| 4/5 升抽滤瓶 | Duran | https://www.duran-bottle-system.com/ | 5 升玻璃抽滤瓶，带塞 |
| 吸水纸垫 | Advantec MFS, Inc. | https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1 | 滤纸材质吸水垫，尺寸 47 毫米 |
| 袋中袋（BiB） | G.M.V. Agricenter S.r.l. | https://www.gmvagricenter.it/ | 10 升袋中袋，带出水阀 |
| 过滤筒 | Sartorius AG | https://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors# | Biostart 100 Monitor 过滤筒，包含 0.45 μm 滤膜 |
| 封口膜 | Merck | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium= cpc&utm_campaign=all+product_ dsa_WW_%28bing+ebizpfs%29& utm_id=626946489&utm_content= 1166583023365595&msclkid= d2b55b82440b1aef56fc3ca803c 6486f&utm_term=%2Fproduct%2F | 4 英寸 × 125 英尺卷装实验室封口膜 |
| 真空泵 | KNF Group | https://knf.com/en/us | Laboport 便携式真空泵 N. 96 |
参考文献
- Andruszkiewicz, E. A., et al. Biomonitoring of marine vertebrates in Monterey Bay using eDNA metabarcoding. PLoS One. 12 (4), e0176343(2017).
- Djurhuus, A., et al. Environmental DNA reveals seasonal shifts and potential interactions in a ma....
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