本方案介绍了如何通过重组蛋白纯化与泛素链切割实验相结合，来检测与神经发育障碍相关的遗传变异对去泛素化酶活性的影响。
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本文内容
摘要
摘要
神经发育障碍（NDDs）与神经系统功能受损相关，但在分子水平上往往仍缺乏深入理解。由单个基因引起的特定障碍为研究驱动非典型神经发育的机制提供了模型。编码去泛素化酶（DUB）家族蛋白的基因变异与多种NDDs相关，但目前亟需明确由这些基因变异所导致疾病的致病机制。基因变异对DUB活性的影响可通过不依赖底物的实验方法进行测定 体外 泛素切割实验。该实验无需了解下游底物即可直接测量催化活性。本文以去泛素化酶泛素特异性蛋白酶27X连锁（USP27X）为例，建立检测基因变异对酶活性影响的实验方案，该基因在X连锁智力障碍105型（XLID105）中发生突变。此实验流程可用于阐明由去泛素化酶基因变异引起的神经发育障碍的潜在机制。
引言
神经发育障碍（NDDs）由多种病因引起，其环境或遗传因素导致神经系统发育异常1。新一代测序遗传检测已将越来越多的泛素系统相关基因变异与遗传性NDDs联系起来2。泛素系统催化小分子蛋白修饰物泛素与底物蛋白中主要为赖氨酸残基的连接，从而驱动细胞行为的改变，包括定位、稳定性、蛋白质-蛋白质相互作用或活性的变化3。泛素化过程由E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶介导4，而去泛素化酶（DUBs）可催化泛素从底物蛋白上切割并移除，从而使该过程具有可逆性5。泛素可以单体形式（单泛素化）或聚合链形式（多聚泛素化）连接至底物蛋白，多聚链可在泛素的七个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）或M1位点形成。这些不同的泛素链拓扑结构及其组合构成了细胞内的信号传导关键编码系统6。
USP27X、USP7、USP9X、USP48、STAMBP、OTUD4、OTUD6B 和 OTUD5 等去泛素化酶（DUB）已被发现与神经发育障碍（NDD）相关2,7,
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方案
以下方案可针对在不同感受态细胞菌株中表达的带有各种亲和标签的重组蛋白进行调整。根据所表达蛋白的不同，培养及过夜表达条件可能需要对诱导表达时的OD600、表达时间、表达温度和IPTG浓度进行优化。本方案的总体流程如图1所示。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于材料表中。
1. 将重组 GST-USP27X 表达质粒转化至感受态 Rosetta 2 E. coli 细胞
注意：为保持细菌培养物的无菌状态，所有打开培养基容器的操作均须在本生灯火焰下进行。为实现最佳氧气传递，细菌培养振荡应在台式温控摇床中进行，振荡直径为 19 mm 至 50 mm，转速为 200 rpm29。
- 使用前立即在冰上解冻 20 µL 化学感受态 Rosetta 2 E. coli 细胞。加入 1–10 ng pGEX6P1-USP27X 表达质粒（编码N端谷胱甘肽-S-转移酶（GST）30 标签标记的 USP27X，并含有氨苄青霉素抗性基因），冰上孵育 5 分钟。
- 在 42 °C 干浴中热激 30....
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结果
为确定与XLID105相关的USP27X变异体对USP27X催化活性的影响，从细菌中纯化了带有GST标签的野生型USP27X以及与XLID105相关的F313V、Y381H和S404N变异体USP27X蛋白。这些变异体位于USP27X的USP催化结构域内图 2A）。由于先前有报道称 USP27X 可切割 K63 泛素链31野生型USP27X以及与XLID105相关的F313V、Y381H和S404N USP27X蛋白与K63连接的二泛素链在37℃下孵育1小时，随后对这些样品进行分离 通过 SDS-PAGE32，并分析了泛素和USP27X蛋白 通过 免疫印迹。野生型USP27X可诱导二聚泛素的切割，生成单泛素。图2B 和 补充图1）。与XLID105相关的USP27X变异蛋白F313V、Y381H和S404N不能切割这些链。由于F313V、Y381H和S40.......
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讨论
本文介绍了一种重组USP27X去泛素化酶（DUBs）的表达与纯化实验方案，以及一种 体外 泛素链切割实验用于比较野生型USP27X与神经发育障碍相关变异体蛋白的去泛素化活性。该实验确定，与XLID105相关的变异体会破坏USP27X的催化活性7这一机制性发现帮助我们将XLID105定义为一种由USP27X功能障碍引起的疾病。
该方案可适用于其他与遗传性疾病相关但分子机制尚不明确的去泛素化酶（DUB）。针对特定目标DUB优化其表达与纯化方案至关重要。若尚无针对某一特定DUB的详细实验方案报道，本文所述方法可作为起始参考。在优化蛋白表达与纯化流程时，关键步骤包括选择适当的参数：（1）表达系统（如细菌菌株、昆虫细胞或哺乳动物细胞），（2）表达载体，（3）所用标签及亲和树脂，（4）培养条件，（5）培养物用量，以及（6）是否需要进一步纯化（如 通过 尺寸排阻或离子交换色谱）。关于该方法这些及其他方面的具体建议已有讨论33.
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由Sanford Research为FB提供的启动资金以及NIH资助R01CA233700（授予MJS）支持。插图由Felipe G. Serrano（www.illustrative-science.com）完成。 我们感谢Greg Findlay博士（邓迪大学 ）提供GST-USP27X质粒。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Amersham Protran 0.45 NC 200 mm × 200 mm 25/包 | Cytiva | 10600041 | |
| 硫酸铵 | Fisher Scientific | AC205872500 | |
| 氨苄青霉素 | Fisher Scientific | BP1760 25 | |
| 抗泛素抗体（小鼠单克隆） | Biolegend | Cat# 646302, RRID:AB_1659269 | (WB: 1:1000) |
| 抗GST抗体（绵羊多克隆） | MRC-PPU 试剂与服务 | Cat# S902A 第三次采血 | (WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/ |
| 带挡板培养瓶 2 L | Fisher Scientific | 10-042-5N | |
| Bradford 试剂 | Millipore Sigma | B6916-500ML | |
| 氯霉素 | Gold Biotechnology | C-105-25 | |
| Complete 蛋白酶抑制剂片剂 | Millipore Sigma | 5056489001 | |
| Econo-Column 1.5 × 5 cm | Bio-Rad | 7371507 | |
| Eppendorf ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 5384000020 | |
| Excel | Microsoft | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | |
| 甘油 | Genesee Scientific | 18-205 | |
| Illustrator | Adobe | https://www.adobe.com/products/illustrator.html | |
| Image Studio | LI-COR 生物科学 | https://www.licor.com/bio/image-studio/ | |
| Inkscape | Inkscape | https://inkscape.org/ | |
| Invitrogen 4-12% NuPAGE 1 mm 12 孔胶 | Thermo Fisher Scientific | NP0322BOX | |
| IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷） | Genesee Scientific | 20-109 | |
| IRDye 800CW 驴抗山羊IgG二抗 | LI-COR 生物科学 | Cat# 926-32214 | (WB: 1:10000) |
| IRDye 800CW 驴抗小鼠IgG二抗 | LI-COR 生物科学 | Cat# 926-32212 | (WB: 1:10000) |
| Isotemp 数字干浴器 | Fisher Scientific | 88860022 | |
| K63 二聚泛素 | South Bay Bio LLC | SBB-UP0072 | |
| LB 琼脂 | Genesee Scientific | 11-119 | |
| LB 肉汤 | Genesee Scientific | 11-118 | |
| 溶菌酶 | Gold Biotechnology | L-040-100 | |
| MaxQ 4000 台式轨道摇床 | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000-7 | |
| MES-SDS 电泳缓冲液 | Boston Bioproducts Inc | BP-177 | |
| 微型管旋转混合器 | Fisher Scientific | 88-861-051 | |
| NuPage LDS 样品缓冲液 4x | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| Odyssey Fc 成像系统 | LI-COR 生物科学 | 43214 | |
| PageRuler Plus 蛋白分子量标准 | Thermo Fisher Scientific | 26620 | |
| pGEX6P1 人 USP27X | MRC-PPU 试剂与服务 | DU21193 | https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/ |
| pGEX6P1 人 USP27X F313V | Addgene | 225715 | Koch 等 2024 (PMID: 38182161) |
| pGEX6P1 人 USP27X S404N | Addgene | 225717 | Koch 等 2024 (PMID: 38182161) |
| pGEX6P1 人 USP27X Y381H | Addgene | 225716 | Koch 等 2024 (PMID: 38182161) |
| Pierce 谷胱甘肽琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | 16100 | |
| PMSF（苯甲基磺酰氟） | Gold Biotechnology | P-470-10 | |
| 聚山梨酯 20（Tween 20） | Fisher Scientific | AC233360010 | |
| Rosetta 2 感受态细胞 | Millipore Sigma | 71402-M | |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Fisher Scientific | LC6060 | |
| SmartSpec 3000 | Bio-Rad | 170-2501 | |
| SOC 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| 氯化钠 | Genesee Scientific | 18-216 | |
| Sonifier 250 超声破碎仪 | Branson | 100-132-135 | |
| Sorvall RC 6 Plus 离心机 | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
| TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐） | Gold Biotechnology | TCEP10 | |
| 优质肉汤粉末 | Genesee Scientific | 18-225 | |
| Tris 碱 | Genesee Scientific | 18-146 | |
| XCell SureLock Mini-Cell 和 XCell II 转膜模块 | Thermo Fisher Scientific | EI0002 |
参考文献
- Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept. Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).
- Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E.
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