该方案描述了紫外线B辐射对小鼠全身及局部皮肤效应的研究。
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摘要
摘要
中波紫外线（UVB）辐射（280–320 nm）自1928年起就被认定为致癌物，因此人们普遍主张尽量减少阳光暴露。然而，流行病学研究表明，阳光暴露与寿命延长以及心血管疾病和某些癌症（如结肠癌和子宫内膜癌）发病率降低相关。UVB暴露还影响肝脏代谢，可保护机体免受肝细胞脂毒性损伤，并影响整体代谢健康。这些效应部分归因于维生素D的合成，但其中一些作用与维生素D无关。此外，UVB光疗具有免疫调节特性，可用于治疗白癜风和银屑病等皮肤疾病，同时也能影响全身免疫系统。鉴于UVB具有广泛的生理效应，目前对大多数效应背后的机制仍缺乏充分理解。我们发现，每日低剂量UVB暴露可通过促进皮肤脂肪细胞分泌饥饿素（ghrelin），增强雄性小鼠的觅食行为，但在雌性小鼠中无此效应。在雌性个体中，雌激素抑制脂肪细胞中p53的活性，从而阻断饥饿素水平的升高，表明UVB辐射存在性别依赖性反应。此外，UVB诱导表皮角质形成细胞中p53的活化，可激活下丘脑-垂体-性腺轴，促进性行为并增强卵巢的促生育功能。本文介绍了一种利用C57BL/6J小鼠模型研究低剂量UVB辐射局部及全身效应的实验方案。关键步骤包括UVB剂量的精确校准、饲养条件的控制以及谨慎脱毛以确保暴露的一致性。小鼠接受为期数周的梯度UVB照射，并持续监测其健康状况和行为变化。文中还详细描述了通过色素沉着测量来验证辐射效率的方法。通过强调UVB剂量的校准、严格的动物护理以及方法学上的对照措施，该实验方案将有助于系统研究UVB暴露的全面效应，推动对其治疗益处与潜在风险的深入理解。
引言
到达地球表面的太阳辐射频率包括紫外线（UV）、UVA辐射（320-400 nm）和UVB辐射（280-320 nm）。UVB是一种诱变剂。早在1928年，紫外线就被确认为致癌物1，自20世纪中期以来，减少日晒被建议作为预防皮肤癌的谨慎措施2。尽管UVB显然是皮肤癌的环境诱因，但过去十年的研究3以及我们研究团队最近的研究4,5,6表明，UVB对生理系统具有广泛的影响。一项对女性队列长达20年的随访研究显示，与避免日晒的女性相比，不避光的女性预期寿命高出2年7。其他研究也表明，日晒与心血管疾病及总体死亡率的降低相关8,9,10。阳光照射与结肠癌及子宫内膜癌之间也存在负相关关系8。UVB暴露还可诱导肝脏代谢11，对肝细胞脂毒性及代谢性疾病具有保护作用，并对内啡肽水平和与性相关的行为产生积极影响3,6。这些证据表明，避免日晒对人类健康具有不利影响。日晒的有益作用主要归因于维生素D的生成，然而，至少部分阳光带来的健康益处与维生素D水平无关4,6,12
皮肤是人体最大的器官，也是抵御环境应激因素的第一道防线。表皮层和真皮层之间由基底层分隔，基底层由未分化的、具有自我更新能力的角质形成细胞和黑色素细胞组成10。随着终末分化程度的增加，角质形成细胞位于表皮的上层。真皮层包含成纤维细胞和血管，而皮下组织主要由脂肪细胞构成。皮肤也是一种皮肤-内分泌器官，因为皮肤中表达多种激素受体，例如雄激素受体和促肾上腺皮质激素释放激素受体，这表明激素可通过旁分泌和自分泌途径影响皮肤内的各种生理过程13,14,15。此外，皮肤本身也能合成激素。然而，除少数例外情况外，皮肤中激素的生成及其向血液中的释放尚未得到充分证实，其表达的触发机制也尚不明确（详见文献16的综述）。
已有研究表明，UVB 在皮肤疾病中具有治疗潜力。光疗，包括补骨脂素-UVA 和窄谱 UVB 治疗，是泛发性白癜风的主要治疗方式17。治疗开始后 6 个月，74% 的患者对光疗产生反应；12 个月时，反应率达到 75%18。光疗在白癜风中的作用机制尚不明确。其治疗作用涉及对细胞周期动力学的影响、细胞因子表达的改变、对黑素细胞的作用以及免疫调节的综合作用。大量研究已探讨了光疗对皮肤免疫的影响19,20,21；然而，其全身性效应仍不清楚，尤其是在白癜风的背景下。与银屑病不同，在银屑病中一项研究显示光疗后促炎性细胞因子减少、调节性 T 细胞增加，而在白癜风患者中，UV 光疗后调节性 T 细胞数量减少21。
尽管中波紫外线（UVB）对大脑14，15、肾上腺22、卵巢5，6、睾丸6、肝脏11以及淋巴结23均具有影响，但目前对于UVB调节全身系统的作用机制仍大多未知。本研究方案描述了一种用于研究UVB照射对机体局部（皮肤）及全身效应的小鼠模型，有助于系统性地探讨UVB暴露的广泛影响。该UVB小鼠模型在皮肤生理学、皮肤病学及皮肤癌（尤其是黑色素瘤）研究领域具有广泛的应用价值。本方法的总体目标是提供一种简单、稳健且有效的实验方案，以建立适用于皮肤相关科学研究问题的UVB小鼠模型。该方案详细阐述了如何克服在生理条件下因脱毛及UVB照射所引发的皮肤红斑等技术难题，可有效用于研究UVB对皮肤的局部和全身效应。
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方案
所有描述的实验操作均按照特拉维夫大学机构动物护理与使用委员会（IACUC 许可证：01-20-043）的指南进行。
1. 实验小鼠的适应性驯化
- 根据实验人员的IACUC方案，通过商业供应商购买或自行繁育7至8周龄的C57BL/6J小鼠。本方案针对的是C57BL/6J背景的15周龄小鼠，但该方案需针对其他品系小鼠及更年轻年龄段（< 7周龄）进行校准。
注意：使用不同年龄分组小鼠的方案必须经实验所在机构的IACUC批准。动物健康状况的详细信息见（补充表1）。 - 在实验开始前至少对小鼠进行7天的适应性饲养。运输和后勤操作后，适应性饲养对小鼠至关重要。
2. 小鼠的饲养
- 将动物饲养在铺有标准垫料的饲养笼中 随意摄取 在标准温度22 ± 1°C、湿度32%–35%条件下，采用12:00小时明暗循环（光照时间：07:00–19:00，黑暗时间：19:00–07:00），自由摄取标准饲料和水。
注意：我们已在限制性饮食获取条件下测试过本方案，其在这些实验条件下同样适用。 - 确保每笼小鼠数量符合其体重、窝仔数及实验假设的要求。
3. 剃须与脱毛
- 在剃毛前，将小鼠放入异氟烷麻醉舱内，连接设定为5%异氟烷和1 L/min氧气流速的麻醉蒸发器。
注意：女性实验人员使用异氟烷时应谨慎，因为暴露可能造成严重健康危害，孕妇必须避免以任何形式接触。 - 确保小鼠处于静止状态且呼吸稳定。使用眼药膏以防止角膜干燥。
- 转动 开启 使用剃毛机（刀头尺寸 LxWxH：204 x 50 x 41 mm），使其与小鼠皮肤保持平行。轻轻将剃毛机沿前进方向移动，切勿将机器压入小鼠皮肤；往返剃毛数次即可充分去除小鼠背部毛发。剃毛时应沿背部方向进行，使背部区域的50%–60%被剃除毛发图1在开始辐射暴露之前完成。每当小鼠出现毛发再生斑块时（通常约为0.5 cm）需重新剃毛。
注意：使用剃毛器时需格外小心，避免损伤或撕裂动物皮肤；实验人员应尽量保持剃毛器与皮肤平行。小鼠剃毛的频率取决于品系及所给予的实验处理类型。 - 一次麻醉一个笼子中的小鼠，然后进行剃毛。剃毛后，使用棉片将脱毛膏（用量以覆盖棉片涂抹头为宜）涂抹于剃毛区域。注意避免将脱毛膏靠近动物眼部，否则可能导致严重并发症和瘙痒。
- 1-2 分钟后，用浸有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的拭子轻轻擦拭该区域，以去除小鼠体表残留的脱毛膏及粘附的毛发。
注意：延长计时（> 使用脱毛膏处理5分钟可能会对小鼠皮肤造成损伤，应避免。请确保PBS的温度为室温，不可过冷。 - 用柔软的纸巾擦干剃毛区域，然后将小鼠放入含有垫料的清洁干燥恢复笼中。密切观察小鼠，直至其恢复意识。
注意：红外灯可确保小鼠在洗涤步骤后体温不会急剧下降。 - 让小鼠在它们的笼子中休息 随意摄取 在首次UVB照射前，需提供食物和水，并让动物从剃毛操作中恢复至少10天。
注意：如果小鼠在剃毛后10天内暴露于UVB，可能导致皮肤红斑。
4. 紫外线B照射设置
- 穿戴长袖衬衫、长裤、实验服、封闭式鞋子、双层手套和面罩。在生物安全柜内进行照射操作，并放下10 mm厚的聚甲基丙烯酸甲酯（plexiglass）盖板，以防止实验人员暴露于UVB辐射。
- 将UVB灯放置在透明的Plexi玻璃腔室内，但不要打开电源，如图所示 图2.
- 转动 开启 打开紫外线B（UVB）灯并使其运行至光强稳定。使用配备UVB测量探头的UVX辐射计监测，将UVX辐射计开启并放置到位。务必进行切换 开启 将 UVX 辐射计调至 20 mW/cm2 并读取辐射计上的设置。让UVB灯预热并稳定至少2分钟。当灯准备就绪后，取出UVX辐射计。
- 使用一个干净的笼子（非原居笼）进行照射，并将其放置在生物安全柜内的紫外灯下。在开启或关闭紫外灯以分别进行紫外照射或模拟照射处理前，将小鼠转移至照射用笼子中。每次仅处理2只小鼠，以确保有足够的空间。
注意：照射室的底面积为500 cm²，内部高度为14 cm，以确保小鼠在照射过程中可自由活动而不会相互攀爬。使用照射室的目的是避免小鼠在照射期间相互重叠，从而保证每只小鼠接受相同剂量的UVB照射。若在照射室内放入超过两只小鼠，将导致小鼠相互攀爬，进而造成每只小鼠实际接受的UVB剂量不一致。 - 使用计算器计算使小鼠暴露于目标 UVB 强度所需的时间。例如，如果 UVX 辐射计显示 2 mW/cm²2 在显示屏上，所需曝光量为 50 mJ/cm2 将小鼠放入紫外线照射室，在紫外线灯开启的情况下照射25秒。
注意：开始前请确保穿戴好步骤4.1中提到的适当防护装备。整个治疗过程中的照射时间范围为20-120秒。然而，由于UVB灯的辐射强度不同，照射时间可能有所变化，因此每次治疗均应重新计算。按照本方案操作，通常不会出现体重减轻、疼痛反应（包括严重皮肤灼伤、出血、红斑、冷漠或呼吸困难）等表现，因此无需将小鼠从实验中剔除。 - 将雄性和雌性小鼠分别进行暴露实验，每次更换性别时，使用消毒剂清洁实验箱，以避免行为学研究中气味的交叉污染。若需暴露不同组别的小鼠（例如接受额外处理、基因转导或对照动物），在每组暴露之间均应清洁实验箱，以避免两组之间未知因素的交叉污染。
5. 紫外线B照射
- 转动 开启 紫外线B灯，并按照步骤4.1至4.5进行设置
- 将小鼠从饲养笼转移到暴露室，持续所需时间。使用配备15 W、302 nm UVB灯管的XX-15型照射仪，每周5天、连续8周每天对小鼠进行一次UVB照射（根据实验设计可调整照射天数）。
注意：暴露持续时间具有主观性，需根据具体科学问题而定。动物不应出现皮肤红斑。若出现红斑，应立即停止暴露并向兽医报告。我们采用每周5天暴露、周末除外的方案。在与本方案类似的情况下，可降低UVB剂量的暴露频率，但若需增加暴露次数，则须由实验人员重新校准。 - 将小鼠暴露于50 mJ/cm的UVB剂量下2C57BL/6J小鼠品系中的亚红斑剂量。
注意：50 mJ/cm² 的 UVB 剂量2 是一个亚红斑剂量，我们在实验小鼠中已使用该剂量持续8周。在其他实验中，我们采用了一次性200 mJ/cm²的UVB照射2 研究DNA损伤4. - 将未进行模拟照射（未暴露于UVB）的脱毛小鼠置于辐射室中相同时间，但不打开UVB灯，作为UVB照射的对照组。
注意：由于小鼠具有新物恐惧倾向，涉及小鼠的实验应始终设置对照组，对照组接受与实验组相同但不含实际处理因素的模拟处理。
6. 紫外线B暴露分析
注意：根据美国兽医协会（AVMA）指南，使用 CO2 窒息法对小鼠实施安乐死。
- 为验证辐射效率，使用皮肤分光光度计或类似仪器测量耳朵和尾部色素沉着（图2），或如先前所述4，通过免疫染色皮肤活检样本，随后进行Fontana-Masson染色。
- 使用皮肤分光光度计进行验证：使用干净的纯白纸校准皮肤分光光度计以设定基线。校准完成后，将测量传感器置于小鼠的耳朵或尾部，记录黑色素强度读数。模拟UVB辐射与UVB辐射小鼠的黑色素水平如图3所示。
- 通过免疫荧光进行验证：将小鼠皮肤活检组织（2 cm × 2 cm）用4%多聚甲醛固定，并包埋于石蜡块中。取10 µm厚的组织切片，在4 °C条件下用抗CPD抗体（使用浓度为1:100）24孵育过夜，随后在室温下用荧光标记的二抗（山羊抗兔Alexa-594偶联二抗，使用浓度为1:1000）24孵育1小时。用DAPI对组织进行复染，并通过荧光显微镜获取图像。
- 通过Fontana-Masson染色进行验证：将小鼠皮肤活检组织用4%多聚甲醛固定，并包埋于石蜡块中。采用Fontana-Masson染色方案4，使用硝酸银和氯金酸溶液对10 µm厚的组织切片进行黑色素染色。用核固红溶液对组织活检样本进行复染，使用封片剂封片，随后在显微镜下进行明场成像。
7. 动物护理
- 按照机构动物护理和使用委员会的指南进行动物实验。
- 每周称量小鼠体重，以评估其基本健康状况。若两次测量间体重下降超过>15%，则将其从实验中剔除。若动物出现疼痛迹象，包括严重皮肤灼伤、出血、红斑、冷漠或因UVB照射导致的呼吸困难，应按照机构动物护理和使用委员会的指南予以安乐死。
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结果
本方法论文介绍了建立UVB照射小鼠模型的详细逐步操作流程。图1清晰展示了代表性C57BL/6J小鼠在UVB照射前背部剃毛区域，显示背部面积的50%-60%已被剃除。剃毛操作未引起皮肤红斑，这对皮肤病学研究至关重要。图2展示了使用UVB灯在独立的UVB照射室（置于有机玻璃舱内）对小鼠进行UVB照射的装置设置。该装置为本实验室自主设计，具有成本低、效率高、操作便捷且维护简单的特点。图3展示了UVB照射后皮肤色素沉着随时间逐渐增加的代表性结果，观察周期为4周。小鼠皮肤色素沉着程度使用皮肤分光光度计进行测定。这些代表性结果验证了概念可行性，并与既往UVB照射研究4,25一致，通过免疫荧光和Fontana-Masson染色进一步证实了UVB照射方案的有效性。
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讨论
长期以来，中波紫外线（UVB）一直被认为是皮肤癌的环境风险因素；然而，近期研究揭示了UVB更广泛的作用谱3。目前亟需开展能够深入理解UVB系统性效应的研究。基础研究与临床应用中所采用的UVB剂量存在差异，这增加了对UVB效应理解的复杂性，凸显了开展能够弥合这一差距的研究的重要性。
本文所述的C57BL/6J小鼠UVB照射方案包含多个关键步骤，以确保实验的可靠性和可重复性。精确的剃毛和脱毛处理对于实现背部皮肤表面均匀接受UVB照射至关重要，而逐步增加UVB剂量有助于避免急性皮肤损伤，并模拟实际暴露情况。通过色素沉着测量和皮肤活检来验证辐射效率，是该方案的另一优势。这些方法可提供具体且可量化的数据，用于评估UVB照射的效果。该方案能有效诱导皮肤色素沉着的变化，反映出UVB辐射的剂量依赖性效应。这些结果与已知的UVB影响一致3,25，验证了实验设计的合理性及其在后续研究中的适用性。
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致谢
C.L. 承认获得以下资助：欧洲研究理事会根据欧盟“地平线2020”科研与创新计划提供的资助（资助协议编号726225）、复杂人类疾病中心基因调控I-CORE（编号41/11）以及以色列科学基金会（ISF；资助编号129/13）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 消毒剂 | Amity international | 不适用 | |
| 暴露室 | 自制 | 不适用 | |
| 脱毛膏 | Veet | 不适用 | |
| 毛发剃除器 | Heiniger | 707-303 120V US | |
| 异氟烷 | Piramal Critical Care | 不适用 | |
| 异氟烷系统 | Kent Scientific | VetFlo-1210S | |
| PBS | Sigma Aldrich | TMS-012 | |
| 有机玻璃室 | 自制 | 不适用 | |
| UVB 灯 | Ultra-Violet Products | XX系列 - 15 瓦 | |
| UVX 辐射计 | Ultra-Violet Products | 97-0015-02 |
参考文献
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