基于数字加热装置的小鼠棋盘样烧伤创面愈合模型

摘要

本文介绍了一种使用数字加热装置在小鼠中建立烧伤伤口愈合模型的简化方案。在皮肤上创建的棋盘状实验位点有助于进一步进行伤口愈合检测的功能分析。

摘要

严重烧伤是最具创伤性和身体致残性的病症之一，几乎影响所有器官系统，导致显著的发病率和死亡率。鉴于其复杂性以及多器官受累，已开发出多种动物模型以模拟烧伤损伤的不同方面。在不同实验动物模型中，产生烧伤表面的方法各不相同。本研究描述了一种简单、经济且操作友好的小鼠烧伤模型，利用数字加热装置制造稳定的一致性全层烧伤。该装置的加热头在97 °C条件下作用于小鼠背部10秒，形成棋盘样烧伤，用于评估实验性敷料对创面愈合的影响。采集皮肤样本进行组织学分析，包括苏木精和伊红（H&E）染色及Masson染色。通过创面面积分析以及对炎症细胞浸润、再上皮化和肉芽组织形成的显微观察来评估创面愈合情况。该小鼠烧伤模型可作为研究热损伤病理生理机制及评价治疗干预措施的基础工具。

引言

烧伤被认为是皮肤的重要创伤之一，由热力、电能、化学物质以及辐射暴露引起^1,2。根据损伤深度，烧伤可分为四个等级，从表皮层到皮肤全层，甚至累及肌肉和骨骼。小面积烧伤可导致瘢痕形成，并增加感染风险。大面积烧伤不仅造成局部组织损伤，还会通过持续而严重的炎症和免疫反应，引发心脏、肾脏及其他器官或系统的功能紊乱，导致严重的全身性后果和高发病率³。大多数烧伤幸存者伴有长期的身体功能障碍、情绪困扰以及生活质量下降^4,5。因此，研究烧伤的病理过程及烧伤组织再生机制具有重要意义。

参与免疫反应、组织再生及系统性稳态 体外 这些研究无法全面探究烧伤创面愈合的病理过程。因此，在过去二十年中，为了探索潜在的治疗干预手段，已开发出多种烧伤创面愈合的动物模型，以模拟烧伤损伤的不同特征。^6,7烧伤伤口通常在去除猪、大鼠、小鼠、兔子及其他动物背部毛发后，在其背侧表面造成。烧伤时间可持续3秒至30秒，以形成累及体表总面积（TBSA）5%至30%的浅层至全层热损伤。⁸目前，由于所用技术的高变异性，烧伤动物研究中尚无这些方法的标准化模型。用于制备烧伤表面的方法在不同的实验动物模型间存在差异，包括气体火焰⁹，燃烧的乙醇浴¹⁰预热的单金属板/棒^11,12，煮沸或热水^13,14然而，以往研究中烧伤造模技术及所产生烧伤深度常存在不一致且描述不清的问题，而烧伤深度对于确定烧伤严重程度及治疗方法至关重要。

本研究旨在建立一种简单、经济且操作友好的小鼠烧伤动物模型，用于在模拟临床场景下产生一致的全层皮肤烧伤。在本实验方案中，我们使用了一种便捷的数字加热装置，通过调节施加于皮肤的温度来控制烧伤深度。该装置的加热头可更换为不同尺寸，以诱导具有不同体表面积（TBSA）范围的热力烧伤。这种方法可在小鼠背部形成类似棋盘状的烧伤创面，从而在同一只动物体内同时比较多种实验处理与对照处理的效果。我们对创面愈合过程进行了观察和记录，并在伤口修复的不同阶段采集皮肤组织样本，进行组织学评估（苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色染色）。该策略减少了实验所需动物数量，从而降低了经济成本，同时更符合动物伦理要求。本研究将为科研人员提供必要的工具，以促进烧伤损伤新型治疗方法的开发，并揭示烧伤创面愈合的病理生理机制。

方案

本研究中的所有动物实验均经四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-D-2024-499）审查并批准。本研究使用了24只八周龄C57BL/6小鼠（雌性，体重25-30 g）。所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 烧伤前的设备准备与小鼠处理

1. 动物到达后，将其饲养在笼具中适应7天，以适应环境。
2. 用70%乙醇（v/v）喷洒并擦拭工作区域以进行消毒。用无菌外科吸收垫覆盖操作台面。
3. 将数字加热装置的温度调节至 97 °C。该加热装置由三个部分组成（图1).
   注意：可通过温度控制器调节 50–450 °C 的温度图1A）。支架底座用于放置吸头（图1B），可拆卸（图1C）以更换不同规格的器械。使用碘伏或酒精对尖端进行消毒。
4. 在诱导室中，使用100%氧气携带5%异氟烷（流速：4 L/min）对小鼠麻醉3分钟，直至呼吸变慢。通过脚趾夹捏试验评估麻醉深度。
   注意：吸入异氟烷可能导致嗜睡并对心血管系统造成损害。必须佩戴防护装备，并在通风良好的区域内的通风橱中操作。
5. 小鼠深度麻醉后，将其转移至俯卧位的加热垫上，以维持体温并防止麻醉恢复期间发生低体温。将异氟烷浓度调至1.5%用于维持麻醉 通过 鼻锥
6. 用棉签将润滑凝胶涂抹于小鼠双眼，以防止角膜干燥。

2. 诱导全层烧伤损伤

注意：烧伤诱导与分析的一般流程见图2。

1. 使用电动剃毛器轻轻剃除小鼠背部从颈部至尾部约5 cm长、4 cm宽区域的毛发，操作时需轻柔，避免损伤皮肤（图3C）。
2. 用棉签将脱毛膏均匀涂抹于已剃毛的皮肤区域，保持3分钟（图3D）。
   注意：避免将脱毛膏接触小鼠其他部位，以防造成难以察觉的灼伤。若使用时间超过5分钟，脱毛膏可能引发皮肤刺激。不同产品的最佳作用时间可能存在差异，应由操作者根据实际情况确定。
3. 用湿润的纱布擦拭皮肤，直至完全清除脱毛膏和残留毛发。随后依次使用氯己定消毒液和70%乙醇（v/v）各擦拭三次，对术区进行消毒。最后用无菌纱布清洁并擦干皮肤。
4. 取一支已灭菌、直径为9 mm的1 mL移液器吸头（图3A），蘸取无菌墨水，在皮肤上精确标记所需造伤位置。小鼠背部皮肤表面不平整，因此明确伤口位置与脊柱之间的相对关系，对于保证实验可重复性至关重要。
5. 用预先裁剪好的无菌手术巾覆盖皮肤，仅暴露手术区域（图3）。佩戴耐热手套，并检查数字加热装置的温度。在诱导灼伤前及每次使用后，均需用70%乙醇（v/v）对装置尖端进行消毒。
6. 将加热装置的尖端置于已标记伤口位置的中心，于97 °C下作用10秒，制造6个直径为4 mm的圆形灼伤创面（图3B）。相邻灼伤之间的间距为0.5–1 cm。根据实验设计确定灼伤数量。
   注意：灼伤主要由热传导引起，因此无需施加额外压力，仅需依靠装置自身重力使其与皮肤接触即可完成造模。本实验设计共制造6处灼伤，此为本研究所用设备及小鼠背部可用面积下所能建立的最大灼伤数量。在此基础上可实现同一实验组的多次重复。

3. 烧伤后护理与测量

1. 在烧伤创面上敷冰5分钟，以减轻潜在疼痛，进行疼痛管理（图3G）。
2. 烧伤损伤后关闭异氟烷，取下鼻罩。将小鼠转移至加热垫，直至小鼠活动恢复正常（例如，不再蜷缩或颤抖）。
3. 将每只小鼠单独放置于恢复笼中，防止相互抓挠。通过向每粒饲料滴加5–10滴饮用水使其软化，并置于笼底，以方便进食。
   注意：使用70%乙醇（体积比）喷洒并擦拭笼具进行消毒。垫料应定期更换，以保持小鼠温暖并吸收尿液。
4. 在尾部皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg），每日两次，连续给药3天，每次注射间隔至少8小时。
5. 烧伤诱导24小时后，用生理盐水浸湿的无菌纱布清洁所有创面。用纱布轻压吸干皮肤，并使用注射器涂抹少量抗菌凝胶（TKH水凝胶）覆盖烧伤创面^12,14。此后于第3、7、10天重复此操作。
6. 使用透气透明敷料覆盖创面。敷料大小应覆盖创面周围约1 cm区域，且不应覆盖未脱毛区域。
   注意：至少每2天更换一次创面敷料。长时间不更换敷料可能导致创面感染并形成脓液，进而延缓创面愈合。
7. 在随访期间，每2–3天测量一次体重。通常情况下，若小鼠体重减轻达到初始体重的15%–20%，应实施安乐死并退出实验。

4. 伤口样本采集

1. 在第0、3、7、10和14天，用无菌1 mL移液器吸头的尖端标记伤口，并用数码相机记录。
2. 通过麻醉过量和颈椎脱位（遵循机构批准的方案）处死小鼠。
   注意：进行颈椎脱位时需谨慎，避免过度牵拉，以免损伤背部伤口。
3. 使用剪刀分离伤口部位及其周围皮肤，包括下方肌肉组织（1 cm × 1 cm）。每组至少准备三个样本。
4. 将皮肤样本置于4%多聚甲醛（PFA）中固定24小时，并在4 °C下保存。固定液体积必须为组织体积的30倍^15,16。
   注意：PFA具有危害性。务必在通风良好的环境中操作，并使用适当的防护设备。

5. 伤口愈合评估

1. 用 PBS 清洗伤口组织两次，并用滤纸铺平，滤纸应修剪至适当大小（图 2H）。由于皮下组织层含有一定黏液成分，其可黏附于滤纸表面，不会移动或发生组织卷曲。
   1. 将滤纸和样品放入组织包埋盒中，进行石蜡脱水以获得较为平滑的组织样品，然后包埋组织^15,16将样品在 4 °C 下保存。
      注意：尽可能将组织拉伸平整，避免产生任何折叠，因为这些褶皱在固定后会永久保留。
2. 将石蜡包埋的样品切成5 µm厚的切片，并对载玻片进行染色 通过 H&E 和马松三色染色用于评估肉芽组织形成程度、血管生成及胶原沉积情况，为判断伤口愈合的不同阶段及其进展提供依据^17,18.
3. 使用40倍物镜的显微镜拍摄所有样品的图像。
4. 使用兼容的软件分析染色的皮肤切片，包括表皮、真皮、皮下组织及肌肉状况。

结果

在本实验方案中，使用数字加热装置在97 °C条件下持续灼烧10 s，形成棋盘状的烧伤创面（图1）。该装置的探头由纯铜制成，具有优良的导热性和快速加热能力。实验人员手持部分由聚碳酸酯材料制成，具有耐热性和阻燃性。与预加热的单一金属板/棒、煮沸或热水法相比，该装置具有更优的安全性能，并减少了小鼠的麻醉时间，从而缩短了整体实验时长。

烧伤诱导与分析的整体流程如图2所示。每只动物背部共有六个烧伤创面，排列方式如图2E所示。在烧伤后第1、3、7、10和14天分别评估这些动物的创面大小，并采集皮肤组织样本进行组织学分析，包括苏木精-伊红染色（H&E）和马松三色染色。

烧伤后，每个烧伤创面均呈圆形，面积相等且深度均匀。烧伤创面边缘颜色由蜡白色逐渐转变为红色，并伴有因损伤后即刻炎症反应所致的充血带。此外，烧伤后72小时内，烧伤创面面积略有增大（

讨论

用于烧伤研究， 体外 模型通常侧重于局部抗菌剂或抗生素对与烧伤相关的细菌的抑制作用，例如 金黄色葡萄球菌 和 铜绿假单胞菌¹⁹，以及各种生物材料（如弹性蛋白、丝素蛋白和水凝胶敷料）的影响^14,20烧伤后炎症细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）或干细胞（如间充质干细胞）上的实验。这些实验通常在人工控制的环境中进行，细胞培养 体外 可能表现出与那些不同的生长特征和行为 体内，可能无法充分模拟烧伤创面愈合的生理过程，例如细胞间相互作用以及细胞外基质的影响。因此，烧伤的动物模型对于阐明烧伤后的病理机制以及评估新型治疗策略至关重要。小鼠与人类的伤口愈合过程均经历四个相互重叠但 distinct 的阶段：炎症期、增殖期、再上皮化期和重塑期^21,22使用小鼠作为实验对象具有多种生物学优势，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 移液器吸头	KIRGEN,USA	KG1333	用于定位烧伤创面部位
3 M Tegaderm 敷料膜	3M,USA	1624WCN 6 cm x 7 cm	用于烧伤诱导后的创面覆盖
4% 多聚甲醛（PFA）	Biosharp,China	BL539A	用于固定皮肤样本
丁丙诺啡	Sigma-Aldrich,USA	PHR8955-50MG	用于小鼠的疼痛管理
C57BL/6 小鼠	成都大硕实验动物有限公司,中国	无	用于建立烧伤模型
脱毛膏	Veet,中国	—	用于小鼠背部毛发去除
数字加热装置	深圳卡珀科技有限公司,中国	No.936D	用于小鼠烧伤诱导
电动剃毛器	AUX,中国	AUX-A5	用于小鼠背部毛发去除
滤纸	—	—	用于展开皮肤样本
GraphPad 软件	—	GraphPad Prism 9.5.0	用于分析烧伤创面面积
耐热手套	—	—	用于持握数字加热装置的加热头
苏木精-伊红染色试剂盒	Solarbio,中国	G1120	用于切片的组织学分析
ImageJ 软件	—	ImageJ 1.54f	用于分析烧伤创面面积
异氟烷	RWD,中国	R510-22-10	用于小鼠麻醉
马松三色染色试剂盒	Solarbio,中国	G1340	用于切片的组织学分析
显微镜	Olympus,日本	VS200 ASW	用于扫描 H&E 和马松染色切片
组织包埋盒	江苏赛特曼实验耗材制造有限公司,中国	31050102W	用于组织石蜡脱水及石蜡包埋