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通过脾内注射腺相关病毒8型（AAV8）递送的短发夹RNA实现肝脏高效基因沉默

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DOI：

10.3791/67376

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2024年11月1日

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

本文内容

摘要

本方案描述了通过脾内注射AAV8递送的短发夹RNA，可实现与门静脉注射相同的肝脏基因敲低效率，且操作更为简便，并显著降低围手术期和术后死亡率及并发症发生率。

摘要

肝脏是一个执行重要代谢功能的主要器官。开发一种高效且安全的肝脏基因表达敲低方法，为研究基因在肝脏病理生理学中的功能提供了重要工具。本研究描述了一种通过脾内注射表达针对目的基因核仁素（nucleostemin, NS）的小发夹RNA（shRNA）的8型腺相关病毒（AAV8）的方法。与门静脉注射相比，脾内注射表达靶向NS的shRNA的AAV8（AAV8-shNS1）在肝脏中实现了相同的NS基因敲低效率，而对照组注射表达随机序列shRNA的AAV8（AAV8-shScr）。此外，AAV8-shRNA病毒注射在肝实质中引发的炎症反应极轻微。最重要的是，该脾内注射方案技术要求不高，且注射部位出血极少，而注射部位出血是进行门静脉注射时导致围手术期和术后死亡的主要原因。本研究报道了一种更为优化且相对安全的实现肝脏高效基因敲低的方法。

引言

肝脏是一个重要的器官，负责代谢营养物质和化学物质，但也持续暴露于细胞毒性及致癌性损伤之中。尽管成年肝脏在受损后具备再生能力，但其再生能力会随着年龄增长而显著下降。1截至目前， 对于终末期慢性肝病或大面积急性肝损伤患者而言，唯一有效的治疗手段是肝移植，但该方法本身面临诸多挑战2为了通过探究目的基因的功能来更深入地理解肝脏的分子病理生理学机制，已开发出针对以下对象的遗传操作技术 体内 应用，包括RNAi介导的基因敲低以及在loxP位点存在下通过Cre重组酶进行的靶向缺失3Cre表达盒和shRNA载体可通过病毒载体递送。

腺相关病毒血清型8（AAV8）是一种高效的基因递送载体，可靶向特定组织类型（如肝脏、骨骼肌、心脏、脑和胰腺），具有转导效率高、炎症反应低的特点4,5。为了靶向体内器官，通常通过尾静脉注射导入AAV8，病毒颗粒首先经过肺部，再进入体循环。相比之下，门静脉注射可使病毒颗粒优先到达肝脏，之后才流经肺部，从而避免肺部对病毒的截留和稀释作用。然而，门静脉注射技术难度较高，常伴随手术引起的出血及较高的死亡率。为在实现肝脏高效基因敲低（KD）的同时避免围手术期和术后高死亡率的问题，我们测试了一种经脾内注射携带靶向核仁素（nucleostemin, NS）的工程化shRNA的AAV8（AAV8-shNS1）的方法，并将其基因敲低效率与门静脉注射AAV8-shNS1的效果进行了比较。

NS 是一种在神经干细胞中首次发现、随后在多种其他干细胞及癌症中发现的富含于干细胞/祖细胞的蛋白质6,7NS 的生物学重要性体现在生殖系 NS 敲除（NSKO）小鼠的早期胚胎致死表型上 体内3,8 并通过NSKD诱导的自我更新扰动 体外9,10在成年动物中，NS的高表达水平存在于睾丸以及多种再生组织中，包括晶状体摘除后去分化的新螈色素上皮细胞和肢体截肢后的肌细胞11以及再生哺乳动物组织，例如心脏损伤后的小鼠心肌细胞12 肝损伤后肝细胞例如，CCl4或手术切除（例如，肝部分切除术）13,14此外，NS已被证明在乳腺、肝脏和口腔肿瘤的发生发展中发挥重要作用15,16,17从机制上讲，NS 已被证明可通过保护复制中的基因组免受 DNA 损伤来促进自我更新18,19然而，由于生殖系NSKO具有早期胚胎致死表型，因此需要一种可在组织发育完成后时间特异性地诱导NSKD的实验方法，以进一步确定其在成体器官中的生物学功能。

在本文中，我们以NS为例，说明一种建立和测试 体内 一种高效且手术诱导死亡率低的肝脏基因敲低方法。

方案

本研究中完成的所有动物实验均经德克萨斯农工大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）审查并批准&休斯顿#38;M大学健康科学中心（批准号：2021-0264-IBT）批准并监督本研究的实施，所有操作均符合相关法规及机构指南。实验使用雌性C57BL/6J小鼠（4–5月龄，体重23–30 g）。 所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. AAV8-shRNA 设计与制备

注意：有关操作细节，请参阅 Sands 等人4。

  1. 设计靶向目的基因编码区中一段21个核苷酸长序列的正义与反义shRNA寡核苷酸。本实验中使用了小鼠NS（shNS1）以及一段21个核苷酸的随机序列作为阴性对照（shScr）（图1A，下图）
  2. 在发夹结构中包含以下元件：茎环序列TTCAAGAGA、5'端平末端、3'端XhoI兼容性黏性末端，以及基因特异性靶向正义序列5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3'（shNS1）或随机化序列5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3'（shScr）。
  3. 磷酸化并退火每对寡核苷酸。
  4. 消化 AAV 基因转移载体，AV5-siRNA-GFP（图1A，上图），用 HpaI 和 XhoI 酶切，去磷酸化，并对载体片段进行凝胶纯化。
  5. 将退火的寡核苷酸连接至凝胶纯化的载体中。
  6. 将连接的DNA产物转化至感受态DH5α 具有亚克隆效率的细菌
  7. 通过氨苄青霉素抗性筛选单克隆，并培养100 mL细菌培养物用于质粒小提。通过测序确认正确克隆，并使用 commercially available 无内毒素质粒提取试剂盒（遵循制造商说明书）制备质粒。
  8. 使用iMFectin转染试剂将AV5转移载体、Rep/Cap 8型血清型质粒和AdF6辅助质粒共转染至293T细胞中，以包装AAV8病毒。总共40 × 15 cm 培养皿在转染后第3天进行转染处理并收获/消化。
  9. 通过细胞裂解回收细胞相关AAV8，并用40% PEG沉淀培养基中分泌的AAV8。消化后，合并细胞裂解液和培养基中的AAV8病毒，采用不连续碘克沙醇梯度离心纯化，再使用分子量截留离心浓缩装置（100,000 MW）进行浓缩。
  10. 使用引物 WPRE-172（5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3'）和 WPRE-392（5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3'）通过绝对终点 qPCR 法定量 AAV8 滴度。

2. 脾内注射 AAV8（图 1B, 1C） 

  1. 将 C57BL6/J 小鼠置于充满 2% 异氟烷和氧气的麻醉室中（遵循机构批准的方案）。失去意识后，将小鼠转移至无菌手术区域，保持右侧卧位。通过鼻罩持续给予 2% 异氟烷和氧气以维持麻醉状态。在双眼涂抹眼膏，防止异氟烷麻醉后角膜干燥。去除手术区域的毛发。
    注意：术前一日开始使用每日可咀嚼的卡洛芬片剂作为镇痛药（体重 < 30 克者使用 ¼ 片，体重 30–60 克者使用 ½ 片，体重 > 60 克者使用 1 片）。
  2. 用 2% 氯己定对切口部位进行消毒，随后使用 80% 乙醇再次消毒。通过脚趾夹捏反射确认麻醉深度。使用 手术刀在左上腹部腹壁做 15 mm 切口，随后在腹膜上做 10 mm 切口。
  3. 用镊子轻轻暴露脾脏，并在器官下方放置湿纱布以固定其位置。
  4. 轻轻混匀 AAV8 病毒，使用 30 G 针头在 30 秒内将 50 μL 病毒溶液注入脾脏，针尖插入深度为表面下 3 mm（图 1B）。用棉签覆盖注射部位，并压迫 1 分钟。
  5. 使用 4-0 可吸收缝线缝合腹壁。
  6. 使用 4-0 不可吸收缝线缝合皮肤。
  7. 将小鼠置于清洁笼盒中，放置在电热垫上，持续监测直至恢复意识。
    注意：术后连续三天每日使用可咀嚼卡洛芬片剂作为镇痛药（体重 < 30 克者使用 ¼ 片，体重 30–60 克者使用 ½ 片，体重 > 60 克者使用 1 片）。

3. 门静脉注射 AAV8

  1. 使用异氟烷（2%）与氧气混合吸入法对C57BL6/J小鼠进行麻醉（遵循机构批准的方案）。在双眼涂抹眼用软膏，以防止异氟烷麻醉后眼睛干涩。去除手术区域的毛发。 
    注意：术前一日使用可咀嚼的卡洛芬片剂作为镇痛药（体重 < 30 g 者使用¼片，体重 30–60 g 者使用½片，体重 > 60 g 者使用1片）。
  2. 通过腹部正中切口（约1英寸）切开皮肤，随后切开腹膜，进行剖腹手术4,13。
  3. 将一块浸有无菌生理盐水的无菌纱布垫置于小鼠左侧，并用无菌棉签轻轻拉出大肠和小肠。将肠管放置在湿润的纱布上，并用纱布覆盖，以避免接触皮肤或干燥。
  4. 使用32 G无菌针头向门静脉注射AAV病毒，体积为50 μL。将针头以小于5度的角度插入门静脉内3–5 mm。让血液流过针头5秒，以防止反流。
  5. 将无菌棉签顶端轻压于注射部位，持续施加轻微压力，直至静脉完全闭合且无出血（约5分钟），以防止出血。
  6. 将内脏器官轻柔地放回腹腔内。
  7. 使用4-0可吸收缝线缝合腹壁。然后，使用4-0不可吸收缝线缝合皮肤。
    注意：术后连续三天使用可咀嚼的卡洛芬片剂作为镇痛药（体重 < 30 g 者使用¼片，体重 30–60 g 者使用½片，体重 > 60 g 者使用1片）。

4. qRT-PCR 分析

  1. 从50–100 mg肝组织中提取RNA4,13 使用商品化的RNA提取试剂，按照制造商说明书操作（参见 材料表).
  2. 合成 1st 使用随机六聚体和M-MLV逆转录酶从总RNA合成第一链cDNA20,21.
  3. 确定 Δ使用单色实时PCR检测系统和Supermix SYBR Green试剂，参照先前发表的研究，测定目标基因与参考基因的C(t)值22,23.
  4. 测量 ΔΔ四个生物学重复和三个技术重复的 C(t) 值（n = 12）。设定 Tm 60 时 °所有反应中均为 C。使用两个参考基因验证结果， Rps3 以及 Rplp0.
  5. 设计引物序列如下：Ns，5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' 和 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'；Rps3，5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3' 和 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3'；Rplp0，5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3' 和 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'。

结果

通过脾内注射实现肝脏基因敲低的效率 与门静脉注射 AAV8-shRNA
AAV8 病毒原液被稀释至工作浓度为每毫升 2E+12 基因组拷贝（gc/mL）。每只小鼠注射 1E+11 gc 的 AAV8-shNS1 或 AAV8-shScr50 μL) 通过 脾内或门静脉注射。注射两周后，采集肝组织用于RNA提取，1st-链cDNA合成及qPCR分析。结果显示，脾内注射法获得的NSKD效率（20.8% ± 4.4%）在统计学上与门静脉注射法（16.3% ± 3.6%）相当 Rsp3 和 Rplp0 作为内参（图2更值得注意的是，脾内注射操作可在15分钟内完成，且几乎不会因操作导致动物死亡；而门静脉注射方法通常需要25至30分钟，且需大量练习，其死亡率也较高（约25%–30%）。

组织炎症反应
收集经门静脉注射或脾内注射 AAV8-shScr（图 3A）或 AAV8-shNS1（图 3B）的小鼠肝脏组织，并与对照组小鼠进行比较（图 3C）。通过 H&E 染色检测炎症反应4。结果显示，与经脾内注射（Spl）或门静脉注射（PV）方式注射 PBS 相比，AAV8-shScr 和 AAV8-shNS1 均未在肝实质中引发明显的炎症反应（图 3A-C）。

AV5-siRNA-GFP 质粒设计及 AAV8 病毒小鼠注射方案；包含 qRT-PCR 分析
图1AAV8-shRNA 设计及脾内注射操作示意图 (A) (顶部) 用于制备腺相关病毒8型（AAV8）的AV5-siRNA-GFP质粒示意图 体内 基因敲低实验。AV5-siRNA-GFP 包含由 CMV 启动子驱动的 shRNA 序列和 EGFP。底部) 靶向小鼠 NS 基因上 21 个核苷酸序列的短发夹 RNA 干扰载体（shNS1）或随机排列的 21 个核苷酸序列（Scr）。B) 脾内注射 AAV8 操作流程示意图。C手术步骤的逐步演示。 请点击此处查看此图的放大版本。

柱状图显示来自Spl和PV注射的NS mRNA水平；比较shScr与shNS1处理组。
图2：AAV8-shRNA介导的肝内核仁素（NS）基因敲低效率 通过 脾内 与门静脉注射 在脾内（Spl）或门静脉（PV）注射 AAV8-shScr 或 AAV8-shNS1（1E+11 gc）后2周，采集小鼠肝脏样本，进行 NS 表达的 qRT-PCR 检测。图表结果以两个内参对照 Rps3 为参照A）和 Rplp0（B。柱状图显示四个生物学重复的均值 ± 标准误（SEM），每个生物学重复包含三个 PCR 技术重复；*p < 0.01; **p < 0.001; ***p < 0.0001. 请点击此处以查看此图的放大版本。

肝脏组织学分析，显微镜图像比较脾脏（Spl）和门静脉周围（PV）区域。
图 3：经脾注射或门静脉注射 PBS、AAV8-shScr 或 AAV8-shNS1 后肝脏组织的组织学分析。 经脾注射（Spl）或门静脉注射（PV）AAV8-shScr（A）或 AAV8-shNS1（B）后 2 周的肝脏组织 H&E 染色结果，与未注射 AAV8 的对照样本（C）进行比较。比例尺：100 µm。右侧面板显示左侧面板中插图区域的放大视图。比例尺：50 µm。每组检测了来自两只不同动物的 6 至 9 个切片。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

通过病毒递送shRNA表达载体在野生型背景下进行基因敲低24,25 或在flox背景下的表达Cre重组酶的构建体26 是研究基因功能的一种强大方法 体内 以可诱导、时间可控的方式。一种理想的递送方法为 体内 基因敲除/敲低研究应在目标器官中实现高效的敲除/敲低，并且操作本身应技术简便，围手术期及术后死亡率最低。

对于肝脏等内脏器官，可通过尾静脉27或门静脉28,29注射，或直接注射至脾脏（脾内注射）30,31来导入病毒颗粒。门静脉和脾内注射将病毒颗粒引入门脉循环，该循环先将血液引流至肝脏，再进入下腔静脉，随后进入肺循环。相比之下，通过尾静脉注射导入的病毒颗粒则绕过门脉循环，直接进入肺循环，之后才到达体循环。对于接受门脉循环供血的器官（如肝脏），门静脉和脾内注射的优势在于可将病毒颗粒直接递送至目标器官，避免其在肺部被截留或在体循环中被稀释。而对于不接受门脉循环供血的器官（如脑），尾静脉注射可能更为有利，因其可避免病毒颗粒在进入肺循环及随后的体循环之前先经过肝脏。

在本研究中，我们以每只动物 1E+11 gc 的剂量注射 AAV8-shNS1，其基因敲低效率优于 1E+10 gc 剂量，且达到了与 5E+11 gc 剂量相同的敲低效果 通过 门静脉注射（数据未显示）。在1E+11 gc剂量下，比较门静脉注射与脾内注射方法，两种方法在肝脏中的NSKD效率无统计学差异，均达到70%–80%的KD效率。门静脉注射AAV8在肝脏中的基因沉默效应可持续长达六周，且呈载体构建依赖性23值得注意的是，与门静脉注射法相比，脾内注射法在操作相关并发症（如手术引起的出血和大网膜/腹膜粘连）以及技术难度方面均显著更少且更低。因此，门静脉注射通常仅能进行一次，而脾内注射则可反复进行。32最后，接受门静脉注射或脾内注射AAV8-shScr或AAV8-NS1的肝脏实质中，炎症反应几乎不存在或极轻微。然而，这一发现并不能排除极高滴度的AAV仍可能引发炎症反应，从而干扰实验结果的可能性。因此，最佳AAV剂量需通过实验经验性确定，并在基因敲低效率与AAV8诱导的反应之间取得平衡，且该剂量可能因靶向的不同基因和/或序列而异。综上所述，这些结果表明，通过脾内注射AAV8-shRNA是实现高效、相对安全且操作简便的基因沉默方法 体内 肝脏中的基因敲低

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

这项工作由德克萨斯州癌症预防研究所（CPRIT）个体研究者研究奖（RP200081）资助，授予RYT。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Amicon 滤器离心浓缩管MilliporeSigmaUFC9100快速超滤
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972质粒
感受态 DH5α 大肠杆菌 Invitrogen#18265-017用于克隆的化学感受态菌株 
HpaI 新英格兰生物实验室R0105限制性内切酶
iMFectin 转染试剂 GenDepotI7100-101
M-MLV 逆转录酶 PromegaM1708依赖 RNA 的 DNA 聚合酶 
MyiQ 单色实时荧光定量 PCR 检测系统 Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
Omega 无内毒素质粒提取试剂盒 BioteckD6915-03质粒 DNA 中量制备 
随机六聚体引物 Invitrogen48190-011
Supermix SYBR Green 试剂 Bio-Rad1708882实时荧光定量 PCR 应用
T4 DNA 连接酶PromegaM1801
TRIzol 试剂 Life Technologies15596-018高质量总 RNA 提取
XhoI新英格兰生物实验室R0146限制性内切酶

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AAV8 Nucleostemin RNA
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