本文建立了一种利用少量新鲜冷冻脑组织切片的实验方案，结合常规高速离心法与尺寸排阻色谱技术，以获取小细胞外囊泡作为神经系统疾病微小RNA（miRNA）生物标志物的来源。
本文内容
摘要
摘要
小细胞外囊泡（sEVs）是细胞间通讯的重要介质，可转运多种分子货物，包括蛋白质、脂质以及核酸（如微小RNA、mRNA、DNA）。由于sEV能够穿越生物屏障（例如血脑屏障），并可通过多种体液获取，其携带的微小RNA货物在作为强效的无创疾病生物标志物方面具有巨大潜力。尽管已有大量关于体液中sEV生物标志物的研究，但识别组织或细胞特异性的sEV亚群仍然具有挑战性，尤其是来源于脑组织的sEV。本研究通过改进现有方法，采用尺寸排阻色谱法（SEC），从少量冷冻的人脑组织切片中分离sEV，以应对这一挑战。
在获得伦理批准后，从3名供体组织中切取约250 µg新鲜冷冻的人类脑组织（来源于曼彻斯特脑库[英国]），在胶原酶3型/Hibernate-E溶液中孵育，并进行间歇性振荡，随后依次进行离心和过滤步骤。然后，采用尺寸排阻色谱法（SEC）分离小细胞外囊泡（sEVs），并依据MISEV指南对其进行表征。在从这些sEVs中提取RNA之前，溶液经蛋白酶K和RNase-A处理，以去除所有非sEV来源的细胞外RNA。检测RNA的浓度和质量后，进一步用于qPCR和小RNA测序实验。
通过荧光纳米颗粒追踪分析（fNTA）和表面标志物（CD9、CD63、CD81）的蛋白质印迹法确认了sEVs的存在。通过NTA和电子显微镜确认了其大小分布（50–200 nm）。裂解sEVs中的总RNA浓度范围为3–9 ng/µL，并成功用于选定候选microRNA的qPCR定量。在MiSeq上进行的小RNA测序提供了高质量数据（Q >32），每个样本获得140万至500万条读长。
该方法能够从极少量脑组织样本中高效分离和表征小细胞外囊泡（sEVs），有助于无创生物标志物研究，并有望推动公平的疾病生物标志物研究，为神经退行性疾病及其他潜在疾病的机制提供 insights。
引言
细胞外囊泡（EVs）是所有多细胞生物中细胞间通讯的关键介质之一1。EVs 是由细胞释放的具有脂质双分子层膜结构的颗粒，能够将多种分子货物（如蛋白质、脂质和核酸）传递至受体细胞。EVs 的大小范围较广，直径可从 30 nm 到 1 µm。小细胞外囊泡（sEVs）是指脂质包裹、平均直径<200 nm 的囊泡，能够穿越血脑屏障；因此，它们被认为参与了朊病毒样扩散并加剧神经退行性疾病及其他疾病，如阿尔茨海默病（AD）、额颞叶痴呆（FTD）、帕金森病（PD）和癌症2,3。此外，由于 sEVs 可在多种生物液体中被检测到，例如血液、脑脊液（CSF）、唾液甚至尿液，其在生物标志物和无创诊断领域的应用前景广泛。例如，阿尔茨海默病的研究可能聚焦于生物液体中致病蛋白的比例，如 tau/Aβ，甚至 Aβ42/Aβ404。
已知的sEVs运载物之一是微小RNA（miRNA），这是一类长度约为22个核苷酸的小分子非编码RNA，可结合mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR），通常负向调控蛋白质表达。miRNA参与多种细胞功能，也已被证实与多种疾病（包括癌症和神经退行性疾病）的发病机制相关。Cheng等人对阿尔茨海默病（AD）患者血清来源的sEV中miRNA表达谱进行了高通量测序分析5。当结合神经影像学记录以及年龄、性别和APOE ε4等位基因携带等已知风险因素时，该方法预测AD的敏感性达87%，特异性达77%。此外，研究已鉴定出两种在脑脊液（CSF）中表达上调的miRNA（miR-151a-3p、let-7f-5p）和三种表达下调的miRNA（miR-27a-3p、miR-125a-5p和miR-423-5p），这些miRNA有望用于帕金森病（PD）早期阶段的诊断6。在病理状态下，病理变化往往早于某些典型临床症状的出现；而在神经退行性病变中，病理标志物的积累远早于认知功能的下降。
microRNA 作为生物标志物可能比蛋白质更具优势，这归因于其多样的功能以及更高层次的表观遗传调控作用。利用脑组织，研究人员有望识别出特定来源于脑组织的小细胞外囊泡（BDsEV）的 microRNA 特征谱，用于疾病及其亚型的鉴定。例如，携带神经元和胶质细胞标志物的小细胞外囊泡可能携带不同的 microRNA 内容物，对其分析有助于开发更精确的疾病检测方法。此外，研究表明，脑源性小细胞外囊泡在神经病理蛋白的跨突触传播中可能发挥重要作用。7既往研究报道，可通过免疫沉淀结合密度梯度（蔗糖梯度）超速离心法从新鲜冷冻脑组织中分离小细胞外囊泡（sEVs）。8,9然而，这些方法需要配备超速离心机及下游纯化手段的特定基础设施，才能获得高质量的小细胞外囊泡（sEV）样本10最近的报告提出对该方法的若干修改与改进11,12,13；然而，尽管如此，从人类组织中分离和研究sEV来源的microRNA仍未得到广泛应用。本方案所描述的方法旨在提供一套优化的、逐步操作的脑源性sEV研究流程，以提高该技术的可及性。我们建立了一种使用最少样本量的方案 脑组织的量，从中我们 使用尺寸排阻色谱法分离纯化sEVs，并展示来自微小RNA的高质量下一代测序数据 这些sEVs的 cargo。
方案
该项工作已获得曼彻斯特脑库（伦理审查委员会编号：09/H0906/52）以及索尔福德大学伦理委员会（申请编号：3408）的伦理批准。
1. 使用胶原酶降解冷冻脑组织切片中的细胞内基质
- 在冷板上使用无菌手术刀将250 mg冷冻脑组织切成薄片（约0.4 mm厚的碎片），并加入2 mL 75 U/mL III型胶原酶/Hibernate-E溶液。
- 将每个样品在37 °C水浴中孵育20 min。在5 min时，将每个样品倒置混匀两次；在10 min时，使用10 mL塑料一次性移液管轻轻吹打每个样品三次。
- 将每个样品置于冰上，并加入1×蛋白酶抑制剂混合物和1×磷酸酶抑制剂。此步骤可终止酶反应，标志着III型胶原酶消化的终点。
- 在4 °C条件下，以300x g离心每个脑组织样品10 min。收集各上清液后，再于4 °C以2000 x g离心15 min。
- 再次收集各上清液，并通过0.22 µm滤膜过滤。将各滤液在4 °C以10 000 x g离心48 min。
- 收集上清液，并按2:1的比例向每个样品中加入沉淀缓冲液。在4 °C孵育过夜。
- 在4 °C以10 000 x g离心每个样品96 min，然后将沉淀重悬于100 µL无细胞外囊泡（EV）的PBS中。
2. 尺寸排阻色谱柱的制备
- 使用前，将预装好的SEC柱在室温（RT）下平衡15分钟。
注意：必须先取下底部盖帽，再取下螺旋盖。 - 平衡后，移除柱顶部的防腐缓冲液，并用250 µL无EV的PBS洗涤柱两次。每次PBS洗涤液均依靠重力自然流入柱中。
3. 使用尺寸排阻色谱法分离小细胞外囊泡
- 将重悬的沉淀物加至SEC柱顶部，以50 × g 离心30秒，弃去穿流液。
- 向SEC柱顶部加入180 µL无EV的PBS，以50 × g 离心1分钟，使脑源性sEV从柱中洗脱。
注意：上述实验步骤的详细内容总结于图1中。
4. 通过蛋白质印迹法确认小型细胞外囊泡标志物
- 在进行蛋白质印迹分析之前，为裂解sEVs（确保分析所有膜和胞质内容物），将分离的sEV样品用裂解与提取缓冲液按1:1比例稀释（含1×蛋白酶抑制剂和1×磷酸酶抑制剂）。
- 在4 °C条件下振荡孵育样品30分钟。
- 在14 000 × g 条件下离心15分钟。
- 收集蛋白上清液，并使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
- 将样品与4× Laemmli缓冲液混合，每孔上样20 µg蛋白，同时使用预染蛋白Marker作为对照。
- 电泳完成后，将蛋白转移至0.45 µm硝酸纤维素膜。转移后，用5% BSA封闭膜2小时。
- 将膜与一抗（表1）在4°C孵育过夜。
- 用洗涤缓冲液（含1% Tween20的PBS）洗涤膜三次，然后使用抗小鼠二抗进行染色。染色后再次用洗涤缓冲液（含1% Tween20的PBS）洗涤三次。
- 成像前，请遵循文稿中上述步骤操作。
- 使用辣根过氧化物酶（HRP）底物进行成像。
5. 通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）确认小型细胞外囊泡
- 采用纳米颗粒追踪分析（NTA）检测样品中所有颗粒的浓度和粒径。将每个样品用 PBS 按 1:1000 的稀释倍数进行稀释后进行分析。
- 将样品注入 NTA 仪器，并在 550 nm 波长下读取样品。在此步骤中，根据 MISEV 指南建议，利用颗粒数量测定每个颗粒所含蛋白量（通常以飞克表示）。
- 接下来进行荧光 NTA 分析时，先将细胞膜橙染料（CMO，可标记样品中所有生物来源颗粒）用 PBS 按 1:1000 的比例稀释；再用 sEV 样品将 CMO 染料进一步按 1:10 的比例稀释，并在 4 °C 条件下避光孵育 30 分钟。
- 使用 PBS 将第二次 CMO 稀释液再按 1:1000 的比例稀释。
注意：CMO 染料的最终稀释倍数必须为 1:10 000 000。 - 使用 NTA 仪器在 550 nm 波长下读取各 sEV 样品的 CMO 荧光信号。
- 对于四跨膜蛋白荧光抗体（见材料表），首先将每种特异性抗体用 PBS 按 1:10 的比例稀释；再用 sEV 样品将各抗体染料按 1:10 的比例稀释，并在 4 °C 条件下避光孵育 2 小时。
- 使用 PBS 将第二次抗体稀释液再按 1:1000 的比例稀释。
注意：每种四跨膜蛋白抗体的最终稀释倍数必须为 1:100 000。 - 使用 NTA 仪器在 550 nm 波长下读取 sEV 样品的荧光抗体信号。
6. 通过透射电子显微镜（TEM）确认小型细胞外囊泡
注意：本方案由利物浦大学生物医学显微技术平台完成。
- 首先，使用戊二醛固定sEV样品，并用醋酸铀染色。
- 通过梯度酒精系列对样品进行脱水，以备透射电子显微镜（TEM）观察。
- 使用合适的透射电子显微镜对样品进行成像。
7. 蛋白酶K和RNase A处理
- 向50 µL分离的脑源性sEVs中加入1 µL浓度为20 µg/µL的蛋白酶K，在37 °C孵育30分钟。
- 每管加入1×蛋白酶抑制剂混合液以终止反应，冰上孵育10分钟。
- 孵育结束后，向每个样品中加入1 µL浓度为10 µg/µL的RNase A，继续在37 °C孵育30分钟。
注意：立即进入第8节操作。
8. 从小细胞外囊泡中分离总RNA
- 为了分离总 RNA，向 50 µL 脑源性 EV (BDsEV) 样品中加入 700 µL 高质量 RNA 回收裂解试剂。每份样品振荡 1 小时。
- 加入 140 µL 氯仿，每份样品剧烈振荡 20 秒，室温孵育 3 分钟。
- 在 4 °C 条件下以 12 000 xg 离心 15 分钟，收集样品的中间相。加入 1.5 倍体积的 100% 乙醇。
- 将 700 µL 中间相/乙醇混合液加入 RNA 分离柱中，在室温下以 ≥8000 xg 离心 15 秒。
注意：使用所有中间相/乙醇样品重复此步骤。 - 向柱中加入 700 µL 洗涤缓冲液，并在 ≥8000 xg 条件下离心 15 秒。弃去穿流液。
- 加入 500 µL RPE 缓冲液，再次在 ≥8000 xg 条件下离心 15 秒。弃去穿流液。
- 加入 500 µL 80% 乙醇，在 ≥8000 xg 条件下离心 2 分钟。弃去穿流液。
- 此时，将柱子开盖以全速（>8000 xg）离心 5 分钟，干燥柱膜。
- 将柱子转移至新的收集管中，直接向柱膜加入 14 µL 无 RNase 水，并在 ≥8000 xg 条件下离心 1 分钟，以洗脱 BDsEVs 中的总 RNA。
- 使用 miRNA 定量检测试剂盒对样品中的总 microRNA 进行定量，选择 miRNA 检测类型，在定量荧光仪上测定样品。
9. 小RNA测序
- 在对样本中的miRNA进行定量后，使用Small RNA-Seq文库构建试剂盒合成cDNA文库。
注意：根据本方案，文库构建包括四个步骤：3'接头连接、纯化、5'接头连接和逆转录，最终形成RNA/cDNA文库。文库构建完成后，使用添加的索引引物进行终点PCR扩增（用于多重测序），随后对样本进行纯化。 - 为检测RNA质量，使用质量控制应用检测方法，分析每次制备产物的片段大小及峰强度。
- 为检测DNA浓度，使用定量荧光仪测定DNA含量，并选择双链DNA（dsDNA）检测模式。
- 使用试剂盒准备Small RNA测序样本，随后将样本加载至流动池中。
结果
为确认BDsEVs的存在，采用了三种技术：蛋白质印迹、NTA和TEM（图3）。蛋白质印迹结果（图3A和补充文件1）显示，sEVs中存在全部五种阳性标志物（CD9、CD63、CD81、Flot-1和TSG101），且不存在Calnexin（作为阴性对照），表明无细胞内容物污染。如预期所示，脑组织匀浆（BH）中检测到的上述标志物蛋白量高于sEVs。透射电镜图像证实了BDsEVs的形态及其在样品中的相对大小（图3B），该结果进一步通过纳米颗粒追踪分析得到验证（图3C）。
图3C（上图）显示分离的颗粒大小在50-200 nm之间。根据NTA数据，以散射结果作为代表颗粒的100%，CMO标记的颗粒中约有52.35%具有脂质双层结构（图3C，下图）。在这些CMO染色的颗粒中，34.66%含有CD9，15.49%含有CD63，12.01%含有CD81。NTA对照数据详见补充文件2。
分离RNA的定量数据（表2）显示其浓度范围为3.24–8.76 ng/µL，这些数值在构建cDNA文库时已进行归一化处理。TapeStation检测结果（图4）显示主峰位于约120–160 bp，此外在约50 bp处有较小的低峰，在约484 bp处有其他较小的高峰。
下一代测序数据的质量检测显示，经过接头修剪后，测序读段质量非常高（图 5A）。所有序列位点的Phred值均达到 >30，表明每1000个核苷酸中的错误率低于1个。 图 5B 显示大多数序列长度约为21–22 bp，符合microRNA的预期大小范围。通过进一步的下游比对分析（使用BowTie2）及Samtools flagstat分析工具，在1,304,100条比对序列中，有1,116,264条（85%）比对至人类基因组（hg38版本）的microRNA区域。 表3).
在全部miRNA中，有808种miRNA在所有3个样本中均有表达，其中344种miRNA在三个样本间共有（约占43%），5种在对照1和对照2之间共有，183种在对照1和对照3之间共有，16种在对照2和对照3之间共有（图6）。根据该数据，在所有三个BDsEVs样本中表达量最高的miRNA为hsa-let-7b-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-221-3p和hsa-let-7i-5p。同样，在BDsEVs样本中差异表达最小的前5种miRNA（reads >10）为hsa-miR-128-2-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-448和hsa-miR-505-3p。所有原始及标准化后的读数均列于补充文件3中。
图 1：组织处理流程图。 该图展示了利用尺寸排阻色谱法从新鲜冷冻脑组织切片中分离脑源性小细胞外囊泡（BDsEVs）的逐步操作流程。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：来自BDsEVs的RNA分离流程。 该图展示了从小鼠BDsEVs中分离总RNA的逐步流程，包括使用蛋白酶K和RNase A去除任何细胞外RNA的预处理步骤。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：BDsEV表征工作流程。 该图展示了用于表征BDsEV的多种方法。（A）蛋白质印迹法检测sEV特异性蛋白标志物。BH为脑组织匀浆液。Calnexin作为sEV的阴性对照——其在sEV中不存在而在BH中存在，表明sEV样本纯度较高。对于其他标志物，如预期所示，蛋白含量在BH中高于sEV样本（每孔上样20 µg蛋白）。（B）BDsEV的代表性透射电子显微镜（TEM）图像（标尺为200 µM），显示其具有脂质双分子层膜的典型形态。（C）纳米颗粒跟踪分析（NTA）的粒径分布图（上图）。每个数据点代表三次重复实验之间的变异。生物颗粒（sEVs）的归一化比例及特定表面标志物的相对比例（下图）（数据以三次重复孔的均值±标准误表示（n = 3））。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：cDNA文库构建的质量检测。 cDNA文库构建后对各个样品进行的TapeStation分析。各图中显示的峰代表每份样品文库的片段大小（横轴，单位为bp）及其对应的峰强度（纵轴，FU）。预期的小RNA文库峰位于120–160 bp左右，如图所示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：miRnome 测序的质量检测。（A）各样本在接头序列切除后的读段质量 FASTQC 图。横轴表示核苷酸位置，纵轴表示 Phred 得分。每个位置的箱线图显示了该位置所有读段 Phred 得分的分布情况。所有位于绿色区域内的分布均表明数据质量非常高（>Q30），提示样本制备质量良好。（B）各样本的序列长度分布显示，三个样本中大多数读段长度集中在 21–22 个核苷酸左右，符合 microRNA 的预期大小范围。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：所有样本间microRNA表达的重叠情况。 维恩图展示了从每个样本中检测到的miRNA数量（读段数 ≥ 10）以及在多个样本中共同存在的特定microRNA。所有原始读段和标准化后的读段数据见补充文件3。请点击此处查看该图的放大版本。
| 抗体表位 | 抗体稀释倍数 |
| Mouse Anti-CD9 | 1:2000 |
| Mouse Anti-CD63 | 1:2000 |
| Mouse Anti-CD81 | 1:2000 |
| Mouse Anti-Flotillin 1 | 1:2000 |
| Mouse Anti-TSG101 | 1:1000 |
| Mouse Anti-Calnexin | 1:10 000 |
| Anti-mouse Secondary Antibody | 1:3000 |
表1：用于BDsEVs表征的抗体表位及其相应的稀释倍数。
| 样品 | miRNA 浓度 (ng/μL) |
| 1 | 8.76 |
| 2 | 3.24 |
| 3 | 5.33 |
表2：分离RNA的定量数据。
| 样本 | 比对序列数 | 比对到的miRNA | 百分比 (%) |
| 对照样本 1 | 1 444 665 | 1 133 437 | 78.46 |
| 对照样本 2 | 442 808 | 381 631 | 86.18 |
| 对照样本 3 | 2 024 828 | 1 983 726 | 97.97 |
| 平均值 | 1 304 100.33 | 1 166 264.67 | 89.43 |
表3：比对成功且有效定位的miRNA序列数量。
补充文件1：补充的蛋白质印迹分析数据。 请点击此处下载该文件。
补充文件 2：NTA 对照实验的补充数据。 请点击此处下载该文件。
补充文件 3：miRNA 表达分析的原始和标准化读数计数。 请点击此处下载该文件。
补充文件4：补充蛋白质浓度数据。 请点击此处下载该文件。
讨论
此改良并优化的实验方案 分离脑源性小细胞外囊泡及其microRNA cargo 展示了使用最小量的可行性 组织质量不受影响 下游产物的数量。 在生物标志物发现领域，识别特定于细胞和组织类型的分子标识物，可为利用体液进行无创诊断检测提供更便捷的手段。此外，本文所述方法为识别不同细胞类型（神经元与胶质细胞）、组织类型（海马组织与前额叶皮层组织）以及生物体液中特定的小细胞外囊泡（sEV）亚群提供了框架，这将有助于更深入理解其内容物装载特征、病理生理机制及疾病范围。Vella 等人先前指出，用于BD-sEV分离的起始材料应使用450 mg至1 g，并结合密度梯度超速离心法（转速可达180,000 x g)8在此方法中，已成功使用较低用量（>50%）的新鲜冷冻脑组织样本（250–450 mg）。减少用于分离sEVs的脑组织用量可降低实验成本和耗材消耗。同样，通过结合尺寸排阻色谱（SEC）与高速离心（10,000 × g）而非超速离心（180,000 x g).
使用fNTA和TEM，我们确定sEVs的粒径分布范围符合MISEV指南推荐的典型30-200 nm粒径范围。13,14，透射电镜（TEM）提供了所获得的小细胞外囊泡（sEVs）的形态学确认。如图所示 图3C 以及在 补充文件 4, >87%的颗粒为 <250 nm 尺寸范围内，样品平均显示为 10.56 fg 蛋白质/BDsEV。特定类型的小细胞外囊泡在大小和形态上存在差异，其中特征性较小的亚群（如外泌体）通常表现出较为均一的形态，而微囊泡由于其生物发生方式的特性，通常具有不规则结构。15对于fNTA，通过520 nm散射读数分析样品中的总颗粒，提供颗粒大小分布和浓度的详细信息。读数显示，超过50%的颗粒为生物来源（通过CMO染色确认），其中具有四跨膜蛋白标志物（如CD9）且大小在sEVs范围内的生物颗粒占主要比例，在对照样品中CD9阳性颗粒占比最高（34.66%）。而对于Western blotting，其检测结果显示 特征性膜和胞质 提供的蛋白质货物为sEV提供了证据 存在，且无Calnexin 证实BDsEVs不含任何细胞成分 污染。 为了进一步确保可用于下游处理的miRNA属于sEV的运载物（而非其他细胞外RNA），我们在裂解sEV膜之前，用蛋白酶K和RNase A处理sEV，以降解BD-sEVs外部胞外空间中可能存在的任何蛋白质和RNA。16.
从小细胞外囊泡（sEVs）中提取总RNA，并用于后续实验，如qRT-PCR和小RNA的高通量测序。通过质量控制检测进行的标准评估显示，样品质量高，cDNA文库符合测序要求。cDNA文库主峰位于约120-160 bp，对应于带有不同长度接头序列的miRNA来源cDNA峰，较小的峰可能代表接头二聚体。
使用FASTQC和CutAdapt对下一代测序数据进行分析，结果显示从BDsEV miRNA获得的数据质量较高。如图5所示，每个位置的测序读长Q值均高于30（Q30），对应的错误概率为0.001–0.0001（即1/1000至1/10,000）。此外，序列长度分布分析（图6）显示主要峰位于miRNA的特征长度范围（19–25 bp）内，表明所获得数据具有高质量和高特异性。
由于该方法提高了可及性，并通过减少组织样本用量以及节省试剂成本，节约了成本和资源，因此众多未来的研究将从中受益。所需组织量的减少（>50%）也使该方法更具伦理优势。该方法与全球精准健康的努力相一致，所详述的优化流程提供了更具可比性的经济工具，可通过BD-sEVs及其携带物以无创或微创方式启动针对特定细胞类型的准确生物标志物研究。该方法可用于多种神经系统疾病。该方法的一个潜在局限性在于，如果研究人员希望使用人脑以外的组织进行sEV分离，则需要对该方案进行调整。从长远来看，这一改进后的方法将使无创、组织特异性的生物标志物发现与验证在全球范围内更加公平和可及。
披露
所有作者均无利益冲突。
致谢
本工作由英国阿尔茨海默病协会（资助号 549/SERA-52）为约瑟夫·摩根（Joseph Morgan）提供的博士生奖学金以及索尔福德大学创新战略基金（资助号 SEFA-39）资助。脑组织来自痴呆症研究网络的曼彻斯特脑库（伦理审查委员会编号 09/H0906/52）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 | Merck | A9418-100G | |
| Cell Mask Orange 细胞膜染料 | ThermoFisher Scientific | C10045 | |
| III型胶原酶 | StemCell Technologies | 07422 | |
| ExoSpin 柱和缓冲液 | Cell Guidance Systems Ltd. | EX01-50 | 该试剂盒包含本实验所用的尺寸排阻色谱柱（SEC柱）、沉淀缓冲液和无细胞外囊泡的PBS缓冲液。 |
| Halt 蛋白酶抑制剂混合物（100倍浓缩液） | ThermoFisher Scientific | 78429 | |
| Hibernate-E 培养基 | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Laemmli 样品缓冲液（4倍浓缩液） | BioRad | 1610747 | |
| Lexogen 小RNA测序文库构建试剂盒 | Lexogen | 052.24 | 该试剂盒包含小RNA制备试剂盒及i7索引引物板。 |
| miRNeasy Micro 试剂盒（50次） | Qiagen | 217084 | 该试剂盒包含高质量RNA提取裂解液（Qiazol）、RNA纯化柱、纯化缓冲液（RWT、RPE）和无RNase水。 |
| MiSeq 试剂盒 v3 | Illumina | MS-102-3001 | 这是Illumina文库制备试剂盒 |
| 硝酸纤维素膜，0.45 μm | ThermoFisher Scientific | 88018 | |
| PE/Dazzle 594 抗人CD63抗体 | BioLegend | 143914 | 用于fNTA分析 |
| PE/Dazzle 594 抗人CD81抗体 | BioLegend | 349520 | 用于fNTA分析 |
| PE/Dazzle 594 抗人CD9抗体 | BioLegend | 312118 | 用于fNTA分析 |
| PhosSTOP | Merck | 4906845001 | |
| Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| 蛋白酶K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | |
| Qubit microRNA 检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | Q32880 | |
| Qubit 1X dsDNA HS 检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit 3.0 荧光计 | ThermoFisher Scientific | Q33216 | |
| RIPA 裂解和提取缓冲液 | ThermoFisher Scientific | 89901 | |
| RNase A | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| SuperSignal West Femto 高灵敏度化学发光底物 | ThermoFisher Scientific | 34094 |
参考文献
- Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
- Fornari, S., Schäfer, A., Jucker, M., Goriely, A., Kuhl, E. Prion-like spreading of Alzheimer's disease within the brain's connectome. J R Soc Interface. 16 (159), 20190356(2019).
- Zhang, P., et al. Tumor-derived small extracellular vesicles in cancer invasion and metastasis: molecular mechanisms, and clinical significance. Mol Cancer. 23 (1), 18(2024).
- Constantinides, V., et al. CSF Aβ42 and Aβ42/ Aβ40 ratio in Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Diagnostics. 13 (4), 783(2023).
- Cheng, L., et al. Prognostic serum miRNA biomarkers associated with Alzheimer's disease shows concordance with neuropsychological and neuroimaging assessment. Mol Psychiatry. 20 (10), 1188-1196 (2015).
- Roser, A. E., Caldi Gomes, L., Schünemann, J., Maass, F., Lingor, P. Circulating miRNAs as diagnostic biomarkers for Parkinson's disease. Front Neurosci. 12, 625(2018).
- Jackson, N., Guerrero-Muñoz, M. J., Castillo-Carranza, D. L. The prion-like transmission of tau oligomers via exosomes. Front Aging Neurosci. 14, 974414(2022).
- Vella, L., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
- Yousif, G., Qadri, S., Parray, A., Akhthar, N., Shuaib, A., Haik, Y. Exosomes derived neuronal markers: Immunoaffinity isolation and characterization. Neuromolecular Med. 24 (3), 339-351 (2022).
- Kumar, K., et al. Recent advances in microfluidic approaches for the isolation and detection of exosomes. TRAC-Trend Anal Chem. 159, 116912(2023).
- Ransom, L., et al. Human brain small extracellular vesicles contain selectively packaged, full-length mRNA. Cell Rep. 43 (4), 114061(2024).
- Gomes, P., et al. A novel isolation method for spontaneously released extracellular vesicles from brain tissue and its implication for stress-driven brain pathology. Cell Commun Signal. 21 (1), 35(2023).
- Welsh, J., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV 2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2023).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
- Pirisinu, M. The long journey of extracellular vesicles towards global scientific acclamation. Adv Pharm Bull. 13 (3), 489-501 (2023).
- Bender, A., Sullivan, B. P., Lillis, L., Posner, J. D. Enzymatic and chemical-based methods to inactivate endogenous blood ribonucleases for nucleic acid diagnostics. J Mol Diagn. 22 (8), 1030-1040 (2020).
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