利用新鲜冷冻人脑组织切片释放的小细胞外囊泡中的microRNA cargo

摘要

本文建立了一种利用少量新鲜冷冻脑组织切片的实验方案，结合常规高速离心法与尺寸排阻色谱技术，以获取小细胞外囊泡作为神经系统疾病微小RNA（miRNA）生物标志物的来源。

摘要

小细胞外囊泡（sEVs）是细胞间通讯的重要介质，可转运多种分子货物，包括蛋白质、脂质以及核酸（如微小RNA、mRNA、DNA）。由于sEV能够穿越生物屏障（例如血脑屏障），并可通过多种体液获取，其携带的微小RNA货物在作为强效的无创疾病生物标志物方面具有巨大潜力。尽管已有大量关于体液中sEV生物标志物的研究，但识别组织或细胞特异性的sEV亚群仍然具有挑战性，尤其是来源于脑组织的sEV。本研究通过改进现有方法，采用尺寸排阻色谱法（SEC），从少量冷冻的人脑组织切片中分离sEV，以应对这一挑战。

在获得伦理批准后，从3名供体组织中切取约250 µg新鲜冷冻的人类脑组织（来源于曼彻斯特脑库[英国]），在胶原酶3型/Hibernate-E溶液中孵育，并进行间歇性振荡，随后依次进行离心和过滤步骤。然后，采用尺寸排阻色谱法（SEC）分离小细胞外囊泡（sEVs），并依据MISEV指南对其进行表征。在从这些sEVs中提取RNA之前，溶液经蛋白酶K和RNase-A处理，以去除所有非sEV来源的细胞外RNA。检测RNA的浓度和质量后，进一步用于qPCR和小RNA测序实验。

通过荧光纳米颗粒追踪分析（fNTA）和表面标志物（CD9、CD63、CD81）的蛋白质印迹法确认了sEVs的存在。通过NTA和电子显微镜确认了其大小分布（50–200 nm）。裂解sEVs中的总RNA浓度范围为3–9 ng/µL，并成功用于选定候选microRNA的qPCR定量。在MiSeq上进行的小RNA测序提供了高质量数据（Q >32），每个样本获得140万至500万条读长。

该方法能够从极少量脑组织样本中高效分离和表征小细胞外囊泡（sEVs），有助于无创生物标志物研究，并有望推动公平的疾病生物标志物研究，为神经退行性疾病及其他潜在疾病的机制提供 insights。

引言

细胞外囊泡（EVs）是所有多细胞生物中细胞间通讯的关键介质之一¹。EVs 是由细胞释放的具有脂质双分子层膜结构的颗粒，能够将多种分子货物（如蛋白质、脂质和核酸）传递至受体细胞。EVs 的大小范围较广，直径可从 30 nm 到 1 µm。小细胞外囊泡（sEVs）是指脂质包裹、平均直径<200 nm 的囊泡，能够穿越血脑屏障；因此，它们被认为参与了朊病毒样扩散并加剧神经退行性疾病及其他疾病，如阿尔茨海默病（AD）、额颞叶痴呆（FTD）、帕金森病（PD）和癌症^2,3。此外，由于 sEVs 可在多种生物液体中被检测到，例如血液、脑脊液（CSF）、唾液甚至尿液，其在生物标志物和无创诊断领域的应用前景广泛。例如，阿尔茨海默病的研究可能聚焦于生物液体中致病蛋白的比例，如 tau/Aβ，甚至 Aβ₄₂/Aβ₄₀⁴。

已知的sEVs运载物之一是微小RNA（miRNA），这是一类长度约为22个核苷酸的小分子非编码RNA，可结合mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR），通常负向调控蛋白质表达。miRNA参与多种细胞功能，也已被证实与多种疾病（包括癌症和神经退行性疾病）的发病机制相关。Cheng等人对阿尔茨海默病（AD）患者血清来源的sE....

方案

该项工作已获得曼彻斯特脑库（伦理审查委员会编号：09/H0906/52）以及索尔福德大学伦理委员会（申请编号：3408）的伦理批准。

1. 使用胶原酶降解冷冻脑组织切片中的细胞内基质

1. 在冷板上使用无菌手术刀将250 mg冷冻脑组织切成薄片（约0.4 mm厚的碎片），并加入2 mL 75 U/mL III型胶原酶/Hibernate-E溶液。
2. 将每个样品在37 °C水浴中孵育20 min。在5 min时，将每个样品倒置混匀两次；在10 min时，使用10 mL塑料一次性移液管轻轻吹打每个样品三次。
3. 将每个样品置于冰上，并加入1×蛋白酶抑制剂混合物和1×磷酸酶抑制剂。此步骤可终止酶反应，标志着III型胶原酶消化的终点。
4. 在4 °C条件下，以300x g离心每个脑组织样品10 min。收集各上清液后，再于4 °C以2000 x g离心15 min。
5. 再次收集各上清液，并通过0.22 µm滤膜过滤。将各滤液在4 °C以10 000 x g离心48 min。
6. 收集上清液，并按2:1的比例向每个样品中加入沉淀缓冲液。在4 °C孵育过夜。
7. 在4 °C以10 000 x g离心每个样品96 min，然后将沉淀重悬于100 µL无细胞外囊泡（EV）....

结果

为确认BDsEVs的存在，采用了三种技术：蛋白质印迹、NTA和TEM（图3）。蛋白质印迹结果（图3A和补充文件1）显示，sEVs中存在全部五种阳性标志物（CD9、CD63、CD81、Flot-1和TSG101），且不存在Calnexin（作为阴性对照），表明无细胞内容物污染。如预期所示，脑组织匀浆（BH）中检测到的上述标志物蛋白量高于sEVs。透射电镜图像证实了BDsEVs的形态及其在样品中的相对大小（图3B），该结果进一步通过纳米颗粒追踪分析得到验证（图3C）。

图3C（上图）显示分离的颗粒大小在50-200 nm之间。根据NTA数据，以散射结果作为代表颗粒的100%，CMO标记的颗粒中约有52.35%具有脂质双层结构（

讨论

此改良并优化的实验方案 分离脑源性小细胞外囊泡及其microRNA cargo 展示了使用最小量的可行性 组织质量不受影响 下游产物的数量。 在生物标志物发现领域，识别特定于细胞和组织类型的分子标识物，可为利用体液进行无创诊断检测提供更便捷的手段。此外，本文所述方法为识别不同细胞类型（神经元与胶质细胞）、组织类型（海马组织与前额叶皮层组织）以及生物体液中特定的小细胞外囊泡（sEV）亚群提供了框架，这将有助于更深入理解其内容物装载特征、病理生理机制及疾病范围。Vella 等人先前指出，用于BD-sEV分离的起始材料应使用450 mg至1 g，并结合密度梯度超速离心法（转速可达180,000 x g)⁸在此方法中，已成功使用较低用量（>50%）的新鲜冷冻脑组织样本（250–450 mg）。减少用于分离sEVs的脑组织用量可降低实验成本和耗材消耗。同样，通过结合尺寸排阻色谱（SEC）与高速离心（10,000 × g）而非超速离心（180,000 x g).

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	Merck	A9418-100G
Cell Mask Orange 细胞膜染料	ThermoFisher Scientific	C10045
III型胶原酶	StemCell Technologies	07422
ExoSpin 柱和缓冲液	Cell Guidance Systems Ltd.	EX01-50	该试剂盒包含本实验所用的尺寸排阻色谱柱（SEC柱）、沉淀缓冲液和无细胞外囊泡的PBS缓冲液。
Halt 蛋白酶抑制剂混合物（100倍浓缩液）	ThermoFisher Scientific	78429
Hibernate-E 培养基	ThermoFisher Scientific	A1247601
Laemmli 样品缓冲液（4倍浓缩液）	BioRad	1610747
Lexogen 小RNA测序文库构建试剂盒	Lexogen	052.24	该试剂盒包含小RNA制备试剂盒及i7索引引物板。
miRNeasy Micro 试剂盒（50次）	Qiagen	217084	该试剂盒包含高质量RNA提取裂解液（Qiazol）、RNA纯化柱、纯化缓冲液（RWT、RPE）和无RNase水。
MiSeq 试剂盒 v3	Illumina	MS-102-3001	这是Illumina文库制备试剂盒
硝酸纤维素膜，0.45 μm	ThermoFisher Scientific	88018
PE/Dazzle 594 抗人CD63抗体	BioLegend	143914	用于fNTA分析
PE/Dazzle 594 抗人CD81抗体	BioLegend	349520	用于fNTA分析
PE/Dazzle 594 抗人CD9抗体	BioLegend	312118	用于fNTA分析
PhosSTOP	Merck	4906845001
Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	23225
蛋白酶K	ThermoFisher Scientific	25530049
Qubit microRNA 检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	Q32880
Qubit 1X dsDNA HS 检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit 3.0 荧光计	ThermoFisher Scientific	Q33216
RIPA 裂解和提取缓冲液	ThermoFisher Scientific	89901
RNase A	ThermoFisher Scientific	EN0531
SuperSignal West Femto 高灵敏度化学发光底物	ThermoFisher Scientific	34094