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利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物介导的基因敲除研究小鼠CD4 T细胞分化

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DOI：

10.3791/67380

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2025年6月20日

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

本文内容

摘要

我们概述了一种高度可调的方法，利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物介导的基因敲除技术，在小鼠初始CD4 T细胞中研究基因在CD4 T细胞分化过程中的功能。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9 技术的广泛应用，使得在原代细胞中进行基因靶向成为评估T细胞基因功能的常规方法。鉴于基因敲除（KO）小鼠品系成本高昂且获取受限，使用基因靶向动物模型来验证涉及T细胞基因功能的初步假设往往难以实现。然而，研究人员可利用商业化的资源（包括预设计的向导RNA（gRNAs）），便捷地生成基因靶向的初始T细胞，用于T细胞活化与分化研究。

本文概述了一种利用核转染递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）高效生成基因敲除小鼠初始CD4 T细胞的实验方案，所获得的细胞可用于评估基因在CD4 T细胞分化过程中的功能。 体外从小鼠次级淋巴器官中分离初始CD4 T细胞，随后通过核转染导入Cas9-gRNA复合物，可在T细胞激活之前启动基因敲除，相较于需要预先激活T细胞的逆转录病毒介导的gRNA递送方法具有策略性优势，从而避免了无法在初始T细胞中评估基因功能的问题。此外，这种基于核转染的方法可规避基因敲除动物模型中可能存在的发育相关问题。

在Cas9-gRNA递送后，我们描述了利用以下方法研究CD4 T细胞分化为Th1、Th2、Th17和Treg谱系的实验方案 体外 极化。此外，本方案可适用于使用基因靶向的CD4或CD8 T细胞进行多种下游应用，包括其他T细胞活化研究 体外 以及过继转移研究 体内CRISPR-Cas9 技术的应用简化了我们在 T 细胞中评估基因功能的能力，使得多个目的基因的常规敲除成为可能，使研究人员摆脱了研究基因敲除动物时所面临的一些限制。

引言

基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的技术已彻底改变了我们操控基因组DNA序列的能力，极大增强了在无数生物系统中研究基因功能的水平。针对CD4 T细胞，利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物的方法已逐步发展起来，可高效实现初级初始T细胞中的基因敲除（KO），并可用于体外（in vitro）和体内（in vivo）研究1,2,3,4。鉴定调控CD4 T细胞分化的新型候选基因通常依赖于转录组学和表观基因组学分析，这些分析会产生许多尚无现成研究资源或难以获得研究工具的新靶点，特别是当该基因在多种组织中发挥作用并可能需要通过条件性基因靶向小鼠模型进行评估时。通过逆转录病毒转导gRNA进行基因靶向的方法曾被用于T细胞中基因功能的研究5,6，但该方法需要T细胞激活才能实现病毒感染，因此无法用于靶向初始T细胞中的基因。相比之下，在初始T细胞中通过核转染递送CRISPR-Cas9技术提供了一种相对经济且快速的替代方案，可在投入耗时且昂贵的小鼠模型研究之前，对新发现的感兴趣基因进行验证和深入探究。

在本方案中，我们采用重组Cas9蛋白与向导RNA（gRNA）分子形成复合物，通过核转染将该复合物递送至初始CD4 T细胞，从而实现CRISPR-Cas9介导的基因编辑。gRNA由两个不同的组分构成：反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）和CRISPR RNA（crRNA）。从功能上看，tracrRNA来源的序列有助于gRNA与Cas9蛋白结合，而crRNA序列则提供对目标DNA区域的特异性识别能力。Cas9-gRNA复合物可介导靶向的双链DNA（dsDNA）断裂，其中gRNA决定了Cas9核酸酶活性的序列特异性7,8。Cas9介导的dsDNA断裂可通过非同源末端连接在靶细胞中产生插入或缺失（indel）突变，从而导致基因失活9。在本方案中，我们建议使用多个靶向目的基因的gRNA，以确保在初始CD4 T细胞中实现高效的基因敲除（KO）。

辅助性CD4 T细胞是免疫系统中的关键角色，通过产生多种细胞因子来指导免疫应答，从而调节多种免疫细胞的功能。在T细胞受体（TCR）受到刺激并存在特定细胞因子的条件下，初始CD4 T细胞可分化为不同的辅助性T细胞（Th）亚群，包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞（Treg）。10,11,12定义这些不同的CD4 T细胞谱系的是特定谱系决定性转录因子（TFs）和细胞因子的表达图1）。CD4 T细胞的分化可以通过以下方式建模使用 体外 极化13,14,15，使用在谱系促进性细胞因子和阻断抗体存在下通过TCR激活的初始CD4 T细胞，以防止不适当的谱系分化。

在初始CD4 T细胞中结合CRISPR-Cas9基因靶向技术 体外 CD4 T细胞极化为评估这些细胞中基因功能提供了一个强有力的系统（图2）。鉴于用于通过流式细胞术评估CD4分化状态的试剂广泛可得，使用本文所述方案可轻松检测CD4 T细胞分化的关键方面，包括转录因子（TF）表达和细胞因子产生。鉴定调控CD4 T细胞功能的新基因有助于加深我们对这些细胞的理解，而CRISPR-Cas9技术与 体外 偏振提供了一种稳健的方法，可在构建基因敲除小鼠模型之前评估基因功能。

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方案

本研究所述所有实验均使用野生型（WT）C57/BL6J小鼠。小鼠饲养和处理均遵循美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）指南（方案编号LISB-22E）以及美国国立卫生研究院（NIH）动物护理与使用委员会（动物福利保证号#A-4149-01）的规定，在特定病原体阴性（SPF）条件下进行。

开始前的注意事项

  1. 选择 gRNA 试剂
    注意：有关获取本方案中使用的靶向小鼠基因组的预设计 gRNA 试剂的信息，请参见材料表。
    1. 搜索目标基因（材料表，所需 crRNA），并选择排名前三的预设计 crRNA（2 nmol 规格）。此外，同时获取阴性对照 crRNA 以平行使用（材料表）。
      注意：功能性 gRNA 的形成需要将 crRNA 与 tracrRNA 退火配对；请获取 tracrRNA 试剂，并按照第 3 节中的步骤操作。
    2. 设计定制的靶向 gRNA 序列。
      注意：定制靶向 gRNA 序列的设计不在本方案的范围之内，但可使用公开可用的工具（如 CRISPick，材料表）完成。
  2. 缓冲液、培养基和设备
    注意：除非另有说明，所有缓冲液和试剂均应使用低温（4 °C）状态。
    1. 在开始实验前，配制 MACS 缓冲液、FACS 缓冲液、0.5% Triton X-100 缓冲液、1× 透化缓冲液、完全 RPMI 培养基和完全 IMDM 培养基（材料表），并储存于 4 °C。
    2. 在开始本实验前，准备好初始 CD4 T 细胞分离试剂盒和抗 FITC 微珠试剂盒（材料表）。
    3. 在开始核转染（第 4 节）前，将 5 mL 完全 IMDM 培养基预热至 37 °C，并准备至少 10 mL 添加了 IL-7（5 ng/µL）的完全 IMDM 培养基，同样预热至 37 °C（材料表）。根据核转染后每份样品需添加 125 µL 的需求，按需调整预热培养基的体积。根据核转染的细胞数量，按需调整含 IL-7 的完全 IMDM 培养基的体积（第 4 节）。
    4. 在开始抗原呈递细胞（APC）分离前，通过向含有 2 mg 丝裂霉素 C 的小瓶中加入 4 mL 无菌 H2O 来配制丝裂霉素 C 试剂（储存浓度为 0.5 mg/mL）。
      注意：所有操作步骤均应在组织培养罩内进行，并采用无菌操作技术。

2. 初始CD4 T细胞的分离

注意：初始CD4 T细胞可通过磁性分离或细胞分选获得。磁性分离得到的细胞纯度通常为97%，且细胞活力非常高；而电子分选虽可提高细胞纯度，但会降低细胞活力。此处描述的方案采用磁性分离法，但也可根据需要调整适用于其他情况。请确保已正确准备LS柱（材料表）。

  1. 从小鼠（此处使用野生型 C57BL/6J 小鼠）中分离脾脏和淋巴结（腹股沟、臂部、腋窝和颈部）。
  2. 将70 µm细胞筛置于60 mm培养皿中，每个处理的组织加入5 mL完全RPMI培养基（材料表）。将淋巴结和脾脏分别在不同的培养皿中处理以提高得率。使用3 mL注射器的推杆轻轻将组织碾压过筛。用1–3 mL培养基冲洗滤网，将单细胞悬液转移至15 mL锥形管中。
  3. 根据需要，对其他淋巴结和脾组织重复步骤2.2。
  4. 将单细胞悬液在4 °C下以500 × g离心5分钟。
  5. 按以下步骤进行细胞计数。
    1. 对于脾脏样本，吸除上清液，轻轻将细胞沉淀重悬于1 mL ACK裂解缓冲液中，在室温下孵育2–5分钟，然后加入2 mL完全RPMI培养基，离心，再重悬于5 mL完全RPMI培养基中，并进行细胞计数。
    2. 对于淋巴结细胞，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL新鲜完全RPMI培养基中，然后进行细胞计数。
  6. 为用于初始CD4分离试剂盒，将脾细胞与淋巴结细胞混合，以达到分离所需的细胞数量。
    注意：通常，来自野生型B6小鼠的1 × 108个淋巴结和脾细胞可获得2–8 × 106个初始CD4 T细胞。
  7. 将合并的脾脏和淋巴结细胞在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液，并根据制造商说明书（初始CD4 T细胞分离试剂盒）的要求，将细胞沉淀重悬于适当体积的MACS缓冲液中（材料表）。
  8. 严格按照制造商说明书，使用初始CD4+ T细胞生物素抗体混合物、抗生物素磁珠和CD44磁珠，通过阴性筛选法（材料表）分离初始CD4 T细胞；本分离过程使用LS柱，并将细胞收集至15 mL锥形管中。
  9. 分离完成后，在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于2 mL完全RPMI培养基中，并进行细胞计数。
  10. 将细胞置于4 °C保存，直至准备开始核转染。

3. Cas9-gRNA 复合物的形成

注意：准备阴性对照和基因特异性的crRNA储备液。本文以一个独特的crRNA用于阴性对照条件，三个独特的crRNA用于基因靶向条件为例进行说明。同时使用三个不同的crRNA可确保目标基因的完全敲除。

  1. 使用双链缓冲液（材料表）将crRNA和tracrRNA重悬至100 µM的储存浓度。每1 nmol RNA加入10 µL缓冲液。
  2. 在无菌PCR管中，按1:1比例将单个crRNA与tracrRNA混合，并用移液器吹打混匀。在热循环仪中95 °C加热5分钟，随后将复合物置于实验台面上冷却至室温，至少静置10分钟。
    注意：crRNA/tracrRNA双链体此后均称为gRNA。若储存于-20 °C，复合物可保持稳定至少6个月。通常每次实验配制6 µL gRNA（3 µL crRNA + 3 µL tracrRNA），足以处理约五个样品（每样品1 µL）。
  3. 针对基因靶向gRNA：在无菌PCR管中加入3 µL gRNA（每个靶点使用三种不同的gRNA，各1 µL）、1 µL Cas9蛋白和1 µL双链缓冲液（每样品总体积5 µL）。轻轻吹打混匀，确保所有组分位于管底。室温孵育10分钟。此步骤的时间应与核转染步骤（4.1–4.2）同步进行。
  4. 针对阴性对照gRNA：在无菌PCR管中加入1 µL gRNA、1 µL Cas9蛋白和3 µL双链缓冲液（每样品总体积5 µL）。轻轻吹打混匀，确保所有组分位于管底。室温孵育10分钟。同样，此步骤的时间应与核转染步骤（4.1–4.2）同步进行。
    注意：阴性对照使用50 pmol gRNA（而测试组为3 × 50 pmol），更具成本效益，且对实验结果无影响。

4. 核转染——Cas9-gRNA介导的基因敲除

  1. 将 1–8 × 106 个纯化的 T 细胞在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟，每份核转染样品处理一次。小心尽可能吸除上清液。
  2. 将细胞重悬于 20 µL P3 缓冲液中（每份样品含 16.4 µL P3 缓冲液 + 3.6 µL 补充剂；参见核转染试剂盒，材料表），并将悬液转移至含有 Cas9-gRNA 复合物的 PCR 管中。混匀后转移至 16 孔核转染杯（核转染试剂盒，材料表）的独立孔中。转移细胞至电转杯时，确保未产生气泡，因为气泡会降低核转染效率。轻敲电转杯底部接触工作台面，确保所有液体沉降至各孔底部且无气泡残留。
  3. 使用指定核转染仪的 DN100 程序进行核转染（材料表）。立即向核转染杯各孔中加入 125 µL 预热的完全 IMDM 培养基，并将细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中。再用 125 µL 预热的培养基冲洗每个孔一次，以确保回收全部细胞。
  4. 将细胞在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去所有培养基，然后重悬于 200 µL 预热的完全 IMDM 培养基 + 5 ng/mL IL-7（材料表）中。
  5. 将 200 µL 细胞悬液转移至培养板中，并加入预热的完全 IMDM 培养基 + 5 ng/mL IL-7，根据培养板规格调整至最终所需体积：48 孔板每孔 1–2 × 106 个细胞（每孔 1 mL 培养基），24 孔板每孔 2–4 × 106 个细胞（每孔 1.5 mL 培养基），12 孔板每孔 4–6 × 106 个细胞（每孔 2 mL 培养基），6 孔板每孔 6–10 × 106 个细胞（每孔 4 mL 培养基）。将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养 3 天。
    注意：根据目标蛋白的降解速率及后续检测方法，可优化此培养时间。我们发现 3 天的静置期效果最佳，但可根据目标基因，在上述条件下将培养时间调整为 1 至 7 天。
  6. 在完全 IMDM 培养基 + 5 ng/mL IL-7 中培养后，通过移液重悬细胞，并收集至 15 mL 圆锥形离心管中。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 完全 RPMI 培养基中。
  7. 对细胞进行计数，以确定与目标 gRNA 核转染细胞相对应的活初始 CD4 T 细胞数量。
    注意：在核转染过程中，预计在整个实验流程中损失约 50% 的起始细胞，因此应相应调整所用初始 CD4 T 细胞的数量。此外，此时可采用多种技术（流式细胞术、Western blot、qPCR 或 T7EI 检测）评估初始 CD4 T 细胞中基因靶向的效率。

5. 抗原呈递细胞（APC）的分离

注意：确保已配制好丝裂霉素试剂，用于分离后处理抗原呈递细胞（材料表）。实验开始前请仔细阅读生产商提供的抗FITC微珠操作说明，并确保已正确准备LS柱（材料表）。

  1. 从指定用于抗原呈递细胞（APC）分离的野生型（WT）小鼠中分离脾脏。
  2. 按上述方法（2.2、2.5.1）制备单细胞悬液——使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞，将细胞沉淀重悬于5 mL完全RPMI培养基（4 °C）中，并进行细胞计数。
    注意：在完成APC分离后，预期获得的细胞数量约为起始输入细胞数量的一半。例如，1 × 108个输入脾细胞可获得约40–50 × 106个APC。请根据需要准备相应数量的脾细胞用于分离。
  3. 在4 °C条件下，以500 × g离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于800 µL MACS缓冲液中（材料表）。
  4. 向脾细胞悬液中分别加入4 µL FITC标记的抗CD4和抗CD8抗体（材料表），充分混匀后于4 °C孵育15分钟。
  5. 在4 °C条件下以500 × g离心5分钟，弃去上清。按照试剂盒说明书，将细胞重悬于推荐体积的MACS缓冲液中，并加入适量抗FITC磁珠（材料表）。
  6. 于4 °C孵育15分钟，随后在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。将细胞重悬于500 µL MACS缓冲液中，并按照制造商的操作说明，将细胞通过预处理的LS型分选柱，收集流出液至15 mL锥形管中。
  7. 在4 °C条件下以600 × g离心5分钟，弃去上清，将细胞沉淀重悬于2.7 mL无菌1×PBS中。
    注意：APC可能沉淀较差，建议提高离心速度。
  8. 向细胞悬液中加入300 µL丝裂霉素C溶液，使终浓度为50 µg/mL。充分混匀后，在37 °C水浴中孵育30分钟，或在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育45分钟。
  9. 孵育结束后，在4 °C条件下以600 × g离心5分钟，用10 mL无菌1×PBS洗涤细胞。使用真空泵尽可能吸除上清。重复洗涤两次。
  10. 再次在4 °C条件下以600 × g离心5分钟，弃去上清，将细胞沉淀重悬于5 mL完全RPMI培养基（4 °C）中，进行细胞计数。将APC置于4 °C保存，待进行CD4 T细胞分化实验时使用。

6. CD4 T 细胞分化

注意：本实验方案设定在48孔板中进行细胞培养，每孔接种2 × 105个初始CD4 T细胞和1 × 106个抗原呈递细胞（APC），细胞比例为1:5。细胞培养于完全IMDM培养基中。本文将提供Th1、Th2、Th17和Treg型CD4 T细胞分化的培养条件；但用户可根据自身研究重点选择特定的细胞谱系诱导条件。

  1. 确定将使用的48孔板中的细胞数量，并计算每种细胞类型所需的细胞数。
    注意：例如，10 个孔需要 2 × 106 初始CD4和10 × 106 APC 以保持 1:5 的比例。如果细胞数量允许，应多计算一个孔所需的细胞数，以弥补铺板时可能产生的移液误差。
  2. 将所需数量的初始CD4细胞与APC以1:5的比例混合，600 × g离心细胞 × g 5 分钟，4 °C，去除上清液，将细胞沉淀重悬于500 µ每孔加入完全 IMDM 培养基 L（例如，10 孔细胞对应 5 mL 培养基）。
  3. 500孔板 µ将细胞以 L 增量加入 48 孔板的各孔中，确保每孔含有 2 × 105 初始CD4+1 × 106 抗原呈递细胞
  4. 针对所需的CD4 T细胞分化条件，按照下文所述在完全IMDM中配制2倍浓度的细胞因子与抗体混合液 表1. 加入500 µ将 2x 混合液的 L 加入先前已接种的 500 µ将细胞按L增量加入，使试剂的终浓度为1x。
    注意：这些示例基于配制2.5 mL的2倍浓度预混液，每种条件可满足五个孔的用量。若试剂用量允许，建议额外多配制一份2倍浓度混合液，以补偿移液误差。
  5. 加入500 µ2x 细胞因子加抗体培养基 L 至 500 µ含CD4/APC细胞的孔中加入L，使试剂终浓度为1x。
  6. 将48孔板置于37℃培养箱中 °C，5% CO₂2将细胞培养72小时，以完成CD4极化。
    注意：培养结束后应检查平板，以确保菌体生长旺盛。孵育后培养基应呈橙色，若培养基变黄则提示可能存在菌体过度生长。

7. 评估基因敲除对CD4 T细胞分化的影响

注意：所有染色步骤中，应配制主混合液，将抗体按适当稀释比例加入所需的染色缓冲液中。每份样本使用 50 µL 抗体/缓冲液混合液。根据具体实验调整所用的特异性抗体。用户应根据自身实验需求选择相应的抗体组合；本文提供了一个模板，可用于指导针对本研究中目标基因的抗体 panel 设计。

  1. CD4 分化后，小心移除 600 µL 上清液，然后用移液器吹打重悬每孔中的细胞。
  2. 从每孔中取出 200 µL 细胞，加入已标记的 96 孔板中用于转录因子染色。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀，弃去上清液，随后进行表面染色（步骤 7.5）。
  3. 对于细胞因子分析，使用 PMA（50 ng/mL）、Ionomycin（500 ng/mL）和 Golgi Stop（1/2,000 稀释）在完全 IMDM 培养基中对剩余的 200 µL 细胞进行再刺激。向每孔加入 200 µL 2 倍浓度的再刺激混合液，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4 小时。
    注意：48 孔板中应剩余 200 µL；因此，加入 200 µL 含 PMA（2 倍浓度，100 ng/mL）、Ionomycin（2 倍浓度，1 µg/mL）和 Golgi Stop（2 倍浓度，1/1,000）的 2 倍混合液后，最终浓度为 1 倍（材料表）。
  4. 在此期间，开始进行转录因子染色。通过将细胞重悬于含所需荧光染料偶联抗体的 50 µL FACS 缓冲液中，进行表面抗原染色（每样本，表 2）。在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
  5. 向每孔加入 150 µL FACS 缓冲液以洗去染色缓冲液。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复一次，共洗涤两次。
  6. 在室温避光条件下，用 100 µL Foxp3 固定液固定细胞 25 分钟（材料表）。
  7. 25 分钟后，向每孔加入 100 µL FACS 缓冲液以洗去固定液。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复一次，共洗涤两次。
  8. 通过将细胞重悬于含直接偶联的转录因子特异性抗体的 50 µL 1 倍 Foxp3 通透缓冲液中，进行细胞内染色（每样本，表 2），在 4 °C 避光孵育至少 1 小时。
  9. 细胞内染色完成后，向每孔加入 100 µL FACS 缓冲液。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复一次，共洗涤两次。将细胞重悬于终体积 200 mL 的缓冲液中，用于流式细胞术分析。
  10. 完成 PMA/离子霉素/Golgi Stop 再刺激后，通过移液吹打重悬细胞，并将每份细胞因子样品中的 400 µL 转移至 1.5 mL 微量离心管中。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀，弃去上清液。将细胞样品重悬于 100 µL FACS 缓冲液中，并转移至 96 孔板进行表面染色。再次在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀，弃去上清液。
  11. 配制含针对表面抗原的荧光抗体的表面染色混合液（FACS 缓冲液，表 2）。每样本加入 50 µL 染色缓冲液重悬细胞，在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
  12. 向每孔加入 150 µL FACS 缓冲液以洗去染色缓冲液。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复一次，共洗涤两次。
  13. 在室温避光条件下，用 100 µL 4% 多聚甲醛固定细胞 25 分钟（材料表）。
  14. 向每孔加入 100 µL FACS 缓冲液以洗去固定液。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复一次，共洗涤两次。
  15. 通过将细胞重悬于含抗细胞因子抗体和 0.5% Triton X-100 的染色缓冲液中，进行细胞内细胞因子染色（每样本 50 µL，表 2），在 4 °C 避光孵育至少 1 小时。
  16. 细胞内染色完成后，向每孔加入 100 µL FACS 缓冲液。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复一次，共洗涤两次。将细胞重悬于终体积 200 mL 的缓冲液中，用于流式细胞术分析。
  17. 通过流式细胞术分析转录因子和细胞因子染色的样品。
    注意：代表性结果部分将展示上述染色方案的预期流式细胞术图谱。

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结果

为了验证使用本方案（第2节）能够获得纯度较高的初始CD4 T细胞群体，我们采用流式细胞术在磁珠分选前后对这些细胞进行鉴定。通过本方法，在分选后获得了纯度很高的活体CD4+TCRb+CD25-CD44-CD62L+初始CD4 T细胞群体（图3A）。此外，为了确认Cas9-gRNA复合物已成功转染至初始CD4 T细胞中（第4节），我们对对照组和Cas9-gRNA处理组细胞进行了流式细胞术分析，并检测了Atto550荧光信号，该荧光染料标记于本方案所用的tracrRNA上（图3B）。与对照组相比，电转染细胞中Cas9-gRNA复合物的信号显著增强，表明RNP复合物高效进入初始CD4 T细胞。我们还展示了在CD4 T细胞分化后鉴定活体CD4 T细胞的设门策略（第7节），这对于识别产生谱系特异性细胞因子的活化CD4 T细...

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讨论

将CRISPR-Cas9复合物递送至初始CD4 T细胞的实验方案与CD4 T细胞分化研究方法相结合，为探索调控CD4 T细胞生物学的新基因提供了强有力的工具。本文提供了一份全面指南，介绍如何使用市面上可获得的Cas9和gRNA试剂，这些试剂操作简便。通过核转染法将Cas9-gRNA复合物递送至初始CD4 T细胞，可实现高效的基因编辑，从而几乎完全敲除目标基因。此外，通过流式细胞术分析 体外 极化CD4 T细胞可全面检测谱系分化情况，同时也是验证CRISPR介导基因敲除的便捷工具。

在此，我们描述了在初始CD4 T细胞中通过Cas9-gRNA核转染进行基因编辑的方法 体外 CD4 T细胞极化；然而，该方法也可适用于许多其他应用。特别是，基因靶向的初始CD4 T细胞也可用于过继性转移研究 体内. 采用过继转移经 Cas9-gRNA 处理的 TCR 转基因 CD4 T 细胞，可能在研究抗原特异性 CD4 T 细胞对感染的应答方面具有重要价值。除了 CD4 T 细胞外，本文所述的 Cas9-gRNA 核转染方法在初始 CD8...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）院内研究计划资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 M EDTA，pH = 8.0IPM 科学11005-016
16% 多聚甲醛，PFA电子显微镜科学公司15710用 PBS 稀释，配制 4% PFA 固定液
1x eBioscience 缓冲液（1x 破膜缓冲液）赛默飞世尔科技00-5523-00使用试剂盒中的通透缓冲液配制1x溶液
1× PBS，pH = 7.4高质量生物学114-058-101
2-巯基乙醇（1000倍）Gibco21985-023
4D Nucleofector 核心单元LonzaAAF-1003B
4D Nucleofector X单元LonzaAAF-1003X
60 mm 培养皿Falcon353002
70 µm 尼龙网筛Fisherbrand22363548
ACK裂解缓冲液GibcoA10492-01
Amaxa P3 原代细胞 4D-核转染试剂盒 XLonzaV4XP-3032该试剂盒包含：P3 原代细胞溶液、补充剂1 和 16 孔电穿孔条状管
抗FITC微珠Miltenyi Biotec130-048-701遵循 Miltenyi Anti-FITC 微珠操作方案
抗小鼠 CD28（37.51）bioXcellBE0015-1参见表1以获取储备液浓度
抗小鼠 CD3e（145-2C11）bioXcellBE0001-1参见表1以获取储备液浓度
抗小鼠干扰素γ (XMG1.2)bioXcellBE0055参见表1以获取储备液浓度
抗小鼠 IL-12p40（C17.8）bioXcellBE0051参见表1以获取储备液浓度
抗小鼠 IL-4（11B11）bioXcellBE0045参见表1中的储备液浓度
BioLite 48孔多孔培养皿赛默飞世尔科技130187
牛血清白蛋白，BSASigma生命科学A3059
Cas9酶IDT1081059Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3（10 mg/mL）— 含核定位序列
完全 IMDM + IL-7 培养基完全 IMDM 培养基，含 5 ng/mL IL-7
完全 IMDM 培养基IMDM+GlutMAX，10% FBS，1% L-谷氨酰胺，1% 青霉素/链霉素，0.1% BME
完全 RPMI 培养基RPMI-1640，10% FBS，1% L-谷氨酰胺，1% 青霉素/链霉素，0.1% BME
CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
所需的crRNA IDT使用 IDT 网站预设计工具：https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  
eBioscience FOXP3/转录因子染色缓冲液套装赛默飞世尔科技00-5523-00试剂盒包含三种试剂：固定/透化浓缩液（4x）、固定/透化稀释液和透化缓冲液（10x）
FACS 缓冲液1× PBS，1% FBS，1 mM EDTA
胎牛血清（FBS）VWR Seradigm Life Science97068-085使用前进行热灭活（56℃温育）°45 分钟，4°C
FITC 标记的抗小鼠 CD4 抗体（RM4-5）Biolegend1005101/200 稀释（0.5 mg/mL 储存浓度）
FITC 标记的抗小鼠 CD8 抗体α (53-6.7)Biolegend1007061/200 稀释（0.5 mg/mL 储存浓度）
高尔基体阻断剂BD 生物科学51-2092KZ1/2000 稀释度
IMDM（1x）+ GlutMAX-1 培养基Gibco31980-030
来自凝聚链霉菌的离子霉素钙盐（1 mg/mL）Sigma Aldrich10634推荐终浓度为 500 ng/mL
L-谷氨酰胺 200 mM（100倍浓缩液）Gibco25030-081
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
MACS 缓冲液1× PBS，0.5% BSA，1 mM EDTA，滤膜除菌
丝裂霉素C（0.5 mg/mL）Millipore SigmaM4287-2MG 
小鼠 Naïve CD4 T细胞分离试剂盒Miltenyi Biotec130-104-453遵循 Miltenyi Naïve CD4 T细胞分离方案。该试剂盒包含NaïCD4+ T细胞生物素抗体混合物、抗生物素微珠和CD44微珠
阴性对照crRNAIDT1072544设计自定义阴性对照的替代方案
无核酸酶双链缓冲液IDT1072570
PCR管条USA Scientific1402-2700
青霉素-链霉素Gibco15140-023
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯，PMA（100 µg/mLSigma AldrichP8139推荐终浓度为 50 ng/mL
ProSeries 高性能 15 mL 离心管Alkali ScientificPS560015 mL 离心管
重组人（h）IL-2Peprotech200-02参见表1以获取储备液浓度
重组人TGF-β1（HEK293表达）Peprotech100-21参见表1以获取储备液浓度
重组小鼠 IL-12p70Peprotech210-12参见表1以获取储备液浓度
重组小鼠IL-4Peprotech214-14参见表1以获取储备液浓度
重组小鼠IL-6Peprotech216-16参见表1以获取储备液浓度
重组小鼠IL-7Peprotech217-17配制为 100 ng/mL
RPMI 1640培养基Gibco21870-076
热循环仪应用生物系统公司4375786我们使用此型号的热循环仪，但本实验方案中任何类似设备均可良好适用
Atto550 标记的 tracrRNA IDT1075928利用Atto550荧光作为读出信号，在核转染后检测Cas9-gRNA复合物。若条件允许，我们推荐使用该试剂。 
Triton-X 缓冲液1× PBS，0.5% TritonX-100，0.1% BSA
TritonX-100伯乐（BioRad）161-0407
未标记的tracrRNA IDT1072534一种成本更低的tracrRNA选择，但无法评估Cas9-gRNA复合物的核转染效率
Veriti 热循环仪，96孔快速型赛默飞世尔科技4375305我们使用此型号的热循环仪，但本实验方案中任何类似设备均可良好适用

参考文献

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