我们概述了一种高度可调的方法，利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物介导的基因敲除技术，在小鼠初始CD4 T细胞中研究基因在CD4 T细胞分化过程中的功能。
本文内容
摘要
摘要
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9 技术的广泛应用，使得在原代细胞中进行基因靶向成为评估T细胞基因功能的常规方法。鉴于基因敲除（KO）小鼠品系成本高昂且获取受限，使用基因靶向动物模型来验证涉及T细胞基因功能的初步假设往往难以实现。然而，研究人员可利用商业化的资源（包括预设计的向导RNA（gRNAs）），便捷地生成基因靶向的初始T细胞，用于T细胞活化与分化研究。
本文概述了一种利用核转染递送CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）高效生成基因敲除小鼠初始CD4 T细胞的实验方案，所获得的细胞可用于评估基因在CD4 T细胞分化过程中的功能。 体外从小鼠次级淋巴器官中分离初始CD4 T细胞，随后通过核转染导入Cas9-gRNA复合物，可在T细胞激活之前启动基因敲除，相较于需要预先激活T细胞的逆转录病毒介导的gRNA递送方法具有策略性优势，从而避免了无法在初始T细胞中评估基因功能的问题。此外，这种基于核转染的方法可规避基因敲除动物模型中可能存在的发育相关问题。
在Cas9-gRNA递送后，我们描述了利用以下方法研究CD4 T细胞分化为Th1、Th2、Th17和Treg谱系的实验方案 体外 极化。此外，本方案可适用于使用基因靶向的CD4或CD8 T细胞进行多种下游应用，包括其他T细胞活化研究 体外 以及过继转移研究 体内CRISPR-Cas9 技术的应用简化了我们在 T 细胞中评估基因功能的能力，使得多个目的基因的常规敲除成为可能，使研究人员摆脱了研究基因敲除动物时所面临的一些限制。
引言
基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的技术已彻底改变了我们操控基因组DNA序列的能力，极大增强了在无数生物系统中研究基因功能的水平。针对CD4 T细胞，利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物的方法已逐步发展起来，可高效实现初级初始T细胞中的基因敲除（KO），并可用于体外（in vitro）和体内（in vivo）研究1,2,3,4。鉴定调控CD4 T细胞分化的新型候选基因通常依赖于转录组学和表观基因组学分析，这些分析会产生许多尚无现成研究资源或难以获得研究工具的新靶点，特别是当该基因在多种组织中发挥作用并可能需要通过条件性基因靶向小鼠模型进行评估时。通过逆转录病毒转导gRNA进行基因靶向的方法曾被用于T细胞中基因功能的研究5,6，但该方法需要T细胞激活才能实现病毒感染，因此无法用于靶向初始T细胞中的基因。相比之下，在初始T细胞中通过核转染递送CRISPR-Cas9技术提供了一种相对经济且快速的替代方案，可在投入耗时且昂贵的小鼠模型研究之前，对新发现的感兴趣基因进行验证和深入探究。
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方案
本研究所述所有实验均使用野生型（WT）C57/BL6J小鼠。小鼠饲养和处理均遵循美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）指南（方案编号LISB-22E）以及美国国立卫生研究院（NIH）动物护理与使用委员会（动物福利保证号#A-4149-01）的规定，在特定病原体阴性（SPF）条件下进行。
开始前的注意事项
- 选择 gRNA 试剂
注意：有关获取本方案中使用的靶向小鼠基因组的预设计 gRNA 试剂的信息，请参见材料表。- 搜索目标基因（材料表，所需 crRNA），并选择排名前三的预设计 crRNA（2 nmol 规格）。此外，同时获取阴性对照 crRNA 以平行使用（材料表）。
注意：功能性 gRNA 的形成需要将 crRNA 与 tracrRNA 退火配对；请获取 tracrRNA 试剂，并按照第 3 节中的步骤操作。 - 设计定制的靶向 gRNA 序列。
注意：定制靶向 gRNA 序列的设计不在本方案的范围之内，但可使用公开可用的工具（如 CRISPick，材料表）完成。
- 搜索目标基因（材料表，所需 crRNA），并选择排名前三的预设计 crRNA（2 nmol 规格）。此外，同时获取阴性对照 crRNA 以平行使用（材料表）。
- 缓冲液、培养基和设备
注意：除非另有说明，所有缓冲液和试剂均应使用低....
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结果
为了验证使用本方案（第2节）能够获得纯度较高的初始CD4 T细胞群体，我们采用流式细胞术在磁珠分选前后对这些细胞进行鉴定。通过本方法，在分选后获得了纯度很高的活CD4+TCRb+CD25-CD44-CD62L+初始CD4 T细胞群体（图3A）。此外，为确认Cas9-gRNA复合物已成功转染至初始CD4 T细胞中（第4节），我们对对照组和Cas9-gRNA处理组细胞进行了流式细胞术分析，并检测了Atto550荧光信号，该荧光染料标记于本方案所用的tracrRNA上（图3B）。与对照组相比，电转后细胞中Cas9-gRNA复合物的信号显著增强，表明RNP复合物高效进入初始CD4 T细胞。我们还展示了在CD4 T细胞分化后（第7节）鉴定活CD4 T细胞的设门策略，这对于识别产生谱系特异性细胞因子的活化CD4 T细胞至关.......
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讨论
将CRISPR-Cas9复合物递送至初始CD4 T细胞的实验方案与CD4 T细胞分化研究方法相结合，为探索调控CD4 T细胞生物学的新基因提供了强有力的工具。本文提供了一份全面指南，介绍如何使用市面上可获得的Cas9和gRNA试剂，这些试剂操作简便。通过核转染法将Cas9-gRNA复合物递送至初始CD4 T细胞，可实现高效的基因编辑，从而几乎完全敲除目标基因。此外，通过流式细胞术分析 体外 极化CD4 T细胞可全面检测谱系分化情况，同时也是验证CRISPR介导基因敲除的便捷工具。
在此，我们描述了在初始CD4 T细胞中通过Cas9-gRNA核转染进行基因编辑的方法 体外 CD4 T细胞极化；然而，该方法也可适用于许多其他应用。特别是，基因靶向的初始CD4 T细胞也可用于过继性转移研究 体内. 采用过继转移经 Cas9-gRNA 处理的 TCR 转基因 CD4 T 细胞，可能在研究抗原特异性 CD4 T 细胞对感染的应答方面具有重要价值。除了 CD4 T 细胞外，本文所述的 Cas9-gRNA 核转染方法在初始 CD8.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）院内研究计划资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA，pH = 8.0 | IPM 科学 | 11005-016 | |
| 16% 多聚甲醛，PFA | 电子显微镜科学公司 | 15710 | 用 PBS 稀释，配制 4% PFA 固定液 |
| 1x eBioscience 缓冲液（1x 破膜缓冲液） | 赛默飞世尔科技 | 00-5523-00 | 使用试剂盒中的通透缓冲液配制1x溶液 |
| 1× PBS，pH = 7.4 | 高质量生物学 | 114-058-101 | |
| 2-巯基乙醇（1000倍） | Gibco | 21985-023 | |
| 4D Nucleofector 核心单元 | Lonza | AAF-1003B | |
| 4D Nucleofector X单元 | Lonza | AAF-1003X | |
| 60 mm 培养皿 | Falcon | 353002 | |
| 70 µm 尼龙网筛 | Fisherbrand | 22363548 | |
| ACK裂解缓冲液 | Gibco | A10492-01 | |
| Amaxa P3 原代细胞 4D-核转染试剂盒 X | Lonza | V4XP-3032 | 该试剂盒包含：P3 原代细胞溶液、补充剂1 和 16 孔电穿孔条状管 |
| 抗FITC微珠 | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | 遵循 Miltenyi Anti-FITC 微珠操作方案 |
| 抗小鼠 CD28（37.51） | bioXcell | BE0015-1 | 参见表1以获取储备液浓度 |
| 抗小鼠 CD3e（145-2C11） | bioXcell | BE0001-1 | 参见表1以获取储备液浓度 |
| 抗小鼠干扰素γ (XMG1.2) | bioXcell | BE0055 | 参见表1以获取储备液浓度 |
| 抗小鼠 IL-12p40（C17.8） | bioXcell | BE0051 | 参见表1以获取储备液浓度 |
| 抗小鼠 IL-4（11B11） | bioXcell | BE0045 | 参见表1中的储备液浓度 |
| BioLite 48孔多孔培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 130187 | |
| 牛血清白蛋白，BSA | Sigma生命科学 | A3059 | |
| Cas9酶 | IDT | 1081059 | Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3（10 mg/mL）— 含核定位序列 |
| 完全 IMDM + IL-7 培养基 | 完全 IMDM 培养基，含 5 ng/mL IL-7 | ||
| 完全 IMDM 培养基 | IMDM+GlutMAX，10% FBS，1% L-谷氨酰胺，1% 青霉素/链霉素，0.1% BME | ||
| 完全 RPMI 培养基 | RPMI-1640，10% FBS，1% L-谷氨酰胺，1% 青霉素/链霉素，0.1% BME | ||
| CRISPick | https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
| 所需的crRNA | IDT | 使用 IDT 网站预设计工具：https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN | |
| eBioscience FOXP3/转录因子染色缓冲液套装 | 赛默飞世尔科技 | 00-5523-00 | 试剂盒包含三种试剂：固定/透化浓缩液（4x）、固定/透化稀释液和透化缓冲液（10x） |
| FACS 缓冲液 | 1× PBS，1% FBS，1 mM EDTA | ||
| 胎牛血清（FBS） | VWR Seradigm Life Science | 97068-085 | 使用前进行热灭活（56℃温育）°45 分钟，4°C |
| FITC 标记的抗小鼠 CD4 抗体（RM4-5） | Biolegend | 100510 | 1/200 稀释（0.5 mg/mL 储存浓度） |
| FITC 标记的抗小鼠 CD8 抗体α (53-6.7) | Biolegend | 100706 | 1/200 稀释（0.5 mg/mL 储存浓度） |
| 高尔基体阻断剂 | BD 生物科学 | 51-2092KZ | 1/2000 稀释度 |
| IMDM（1x）+ GlutMAX-1 培养基 | Gibco | 31980-030 | |
| 来自凝聚链霉菌的离子霉素钙盐（1 mg/mL） | Sigma Aldrich | 10634 | 推荐终浓度为 500 ng/mL |
| L-谷氨酰胺 200 mM（100倍浓缩液） | Gibco | 25030-081 | |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS 缓冲液 | 1× PBS，0.5% BSA，1 mM EDTA，滤膜除菌 | ||
| 丝裂霉素C（0.5 mg/mL） | Millipore Sigma | M4287-2MG | |
| 小鼠 Naïve CD4 T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | 遵循 Miltenyi Naïve CD4 T细胞分离方案。该试剂盒包含NaïCD4+ T细胞生物素抗体混合物、抗生物素微珠和CD44微珠 |
| 阴性对照crRNA | IDT | 1072544 | 设计自定义阴性对照的替代方案 |
| 无核酸酶双链缓冲液 | IDT | 1072570 | |
| PCR管条 | USA Scientific | 1402-2700 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-023 | |
| 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯，PMA（100 µg/mL | Sigma Aldrich | P8139 | 推荐终浓度为 50 ng/mL |
| ProSeries 高性能 15 mL 离心管 | Alkali Scientific | PS5600 | 15 mL 离心管 |
| 重组人（h）IL-2 | Peprotech | 200-02 | 参见表1以获取储备液浓度 |
| 重组人TGF-β1（HEK293表达） | Peprotech | 100-21 | 参见表1以获取储备液浓度 |
| 重组小鼠 IL-12p70 | Peprotech | 210-12 | 参见表1以获取储备液浓度 |
| 重组小鼠IL-4 | Peprotech | 214-14 | 参见表1以获取储备液浓度 |
| 重组小鼠IL-6 | Peprotech | 216-16 | 参见表1以获取储备液浓度 |
| 重组小鼠IL-7 | Peprotech | 217-17 | 配制为 100 ng/mL |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 21870-076 | |
| 热循环仪 | 应用生物系统公司 | 4375786 | 我们使用此型号的热循环仪，但本实验方案中任何类似设备均可良好适用 |
| Atto550 标记的 tracrRNA | IDT | 1075928 | 利用Atto550荧光作为读出信号，在核转染后检测Cas9-gRNA复合物。若条件允许，我们推荐使用该试剂。 |
| Triton-X 缓冲液 | 1× PBS，0.5% TritonX-100，0.1% BSA | ||
| TritonX-100 | 伯乐（BioRad） | 161-0407 | |
| 未标记的tracrRNA | IDT | 1072534 | 一种成本更低的tracrRNA选择，但无法评估Cas9-gRNA复合物的核转染效率 |
| Veriti 热循环仪，96孔快速型 | 赛默飞世尔科技 | 4375305 | 我们使用此型号的热循环仪，但本实验方案中任何类似设备均可良好适用 |
参考文献
- Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).
- Nussing, S., et al. Efficient CRISPR/Cas9 gene editing in uncul....
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