本文介绍了在小鼠和大鼠中使用物理束缚应激诱导应激反应的操作步骤，并讨论了在啮齿类动物模型中选择和使用束缚应激时应考虑的其他因素。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
在所有动物物种中，暴露于应激条件下均会引发应激反应。使用啮齿类动物模型研究应激影响的一种方法是束缚应激实验。多年来，束缚应激已被用于研究应激对生理学、遗传学、神经生物学、免疫学及其他系统的影响。由于该方法操作简便、成本低廉，并可通过多种方式调整应激的强度和持续时间，因此已有大量文献在小鼠和大鼠中采用束缚应激进行研究。例如，本研究展示了先前发表的数据，说明束缚应激对转基因小鼠血浆皮质酮水平以及光遗传学诱导的去甲肾上腺素释放的影响。急性束缚应激可升高血浆皮质酮水平，但在经历重复束缚应激的小鼠中，该效应减弱。然而，在终纹床核中，仅在重复束缚应激组中观察到刺激诱导的去甲肾上腺素释放增加。这些数据强调了束缚参数对依赖性测量指标的重要影响。本文还包含了对大鼠中束缚应激的进一步描述，以供比较。最后，讨论了束缚参数（如急性与慢性）以及动物受试者特征（品系、性别、年龄）的影响。
引言
由于压力是普遍存在的体验，关于压力暴露后反应改变机制的研究几十年来一直是持续的研究领域1。这些研究开始区分压力的不同方面：某些压力经历可能有助于增强对急性应激源的适应性和反应能力，而另一些长期或反复、不可预测的压力暴露则可能导致生理和行为功能的不良改变。许多对应激源的反应会影响大脑功能、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴、自主神经系统的交感与副交感分支以及免疫系统。应激源暴露会引发促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）释放增加，从而促进促肾上腺皮质激素（ACTH）以及糖皮质激素（如灵长类和其他多数哺乳动物中的皮质醇，以及啮齿类动物中的皮质酮）的分泌2。此外，作为交感神经系统反应的一部分，肾上腺素和去甲肾上腺素也会在全身及大脑中释放3。这些化学信号随后与多种生理系统相互作用，包括免疫功能、代谢、生殖以及神经元的反应性4。
应激性经历与多种状况相关，包括焦虑和抑郁程度升高、学习与记忆功能改变、决策能力和执行功能受损，以及物质使用障碍易感性增加等。上述每种效应均取决于应激源的参数以及经历应激的个体特征4。应激源的性质，如急性或慢性、可控或不可预测，会显著影响所观察到的结果。这些应激特征在人类经历与动物模型之间表现出一致性。因此，在动物研究中建立应激模型....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
实验和方案已获得北卡罗来纳大学教堂山分校（小鼠）和费尔菲尔德大学（大鼠）机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指南10。
1. 小鼠的束缚应激
注意：在研究应激对生理和神经系统的效应时，小鼠具有多种优势。由于转基因小鼠品系广泛可用，使得针对基因与应激暴露之间相互作用的机制研究易于实现。无论使用转基因小鼠还是野生型小鼠，均建议考虑其背景品系的影响。此外，由于小鼠体型较小且可群养，相较于其他物种在空间利用上更具优势。
- 束缚应激暴露
- 将小鼠随机分配至笼内对照组、急性束缚应激组或慢性束缚应激组。
- 确定应激暴露的持续时间。对于急性应激，采用单次持续5分钟至12小时的束缚处理，小鼠被限制在束缚装置内。对于慢性应激，每次束缚时长应与急性应激相同，但需每日重复，持续时间可短至3天，长至21天。
注意：由于小鼠在束缚期间无法接触食物和水，需考虑笼内对照组动物是否也应限制食物和水的获取。 - 改造50 mL圆锥形离心管，添加通风孔。
- 使用配备1/8"钻头的电钻，在每个离心管周围均匀打孔，确保管内各区域均有空气流通。
- 打孔位置应确保无论小鼠在管内朝向如何，均....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在先前发表的一项研究21中，本论文所述的束缚应激操作被用于评估束缚应激对皮质醇和去甲肾上腺素调控的影响，这属于方案3.3中提到的应激诱导神经生物学改变的广泛可能性范畴。在本研究中，我们采用了上述小鼠束缚方案。有关超出本文束缚操作重点的更多细节，例如脑区选择依据、光遗传学刺激参数或快速扫描循环伏安法（FSCV）等，可在所引用的论文中找到。
我们使用了表达通道视紫红质的雄性和雌性转基因小鼠（DBH:Cre+/-::Ai32+/-），该蛋白在去甲肾上腺素能神经元中特异性表达，并通过离体快速扫描循环伏安法（FSCV）21检测终纹床核（BNST）中刺激诱导的去甲肾上腺素释放。小鼠分别接受急性束缚（2小时）和慢性束缚（每天2小时，持续5天）处理，对照组小鼠置于正常饲养笼中，束缚方法如方案1所述。暴露处理后，部分小鼠采集血液用于皮质酮分析，方法见方案3.1。急性束缚应激后，小鼠的皮质酮水平显著升高，但重复应激后的反应减弱（见图1）。另取小鼠用.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了研究应激对啮齿类动物模型生理、神经生物学及行为功能的影响，必须采用能够对啮齿类动物产生应激的条件。其中需要考虑的因素之一是能够引发受试动物应激反应的条件。限制活动是一种经过验证的方法，可诱发啮齿类动物产生与人类应激效应相匹配的生理和行为反应。采用与本方案类似的方法，限制活动已被用于评估多种与精神疾病模型相关的分子、细胞、内分泌和生理反应，这些疾病包括焦虑、抑郁、疼痛以及物质使用障碍1,19。此处展示了一项已发表研究的数据，作为啮齿类动物限制活动的示例，但限制活动的影响远不止于此特定示例，其可涉及大量因变量的测量。限制活动可能被选作应激源，是因为其在小鼠和大鼠中易于操作、建立成本低廉，并可根据所使用的参数灵活调整以诱发不同程度的应激反应。
与其他诱发应激的方法相比，束缚法在实验设计中存在一些需要考虑的局限性
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
无利益冲突需要申报。
致谢
感谢Holly Rahurahu和Sam Shaffer提供的编辑意见。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL 通用螺口锥形管 | Globe Scientific | 6288 | |
| 一次性移液管接液槽 | Fisher Scientific | 13-681-500 | |
| 皮质酮 ELISA 试剂盒 | Arbor Assays | K014-H | |
| 尾静脉采血固定管 | Braintree Scientific | RTV |
参考文献
- McEwen, B. S., et al. Mechanisms of stress in the brain. Nat Neurosci. 18 (10), 1353-1363 (2015).
- Snyder, A. E., Silberman, Y. Corticotropin releasing factor and norepinephrine related circuitry changes....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
