延长活体成像果蝇雌性Drosophila melanogaster生殖系干细胞微环境

摘要

本文提供了一种详细的实验方案，用于对Drosophila卵巢微环境中生殖系干细胞（GSCs）的不对称分裂进行活体成像。我们使用了一种转基因品系，该品系普遍表达一种绿色荧光蛋白（GFP）与谱斑体蛋白Par-1的融合蛋白。

摘要

活体成像技术能够对细胞动态过程进行详细且实时的分析。Drosophila 卵巢是研究多种发育过程动态变化的优良模型，这些过程包括细胞分裂、干性维持、分化、迁移、凋亡、自噬、细胞黏附等。近期，我们建立了一种延长的ex vivo培养与雌性Drosophila GSC微环境活体成像方法。以携带GFP::Par-1转基因的Drosophila品系为例，该方法可实现GSC在其微环境中不对称分裂的可视化，并可描述细胞周期中谱系体（spectrosome）形态的动态变化。本文中，我们提供了一种详细的Drosophila 卵巢前体区（germaria）ex vivo培养方案，可实现对雌性GSC微环境的长期观察。重要的是，该方案广泛适用于利用多种已在果蝇品系库或Drosophila研究领域中可用的荧光标记目标蛋白进行GSC活体成像的研究。

引言

活体成像技术在获取直接实验证据方面具有重要作用。结合先进的共聚焦显微镜技术与方法学的优化，能够以高精度探究多种生物学事件。优化实验方案中的各个环节，如组织操作与解剖、样品制备与保存以及显微镜采集参数设置，对于最大限度提高实验结果的可靠性与稳健性至关重要。本文介绍一种用于长时间成像监测样品的实验方案，特别侧重于 黑腹果蝇 卵巢。该 黑腹果蝇 卵巢是研究多种发育过程的优良模型系统。作为果蝇的生殖器官之一，该器官 黑腹果蝇 包含一个定义明确的成体干细胞微环境。该GSC微环境在成年期维持雌性配子的发育。 果蝇 卵巢由大约18个卵管组成，其中卵室在生殖腺瘤中发育。在每个生殖腺瘤的顶端，2-4个生殖干细胞（GSCs）由一个体细胞微环境维持，该微环境主要由8-10个细胞组成的末端丝、5-8个帽细胞组成的环状结构以及2-3个前部护送细胞构成。图1A该体细胞微环境为生殖干细胞（GSCs）提供维持其干性、调控增殖及防止分化的关键信号和物理支持。^1,2,3,4,5.

生殖干细胞（GSCs）通常进行不对称分裂，产生一个新的干细胞，该干细胞保持与体细胞微环境的接触，以及一个子细胞——囊胚细胞（cystoblast, CB），后者失去与体性帽细胞的直接接触并发生分化。GSCs和CB均含有一种高度动态的胞质细胞器，称为链状体（spectrosome），其主要功能是在有丝分裂过程中正确引导有丝分裂纺锤体的方向⁶。CB经历4次不完全的胞质分裂，形成一个由16个细胞组成的囊，其中有一个生殖系细胞特化为卵细胞，其余15个细胞则成为滋养细胞。CB中的链状体发育为一种分支状结构，称为融合体（fusome），将这16个相互连接的生殖系细胞连为一体。链状体富含小囊泡以及细胞骨架蛋白，例如丝氨酸-苏氨酸激酶Par-1和膜组分Hu-li tai shao（Hts）⁷。在GSC细胞周期中，链状体通过新增物质而生长，并发生形态变化，从而可用于识别G1期、S期、G2期和M期（图1B）^8,9。

我们最近建立了一种果蝇（Drosophila）生殖囊ex vivo培养方法，可实现对生殖干细胞（GSC）长达16小时的活体成像。由于这些细胞平均每个15.5小时分裂一次⁸，该方法使得能够记录GSC细胞周期的大部分过程。因此，结合其他工具，我们的培养方法揭示了GSC细胞周期中纺锤体体（spectrosome）的形态变化，并实现了对体内不同细胞周期时相持续时间的分析in vivo⁸（图1C）。本文中，我们提供了该延长活体成像方法的详细实验方案，并配有逐步演示的视频，以说明具体操作流程（图2）。

方案

注意：步骤 1.4 必须至少提前 2 天完成。步骤 2.1 和 2.2 可提前 1 天完成。

1. 实验前准备 I

1. 准备链霉素/青霉素抗生素混合液（10,000 U/mL 青霉素和 10 mg/mL 链霉素）的 100 µL 分装液，于 -20 °C 保存，直至使用。
2. 使用经高压灭菌的纯水配制以下 15 mL 溶液，4 °C 保存，并在一个月内使用完毕：碳酸氢钠（NaHCO₃）0.1 M，pH 8.0，以及 0.1% Tween 20。
3. 在超净工作台中配制以下培养基和溶液，以避免污染。使用无菌滤芯吸头和离心管。
   1. 将未稀释的胎牛血清（FBS）以 2 mL 分装，于无菌条件下保存在 -20 °C，直至使用。
   2. 配制添加了 15% FBS 和 0.6% 链霉素/青霉素抗生素混合液的 Schneider's Drosophila 培养基。以 7 mL 分装，4 °C 保存。每份分装液足够用于两块 MatTek 培养皿（见第 2 节）。
      1. 配制 Ringer 溶液（128 mM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、4 mM MgCl₂、35.5 mM 蔗糖、5 mM Hepes，溶于高压灭菌的纯水中；pH 6.9）。以 1 mL 分装，于 -20 °C 保存，直至使用。
4. 将表达与 GFP 融合的 Par-1 蛋白（poly Ubiquitin-mGFP6::par-1 品系）且羽化后 1–2 天的果蝇收集至含有添加酵母粉的果蝇饲料的新离心管中。在 25 °C 培养箱中培养 2 天后进行解剖。
   注意：此步骤可使用任何带有荧光标记的目标报告基因品系完成。

2. 玻璃底板包被与准备

1. 在35 mm多聚-D-赖氨酸包被的培养皿（玻璃底皿，参见材料表）的盖玻片中央放置3 µL特定的Cell-Tak黏附剂（下文简称细胞与组织黏附剂），无需手动涂布。使用无菌枪头。
   注意：细胞与组织黏附剂应保存在4 °C。若实验涉及两种遗传条件（通常为对照和突变条件），在同一玻璃底皿中放置两个独立且间距足够的黏附剂液滴。这可确保两种遗传背景在相同条件下成像。
2. 紧随其后，按照生产商建议，小心地向3 µL黏附剂液滴中加入等体积（本实验方案中为3 µL）的0.1 M NaHCO₃（pH 8.0），并通过移液混匀。
3. 为实现完全蒸发，将培养皿在室温（RT）孵育20分钟，然后于4 °C过夜保存，次日使用。或者，将制备好的培养皿在37 °C孵育25分钟直至完全蒸发，并直接进入下一步操作。两种情况下均需保持培养皿加盖。使用无菌枪头。
4. 使用前，将制备好的玻璃底皿置于实验台静置15–20分钟，使其恢复至室温（RT）。
5. 小心清洗制备好的培养皿3次，避免触碰或扰动黏附层。每次清洗时加入6 µL经高压灭菌的纯水，然后使用洁净枪头吸除水分，共清洗三次，以去除NaHCO₃溶液残留物。
6. 将清洁并制备好的培养皿加盖置于室温 静置5–10分钟，使其水分完全蒸发，同时进行组织解剖操作，加盖以防止灰尘颗粒污染。

3. Drosophila 卵巢解剖及卵管分离与装片

注意：卵巢解剖在林格氏液（而非 Schneider 培养基）中进行，且不添加胎牛血清（FBS），以防止蛋白质干扰组织样本与粘附剂之间的贴附。

1. 使用70%乙醇在开始前清洁三孔解剖皿、镊子和解剖针。
2. 在三个孔中各加入足量的任氏液（约 200 µL）。
3. 在第一个孔中，使用两对镊子按照标准操作程序，将5只饲喂酵母的雌性个体的卵巢解剖至200 µL林格氏液中^10,11. 抓住 果蝇 用镊子夹住雌性个体胸部与腹部交界处，然后轻轻撕开腹部后端的角质层，并拉开腹部角质层，直至两侧卵巢暴露。
4. 将解剖得到的卵巢转移至第二孔中，以减少其他组织残余物或解剖过程中产生的碎屑污染。
5. 在体视显微镜（8X-13.5X放大倍数，配备发光二极管（LED）照明）下，使用尖头镊子去除15-20个卵管的肌鞘。用一对镊子固定整个卵巢组织，另一对镊子平稳夹住一个晚期卵室，轻轻拉伸，直至肌肉断裂并留在后方。
   注意：必须避免因接触卵巢的这一区域而对卵原区造成损伤。去除发育阶段超过8-9期的卵室。
6. 用镊子将15-20个去肌鞘的卵管逐个转移至第三个孔中，该孔内含有200 µL林格氏液。
7. 用移液器吸取0.1% Tween 20预润湿20–200 µL吸头，以防止卵巢管黏附于吸头的塑料内壁。
8. 使用预先润湿的枪头，将含有去滤泡膜卵管的6 µL林格氏液转移至已准备好的粘附板（室温保存）。
   注意：避免移液枪头与粘附层接触，以防在卵巢管沉积后（下一步）发生卵原区脱落。约有30%的卵原区无法正常粘附。
9. 为确保移植的卵巢管粘附于粘附表面，使用解剖针或镊子轻轻按压卵巢管，使其沉降至任氏液液滴底部，直至接触粘附表面。
   注意：一旦卵管小叶沉降后，不要试图重新排列。
10. 小心地向MatTek培养皿中加入3 mL添加了15% FBS和0.6%链霉素/青霉素抗生素混合液的Schneider培养基（步骤1.3）。为防止卵管脱落，应沿培养皿边缘每次缓慢加入1 mL，分次添加。
11. 将含有去肌鞘卵管的培养板在平坦表面上运送至显微镜工作站。

4. 使用共聚焦显微镜进行活体成像

1. 将样品置于转盘显微镜或共聚焦显微镜的63倍物镜下（也可使用类似设备），并对样品进行聚焦。为每个卵原囊选择中间的z平面。
2. 设置以下实验参数：采集模式：三维时间序列成像；激光功率：70/100；激发波长：488 nm；z轴堆栈范围：30 µm；z轴层间距离：1.2 µm；持续时间：17 h；时间点间隔：每10分钟一次。
3. 若设备支持多点成像功能，可重新定义样品的XY坐标，并为每个卵原囊选择其中心Z平面，以便z轴堆栈以此位置为中心进行采集。开始图像采集。
   注意：由于卵原囊的正常宽度为30 µm，每个z轴堆栈将包含约25–27个切片。根据共聚焦显微镜型号的不同，可在每10分钟的时间间隔内对至少25个卵原囊进行成像。通常使用40x/1.30 NA或63x/1.40 NA油浸式平场复消色差物镜。
4. 利用Imaris或ImageJ（Fiji）软件^12,13对图像在时间和Z轴方向上进行分析，以观察谱系体形态的特定变化。图1B'展示了观察中的具体时间点。制作动态图像时，需在每个时间点手动选择最佳的Z平面。

结果

通过这一扩展的活体成像方案，我们能够在无明显生物学干扰的情况下，记录女性生殖干细胞（GSCs）在其生态位内发生的不对称有丝分裂。为此，我们使用在整个生殖腺中普遍表达GFP::Par-1蛋白的样本，该蛋白可在GSC细胞周期中区分五种不同的纺锤极体形态：圆形、塞状、杆状、融合状和感叹号状。图1B,C）。更详细地观察发现，圆形-G2期成镜体具有强烈的GFP:Par1信号（图1C，图a）在G2-M-G1期显著减少。重要的是，利用该转基因品系还可可视化观察到精原干细胞（GSC）进入有丝分裂的过程，因为大多数GFP::Par-1在早前期会离开纺锤极体并充满细胞质图1C，图b）。此外，细胞质中的GFP::Par-1可实现对核膜通透（NEP）步骤的精确定位^8,14，因为此时GFP信号进入核质（

讨论

在此，我们介绍一种用于监测的方案 黑腹果蝇 GSC 生态位长达一段时间，最长可达 16 小时。大多数用于成像的方案 果蝇 生物过程 离体 关注较短的时间窗口，并可在成虫盘中找到多个实例^15,16,17，胚胎性腺^18,19 或卵巢^20,21,22,23图像采集的持续时间当然取决于所研究的发育过程。而瞬时事件的发生时间范围可能从毫秒到秒不等，具体取决于细胞类型和生理条件。²⁴，其他过程（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
9孔玻璃板	康宁	7220-85	n/a
二水合氯化钙	Sigma Aldrich	C3881	CaCl2·2H2O；制备任氏液
Cell-Tak	康宁	354240	用于将细胞或组织切片粘附到多种表面，包括塑料、玻璃、金属、FEP聚合物及生物材料。
Dumont #5 镊子	精细科学	11252-20	n/a
Dumont #55 镊子	精细科学	11255-20	尺寸 0.05 mm × 0.02 mm，长度 11 cm
胎牛血清	Gibco	10500-064	合格，热灭活，欧盟批准，南美来源
玻璃底培养皿	MatTek	P35GC-1.5-10-C	35 mm 培养皿，1.5 号盖玻片，10 mm 玻璃直径 聚-D-赖氨酸包被
HEPES	Sigma Aldrich	H4034	制备林格氏液
氯化镁	Sigma Aldrich	M1028	MgCl2；制备任氏液
持针器	Roboz	RS-6061	轻质中空不锈钢手柄；4 3/4" 长。
尼康 SMZ18 双目显微镜	尼康		https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140122	10,000 U/mL
氯化钾	Sigma Aldrich	P3911	KCl；用于配制任氏液
Schneider's Drosophila 培养基	Biowest	L0207	昆虫细胞培养基
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S8875	NaHCO₃3; ≥99.5%，粉末
氯化钠	Sigma Aldrich	S9888	氯化钠；用于配制任氏液
蔗糖	Sigma Aldrich	S9378	≥99.5%（气相色谱）；用于配制林格氏液
钨解剖针	Roboz	RS-6064	0.25 mm，超细，1 微米尖端（每包 10 个）
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416	分子生物学用黏性液体
酵母粉	Sigma Aldrich	51475	n/a