本文提供了一种详细的实验方案，用于对Drosophila卵巢微环境中生殖系干细胞（GSCs）的不对称分裂进行活体成像。我们使用了一种转基因品系，该品系普遍表达一种绿色荧光蛋白（GFP）与谱斑体蛋白Par-1的融合蛋白。
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本文内容
摘要
摘要
活体成像技术能够对细胞动态过程进行详细且实时的分析。Drosophila 卵巢是研究多种发育过程动态变化的优良模型，这些过程包括细胞分裂、干性维持、分化、迁移、凋亡、自噬、细胞黏附等。近期，我们建立了一种延长的ex vivo培养与雌性Drosophila GSC微环境活体成像方法。以携带GFP::Par-1转基因的Drosophila品系为例，该方法可实现GSC在其微环境中不对称分裂的可视化，并可描述细胞周期中谱系体（spectrosome）形态的动态变化。本文中，我们提供了一种详细的Drosophila 卵巢前体区（germaria）ex vivo培养方案，可实现对雌性GSC微环境的长期观察。重要的是，该方案广泛适用于利用多种已在果蝇品系库或Drosophila研究领域中可用的荧光标记目标蛋白进行GSC活体成像的研究。
引言
活体成像技术在获取直接实验证据方面具有重要作用。结合先进的共聚焦显微镜技术与方法学的优化，能够以高精度探究多种生物学事件。优化实验方案中的各个环节，如组织操作与解剖、样品制备与保存以及显微镜采集参数设置，对于最大限度提高实验结果的可靠性与稳健性至关重要。本文介绍一种用于长时间成像监测样品的实验方案，特别侧重于 黑腹果蝇 卵巢。该 黑腹果蝇 卵巢是研究多种发育过程的优良模型系统。作为果蝇的生殖器官之一，该器官 黑腹果蝇 包含一个定义明确的成体干细胞微环境。该GSC微环境在成年期维持雌性配子的发育。 果蝇 卵巢由大约18个卵管组成，其中卵室在生殖腺瘤中发育。在每个生殖腺瘤的顶端，2-4个生殖干细胞（GSCs）由一个体细胞微环境维持，该微环境主要由8-10个细胞组成的末端丝、5-8个帽细胞组成的环状结构以及2-3个前部护送细胞构成。图1A该体细胞微环境为生殖干细胞（GSCs）提供维持其干性、调控增殖及防止分化的关键信号和物理支持。1,2,3,4,5.
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方案
注意：步骤 1.4 必须至少提前 2 天完成。步骤 2.1 和 2.2 可提前 1 天完成。
1. 实验前准备 I
- 准备链霉素/青霉素抗生素混合液（10,000 U/mL 青霉素和 10 mg/mL 链霉素）的 100 µL 分装液，于 -20 °C 保存，直至使用。
- 使用经高压灭菌的纯水配制以下 15 mL 溶液，4 °C 保存，并在一个月内使用完毕：碳酸氢钠（NaHCO3）0.1 M，pH 8.0，以及 0.1% Tween 20。
- 在超净工作台中配制以下培养基和溶液，以避免污染。使用无菌滤芯吸头和离心管。
- 将未稀释的胎牛血清（FBS）以 2 mL 分装，于无菌条件下保存在 -20 °C，直至使用。
- 配制添加了 15% FBS 和 0.6% 链霉素/青霉素抗生素混合液的 Schneider's Drosophila 培养基。以 7 mL 分装，4 °C 保存。每份分装液足够用于两块 MatTek 培养皿（见第 2 节）。
- 配制 Ringer 溶液（128 mM NaCl、2 mM KCl、1.8 mM CaCl2、4 mM MgCl2、35.5 mM 蔗糖、5 mM Hepes，溶于高压灭菌的纯水中；pH 6.9）。以 ....
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结果
通过这一扩展的活体成像方案，我们能够在无明显生物学干扰的情况下，记录女性生殖干细胞（GSCs）在其生态位内发生的不对称有丝分裂。为此，我们使用在整个生殖腺中普遍表达GFP::Par-1蛋白的样本，该蛋白可在GSC细胞周期中区分五种不同的纺锤极体形态：圆形、塞状、杆状、融合状和感叹号状。图1B,C）。更详细地观察发现，圆形-G2期成镜体具有强烈的GFP:Par1信号（图1C，图a）在G2-M-G1期显著减少。重要的是，利用该转基因品系还可可视化观察到精原干细胞（GSC）进入有丝分裂的过程，因为大多数GFP::Par-1在早前期会离开纺锤极体并充满细胞质图1C，图b）。此外，细胞质中的GFP::Par-1可实现对核膜通透（NEP）步骤的精确定位8,14，因为此时GFP信号进入核质（
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讨论
在此，我们介绍一种用于监测的方案 黑腹果蝇 GSC 生态位长达一段时间，最长可达 16 小时。大多数用于成像的方案 果蝇 生物过程 离体 关注较短的时间窗口，并可在成虫盘中找到多个实例15,16,17，胚胎性腺18,19 或卵巢20,21,22,23图像采集的持续时间当然取决于所研究的发育过程。而瞬时事件的发生时间范围可能从毫秒到秒不等，具体取决于细胞类型和生理条件。24，其他过程（.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢 Acaimo González Reyes 和 María Olmedo López 对本文手稿提出的宝贵意见。本研究由 PID2021-125480NB-I00（H. S-G）、安达卢西亚政府资助的“"Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor"（J. G-M）、塞维利亚大学第六和第七个研究促进计划（VI 和 VII PPIT-塞维利亚大学）资助的“"Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos"（P. R-R），以及塞维利亚大学第六个研究促进计划（VI PPIT-塞维利亚大学）资助的“"Contrato de Acceso de I+D+i"（P. R-R）提供支持。我们谨向生物学家公司（Company of Biologists Ltd）致谢，感谢其慷慨授权，允许我们共享改编自原始出版物的图像（doi:10.1242/DEV.199716）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 9孔玻璃板 | 康宁 | 7220-85 | n/a |
| 二水合氯化钙 | Sigma Aldrich | C3881 | CaCl2·2H2O；制备任氏液 |
| Cell-Tak | 康宁 | 354240 | 用于将细胞或组织切片粘附到多种表面，包括塑料、玻璃、金属、FEP聚合物及生物材料。 |
| Dumont #5 镊子 | 精细科学 | 11252-20 | n/a |
| Dumont #55 镊子 | 精细科学 | 11255-20 | 尺寸 0.05 mm × 0.02 mm，长度 11 cm |
| 胎牛血清 | Gibco | 10500-064 | 合格，热灭活，欧盟批准，南美来源 |
| 玻璃底培养皿 | MatTek | P35GC-1.5-10-C | 35 mm 培养皿，1.5 号盖玻片，10 mm 玻璃直径 聚-D-赖氨酸包被 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | 制备林格氏液 |
| 氯化镁 | Sigma Aldrich | M1028 | MgCl2；制备任氏液 |
| 持针器 | Roboz | RS-6061 | 轻质中空不锈钢手柄；4 3/4" 长。 |
| 尼康 SMZ18 双目显微镜 | 尼康 | https://www.microscope. healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 | |
| 青霉素-链霉素 | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | 10,000 U/mL |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | P3911 | KCl；用于配制任氏液 |
| Schneider's Drosophila 培养基 | Biowest | L0207 | 昆虫细胞培养基 |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S8875 | NaHCO₃3; ≥99.5%，粉末 |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | S9888 | 氯化钠；用于配制任氏液 |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S9378 | ≥99.5%（气相色谱）；用于配制林格氏液 |
| 钨解剖针 | Roboz | RS-6064 | 0.25 mm，超细，1 微米尖端（每包 10 个） |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | 分子生物学用黏性液体 |
| 酵母粉 | Sigma Aldrich | 51475 | n/a |
参考文献
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 605-631 (2005).
- Drummond-Barbosa, D. Local and physiological control of germline stem cell lineages in Drosophila melanogaster. Genetics. 213 (1), e234(2019).
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