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方法文章

利用微型计算机断层扫描技术对小型动物骨骼肌进行无创定量分析

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DOI：

10.3791/67393

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2024年11月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Endocrinologia Translacional, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Small Animal Imaging Unit, National Center for Structural Biology and Bioimaging, Universidade Federal do Rio de Janeiro

本文内容

摘要

本方案采用微型计算机断层扫描技术，可对小型动物的瘦体组织（包括骨骼肌和内脏组织）、脂肪组织以及骨骼组织进行经济高效的定量分析。该方法能够区分瘦体组织与脂肪组织，这在生物医学研究中具有显著优势，尤其适用于小型动物的转化医学研究。

摘要

骨骼肌的大小、质量和组成是研究代谢性疾病和肌肉相关疾病的关键属性，因为它们直接影响对疾病进展和治疗效果的理解。在代谢、生理学、药理学和衰老科学研究中，量化活体动物的瘦体质量、脂肪组织和骨骼质量具有重要意义。然而，由于传统评估技术存在固有局限性，获取准确的身体成分测量结果（尤其是瘦体质量）仍然具有挑战性。微型计算机断层扫描（micro-CT）是一种非侵入性放射学技术，可实现对小型动物模型内部结构的高分辨率可视化。标准化的micro-CT方法能够显著增强转化研究的可靠性与影响力，特别是在衰老研究或对同一动物在不同时间点进行观察时。尽管该技术潜力巨大，但图像采集和分析方法缺乏标准化，严重阻碍了不同研究之间结果的可比性。本文提出了一种全面、详细且低成本的基于micro-CT的瘦体质量分析方案，以应对上述挑战，并促进涉及小型动物模型的研究中方法的一致性。

引言

大小、质量和组成是研究肌肉相关及代谢疾病机制的关键骨骼肌特性1。肌肉减少症、恶病质、萎缩和肌病具有共同的表型：质量减少、组成改变以及肌肉功能受损2,3,4,5。然而，在活体动物中定量身体组成仍然极为复杂且在技术上具有挑战性6。

主要方法包括 体内 成像和体成分分析的主要方法包括双能X射线吸收测定法（DXA）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）。这些方法主要用于筛查和监测导致瘦体质量减少的疾病。7,8,9,10,11DXA 由于成本较低，是身体成分分析的金标准。然而，与 MRI 和 CT 相比，DXA 存在一个显著缺点：无法在空间上区分肌肉组织和脂肪组织1.

磁共振成像（MRI）利用强磁场和射频波生成人体内部结构的详细图像12。与CT相比，其主要优势之一是具有更高的对比度分辨率，能够清晰区分不同类型的软组织1,13,14。与CT不同，MRI不使用电离辐射，因此可重复使用时更安全15,16。然而，MRI成本更高且可及性较低，扫描时间更长，维护费用也更高13,17。因此，用于小型动物分析的MRI设备通常不易获得。

微型计算机断层扫描（Micro-CT）与常规CT类似，但专为小尺度结构和生物医学研究而设计18。Micro-CT是一种先进的无创性影像评估技术，可实现对小型动物模型内部结构的精细可视化。该技术利用X射线生成机体内部结构的高分辨率图像，其原理基于不同组织类型对X射线的差异性衰减。在Micro-CT扫描过程中，小鼠平躺在一张缓慢穿过环形机架的载物台上。机架内部的X射线管围绕小鼠旋转，并从多个角度发射X射线，对侧的探测器则接收穿透机体后的X射线信号18。

显微CT扫描仪的软件通过处理来自多个角度的数据，重建出生物体的二维横截面图像（切片）。通过重建，这些切片可被组合起来，全面呈现内部解剖结构19。显微CT扫描生成的图像基于体内不同组织对X射线衰减程度的差异。这种衰减通过亨氏单位（Hounsfield Units, HU）进行量化，该单位是一种标准化放射密度的标度20,21。HU标度对于图像分割至关重要，因为每种结构具有略微不同的HU值。

在本文中，我们使用 HU 值准确区分骨组织、瘦组织和脂肪组织1。通过参考已确立的 HU 范围，我们确保了对身体成分的精确分析与比较。本文展示了如何使用微型 CT 获取图像，并阐述其在可视化和定量分析瘦组织、脂肪及骨骼质量中的应用。

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方案

所有方法均经里约热内卢联邦大学（Universidade Federal do Rio de Janeiro，UFRJ）机构动物护理与使用委员会（IACUC - UFRJ；批准号：A16/23-025-20）批准。扫描实验在6个月和22个月大的雄性C57BL/6小鼠上进行。

1. 动物准备

  1. 使用异氟烷（2%）与氧气混合气体，通过蒸发器对小鼠进行麻醉。诱导和维持麻醉时均使用精密蒸发器，氧气浓度为100%。
  2. 将麻醉后的小鼠仰卧位固定在micro-CT扫描仪的小鼠床中，用胶带固定小鼠以减少扫描过程中的移动，然后将其插入扫描架中。
  3. 在整个实验过程中（持续约10分钟），确保小鼠佩戴面罩，以维持麻醉状态，并根据需要给予维持剂量的麻醉剂。

2. 图像采集与重建

  1. 使用高分辨率小动物成像系统获取身体的显微CT扫描图像。共采集 1,024 个投影 与一个 曝光时间 的 470 ms 每个，使用一个 果蝇模式旋转 在 电压 的 60 kV 和一个 电流 的 480 µA. 将系统设置为 1.25 倍放大，从而导致一个 94.72 mm 视场 （视野，FOV），总采集时间为8.02分钟。使用显微镜采集图像 分箱 的 1 × 1，从而实现分辨率 2,368 x 2,240 像素.
    注意：本研究中用于获取显微CT图像的设备由于与麻醉面罩存在重叠，难以获得头部图像；此外，无法完整捕捉整个尾部长度。因此，我们排除了头部和尾部分析（见第3节）。
  2. 使用相同的参数对一个丙烯酸圆柱体模（直径：2.5 cm，长度：11.5 cm）进行扫描，该模体半充满蒸馏水，以确定空气和水的HU值。完成数据采集后，使用采集软件并采用针对噪声抑制优化的设置及滤波反投影（Filtered Back Projection, FBP）算法重建图像。使用相同的重建参数批量重建动物和模体图像 147 µm 各向同性体素尺寸 和一个 640 矩阵.
  3. 使用参考软件从模体（原始数据）中提取空气和水的HU值。将图像转换为DICOM文件，并校正HU值。

3. 图像分析

  1. 上传文件
    注意：显微CT（Micro-CT）是一种在时间和空间上捕捉图像的技术，生成一系列图像。因此，必须打开整个文件夹，而非单个图像。
    1. 在界面左上角区域，找到以灰蓝色突出显示的 3D Slicer 菜单，点击 添加数据（figure-protocol-1）。
    2. 当出现包含两个选项的窗口时，选择第一个选项：选择要添加的目录。
    3. 导航至包含目标动物DICOM图像序列的文件夹并点击该文件夹。此操作将在软件中打开该文件夹，使所有图像可同时显示。
    4. 观察在三个屏幕上显示的图像。每个屏幕代表不同的解剖平面：冠状面（绿色）、矢状面（黄色）和横断面（红色）。
  2. 图像分割
    1. 在顶部标签栏（模块）中找到 分割编辑器（figure-protocol-2），并点击进入。
    2. 点击绿色的 + 添加 按钮以创建分割区域，并定义HU范围。
    3. 分别点击3次，为骨组织、瘦体组织和脂肪组织创建分割区域。
    4. 双击每个分割区域，根据需要设置其名称和颜色。
    5. 使用窗口左侧的 阈值 功能设置每个分割区域的HU范围。找到 阈值范围 功能（figure-protocol-3），输入各组织类型的HU值：瘦体组织（-29 至 225 HU）；脂肪组织（-190 至 -30 HU）；骨组织（500 至 5,000 HU）。点击 应用 按钮。
      注意：HU值比较请参见 补充图S1。
    6. 对每种组织类型重复上述分割过程。
    7. 点击 显示3D 以生成三维重建图像。
      注意：三维重建图像将显示在屏幕的蓝色象限中。
  3. 图像清理
    注意：完成分割与三维重建后，必须排除多余物体，以确保其不被纳入瘦体组织、脂肪组织和骨骼的体积测量中。去除这些伪影对于保证分析准确性至关重要。
    1. 在 分割 菜单中找到“剪刀”工具（figure-protocol-4）。
    2. 选择解剖平面或三维重建图像，以便更清晰地观察需移除的物体。
      1. 若使用解剖平面，点击该平面彩色栏上的 最大化视图 按钮（figure-protocol-5）。在解剖平面窗口内，使用鼠标滚轮前后浏览CT扫描图像。
        注意：每个窗口可独立滚动。
      2. 对于三维重建图像，使用鼠标左键沿任意轴旋转，右键进行缩放。
        注意：键盘上的方向键也可用于旋转图像。
    3. 选中 剪刀 工具后，高亮标记不需要物体周围的分割区域并将其圈出，软件将自动删除该物体。
      注意：请确保选择的操作为 擦除内部。如果所用设备生成了非生物性物体的图像（如标记珠、麻醉剂或手术器械），必须将其移除。此外，若某些解剖区域未完整获取，则必须建立解剖参照，以去除未完全获取的区域，确保实验间的可重复性。所有平面中均需移除不需要的物体。
    4. 点击 恢复视图布局图标（figure-protocol-6），无论当前处于哪个窗口，均可返回至四窗口显示界面。
    5. 在所有需要移除物体的窗口中重复此过程。
  4. 分割体积计算
    1. 完成分割后，使用下拉菜单中的 量化 功能对各分割区域的体积进行定量。
      注意：执行此操作时，所有分割区域必须可见。
    2. 进入 量化 | 分割统计，点击 应用，等待软件生成显示各分割区域数值的表格。软件为每个分割区域提供两个体积值：标签图（LM）和闭合表面（CS）。
      注意：LM值通常适用于通过体素数量乘以单个体素体积来计算分割体积；CS值基于平滑表面模型，利用三角形表面单元积分计算体积，更贴近解剖轮廓，推荐用于精确测量。
    3. 如需上传新动物的数据，请在 文件 菜单中保存并关闭当前场景。
  5. 身体成分分析
    1. 使用软件提供的以 cm3 为单位的体积测量值，将其转换为组织质量，并为每种组织类型应用相应的密度。采用国际辐射单位与测量委员会（ICRU）规定的组织密度22：0.95 g/cm³（脂肪组织）、1.05 g/cm³（瘦体组织）和1.92 g/cm³（骨骼组织）2。
      1. 计算组织质量时，将软件获得的体积（cm³）乘以相应组织的密度（g/cm³）：
        脂肪组织质量：Volumesegmentation × 0.95 = Massadipose
        瘦体组织质量：Volumesegmentation × 1.05 = Masslean
        骨骼组织质量：Volumesegmentation × 1.92 = Massskeletal
        ​总质量：Massadipose + Masslean + Massskeletal = MassTotal
  6. 骨长度测量
    注意：为进行某些分析，需根据骨长度校正组织质量，因此必须获取特定骨的长度。
    1. 返回 分割编辑器 菜单。通过点击各分割区域旁的眼睛图标（figure-protocol-7），隐藏脂肪组织和瘦体组织的分割区域。
      注意：仅保留骨骼组织对应的分割区域可见。
    2. 在主菜单右上角选择 切换标记/工具栏（figure-protocol-8），将在主菜单下方打开一个次级菜单。找到 创建新线段 按钮（figure-protocol-9）。
    3. 点击 创建新线段 按钮后，进入三维重建图像，识别待测量的骨骼。
      注意：推荐测量胫骨或股骨22。
    4. 确定骨骼后，在骨骼一端左键点击一次，再在另一端点击一次。此操作将使软件计算骨的长度。
      注意：为保证测量一致性，应对每只动物选择相同的解剖位置。例如，以股骨头为一端，股骨外侧髁为另一端。
  7. 数据分析与归一化
    注意：质量数据可按第3.5节所述方式获取并直接使用，也可通过两种方式对瘦体、脂肪和骨质量进行归一化处理。
    1. 计算组织质量与动物在成像当日体重之间的比值。
      ​体重归一化：Masslean ÷ 体重
    2. 计算质量与骨尺寸（例如股骨或胫骨）之间的比值。
      股骨归一化：Masslean ÷ Sizefemur
      胫骨归一化：Masslean ÷ Sizetibia
      注意：归一化参数的选择取决于实验问题。若预期骨尺寸发生变化（例如比较骨重塑时），建议采用体重归一化（第3.7.1项）；若实验问题中预期体重发生变化，则建议采用长骨尺寸作为归一化参数（第3.7.2项）。

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结果

将麻醉后的动物在成像平台上进行正确的解剖学定位，可确保扫描结果的一致性和可重复性，从而凸显数据采集在获得可靠结果方面的有效性。在整个成像过程中，对动物实施适当的麻醉，包括使用专用的气体输送系统和挥发性麻醉剂蒸发器，是实现精确解剖学评估的基础（图1）。

图2 展示了在不同解剖平面上的分割与重建结果，呈现了冠状面、矢状面和横断面的连续图像。这些图像显示了骨骼组织、脂肪组织和瘦组织逐步分割的过程，最终得到整合所有组织类型的完整分割图像，清晰地区分了不同组织，并根据识别出的组织类型展示了特定区域的标记。尽管设备限制导致无法进行全身扫描，该方法仍可在多个解剖平面上提供有关组织分布与组成的详细信息。

图3 展示了强调不同组织类型的三维重建图像——骨骼（蓝色）、脂肪组织（黄色）和瘦组织（红色），提供了对解剖结构的全面可视化。该可视化结果凸显了本...

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讨论

通过断层扫描进行评估是一种获取详细身体成分信息的有效且非侵入性方法。特别是微型计算机断层扫描（micro-CT），可为临床前研究提供有价值的结局指标。在骨骼研究领域，micro-CT 具有多种用途，其中分析骨微结构23和骨重塑过程24尤为引人关注。评估生物内部结构的形态在生物医学研究中同样具有重要意义，例如通过分析特定组织中血管系统的密度，可评估其功能并推断代谢状态25。在脂肪组织的内分泌与代谢研究中，micro-CT 能够在活体小型动物中提供基础性信息26,27。此外，micro-CT 还可应用于其他领域，如动物学和植物学，用于评估小型昆虫和植物的结构28,29。

显微CT的一个显著局限性是高昂的成本以及图...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本研究由里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究支持基金会（FAPERJ；E-26/010.002643/2019 和 E-26/201.335/2022）、巴西高等教育人员提升协调办公室（CAPES）-001 资助代码、里约热内卢联邦大学机构科研启动奖学金计划以及国家科学技术发展理事会（CNPq；FFB：001.306236/2022-2 TMO-C：309339/2023-5）资助。作者感谢里约热内卢联邦大学国家结构生物学与生物成像中心（CENABIO）提供设施使用支持，特别是小型动物影像单元（UIPA）的 microPET/SPECT/CT 平台。补充 图 S1 使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3DSlicer，版本 5.6.23D Slicer 平台一款用于图像分析和科学可视化的免费开源软件。
Amide，版本 1.0.1Amide 平台一款免费开源软件，用于校正处理后的 DICOM 图像中的亨氏单位（Hounsfield Unit）值。
Amira，版本 4.1Thermo Fisher Scientific用于从模体的原始数据中提取空气和水的亨氏单位值，并将图像转换为 DICOM 文件。
IsoforineCristália异氟烷是一种不可燃的液态麻醉剂，通过汽化用于全身吸入麻醉。
Triumph XO 子系统Gamma Medica-Ideas Flex专为临床前小动物成像设计的先进成像子系统，提供高分辨率的 CT 和 PET 功能，适用于定性和定量分析。

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