使用显微计算机断层扫描对小动物进行无创骨骼肌量化

摘要

该协议使用显微计算机断层扫描来经济高效地量化瘦体重，包括小动物的骨骼肌和内脏组织、脂肪组织和骨骼组织。它区分瘦组织和脂肪组织，这为生物医学研究提供了显着优势，尤其是在小动物的转化研究中。

摘要

骨骼肌的大小、质量和组成是研究代谢和肌肉相关疾病的关键特性，因为它们直接影响对疾病进展和治疗结果的理解。量化活体动物的瘦肉、脂肪和骨骼质量在代谢学、生理学、药理学和老年科学研究中非常重要。然而，由于传统评估技术的固有局限性，获得准确的身体成分测量，尤其是瘦体重，仍然具有挑战性。显微计算机断层扫描 （micro-CT） 是一种无创放射技术，可在小动物模型中实现内部结构的高分辨率可视化。标准化的显微 CT 方法可以显着增强转化研究，获得更可靠和有影响力的结果，尤其是在衰老研究期间或在同一动物的不同时间点。尽管具有潜力，但图像采集和分析方法缺乏标准化严重阻碍了不同研究之间结果的可比性。在此，我们提出了一种全面而详细的低成本方案，用于使用 micro-CT 进行精益质量分析，以应对这些挑战并促进涉及小动物模型的研究的一致性。

引言

大小、质量和组成是研究肌肉相关和代谢疾病机制的关键骨骼肌特性¹。肌肉减少症、恶病质、萎缩和肌病具有共同的表型:质量减少、成分改变和肌肉功能受损 2,3,4,5。然而，量化活体动物的身体成分仍然非常复杂且技术上具有挑战性⁶。

体内成像和身体成分分析的主要方法是双能 X 射线吸收测定法 （DXA）、计算机断层扫描 （CT） 和磁共振成像 （MRI）。这些方法主要用于筛选和监测导致瘦体重减少的疾病 7,8,9,10,11。DXA 成本较低，因此是人体成分分析的黄金标准。然而，与 MRI 和 CT 相比，DXA 有一个明显的缺点:它无法在空间上分辨肌肉和脂肪组织¹。

MRI 使用强磁场和无线电波来生成身体内部结构的详细图像¹²。与 CT 相比，它的主要优势之一是其卓越的对比分辨率，可以很好地区分不同的软组织类型 ^1,13,14。与 CT 不同，MRI 不使用电离辐射，因此重复使用更安全^15,16。然而，MRI 更昂贵且更难获得，扫描时间更长，维护成本更高^13,17。因此，通常无法获得适用于小动物分析的 MRI 仪器。

显微 CT 类似于传统 CT，但专为小结构和生物医学研究量身定制¹⁸。显微 CT 是一种先进的非侵入性放射学评估技术，能够详细观察小动物模型的内部结构。显微 CT 使用 X 射线创建身体内部结构的详细图像，依赖于各种组织类型对 X 射线的差异衰减。在显微 CT 扫描期间，鼠标躺在桌子上，该桌子在圆形机架中缓慢移动。在机架内部，X 射线管围绕鼠标旋转，从各个角度发射 X 射线。对侧的探测器在这些 X 射线穿过身体后捕获它们¹⁸。

micro-CT 扫描仪的软件处理来自这些多个角度的数据，以重建身体的二维横截面图像（切片）。通过重建，这些切片可以组合起来全面表示内部解剖结构¹⁹。显微 CT 扫描产生的图像基于体内不同组织不同程度的 X 射线衰减。这种衰减使用 Hounsfield 单位 （胡） 进行量化，该尺度将辐射密度^{标准化为 20,21}。胡 尺度是分割的基础，因为每个结构的值略有不同。

在本文中，我们使用 胡 值来准确区分骨骼、瘦组织和脂肪组织¹。通过参考已建立的 胡 范围，我们确保了对身体成分的精确分析和比较。在此，我们演示了如何使用显微 CT 获取图像及其在可视化和量化瘦、脂肪和骨骼质量方面的应用。

方案

所有方法均已获得里约热内卢联邦大学 （UFRJ） 机构动物护理和使用委员会的批准 （IACUC - UFRJ;A16/23-025-20）。对 6 个月和 22 月龄的雄性 C57BL/6 小鼠进行扫描。

1. 动物准备

1. 使用通过汽化输送的氧气混合物中的 2% 异氟醚麻醉小鼠。使用精密蒸发器进行诱导和维持，并使用精密蒸发器使用 100% 氧气的混合物。
2. 使用鼠标床将麻醉的动物仰卧在显微 CT 扫描上。用胶带固定鼠标，以尽量减少扫描过程中的移动，然后将其插入机架。
3. 在整个实验过程中，持续约 10 分钟，确保动物戴上口罩以将其保持在麻醉平面下，同时根据需要接受维持剂量。

2. 图像采集和重建

1. 使用高分辨率临床前成像系统获取身体显微 CT 扫描。使用 60 kV 电压和 480 μA 电流的飞行模式旋转，捕获总共 1,024 个投影，每个投影的曝光时间为 470 毫秒。将系统设置为 1.25 放大倍率，产生 94.72 毫米的视野 （FOV），总采集时间为 8.02 分钟。以 1 x 1 的像素合并捕获图像，从而获得 2,368 x 2,240 像素的分辨率。
   注意:由于与麻醉面罩重叠，本手稿中用于显微 CT 图像的设备在获取头部图像方面存在限制。此外，不会捕获整个尾部长度。因此，我们排除了头和尾分析（见第 3 节）。
2. 在半装满蒸馏水的亚克力圆柱形模型（直径:2.5 厘米，长度:11.5 厘米）上以相同的参数执行扫描，以确定空气和水的 胡。采集完成后，使用采集软件重建图像，该软件具有针对降噪和过滤反向投影 （FBP） 算法优化的设置。使用 147 μm 各向同性体素大小 和 640 矩阵批量重建动物和幻影图像。
3. 使用参考软件从模型（原始数据）中提取空气和水 胡。将图像转换为 DICOM 文件并更正 胡 值。

3. 图像分析

1. 上传文件
   注意:显微 CT 是一种在时间和空间上捕获图像并生成图像序列的技术。因此，有必要打开整个文件夹而不是单个图像。
   1. 在界面的左上角区域，找到 3D 切片器菜单，以灰蓝色突出显示。单击 Add Data （添加数据） 。
   2. 当出现包含两个选项的窗口时，选择第一个选项: Choose Directory to Add.
   3. 导航到包含目标动物 DICOM 图像系列的文件夹，然后单击它。此作将打开软件中的文件夹，允许同时查看所有图像。
   4. 观察三个屏幕上显示的图像。每个屏幕代表一个不同的解剖平面:冠状面、矢状面和横向，分别由绿色、黄色和红色标识。
2. 分割
   1. 找到 Segment Editor （） 在上方选项卡（Modules）中，然后单击它。
   2. 单击绿色的 + 添加 按钮创建区段，定义 胡 范围。
   3. 为骨骼、瘦组织和脂肪组织创建分段，每个分段单击 3 次。
   4. 双击每个区段以根据所需的设置对其进行命名和着色。
   5. 使用位于窗口左侧的 阈值 功能设置每个分段的 胡 范围。为此，请找到 阈值范围 函数 并输入每种组织类型的 胡 值:瘦组织（-29 至 225 胡）;脂肪组织（-190 至 -30 胡）;骨骼（500 至 5,000 胡）。单击 Apply 按钮。
      注意:有关 胡 值比较，请参阅 补充图 S1 。
   6. 对每种组织类型重复分割过程。
   7. 单击 Show 3D 以生成 3D 渲染。
      注意:渲染将显示在显示屏的蓝色象限中。
3. 清理图像
   注意:在分割和 3D 渲染后，必须排除无关的项目，以确保它们不包括在瘦组织、脂肪组织和骨骼的体积测量中。去除这些伪影对于确保准确分析至关重要。
   1. 在 Segmentation 菜单中找到 "Scissors" 工具 （）。
   2. 选择解剖平面或 3D 渲染，以获得要移除的物体的更清晰视图。
      1. 如果使用解剖平面，请单击平面彩色条上的 最大化视图 按钮 （）。在解剖平面窗口内，使用鼠标滚动按钮在 CT 扫描中向前或向后导航。
         注意:每个窗口都可以独立滚动。
      2. 对于 3D 渲染，使用鼠标左键沿任意轴旋转，使用鼠标右键放大。
         注意:键盘上的箭头键也可以旋转图像。
   3. 选择 剪刀 工具后，突出显示不需要的对象周围的分割并将其包围以将其从图像中删除。软件会自动删除对象。
      注意:确保已选择作 Erase Inside 。如果使用的设备生成任何非生物图像的图像，例如磁珠、麻醉剂或手术设备，请务必将其移除。此外，如果未完全获得任何解剖区域，则必须建立解剖参考以去除这些未完全获得的区域，以确保实验之间的可重复性。必须在每个平面中删除不需要的对象。
   4. 单击 restore view layout（恢复视图布局）图标 （） 可返回到包含四个窗口的屏幕，而不管选择了哪个窗口。
   5. 对需要删除对象的所有窗口重复此过程。
4. 分段量
   1. 分割后，使用下拉菜单中的 量化 函数量化区段的体积。
      注意: 此作的所有分段都必须可见。
   2. 导航到 Quantification |Segment Statistics （区段统计信息）。单击 Apply，然后等待软件生成一个表格，显示每个分段的值。该软件为每个分割提供两个体积值:Labelmap （LM） 和 Closed Surface （CS）。
      注意:LM 值通常适用于计算分段体积，方法是使用体素数乘以单个体素的体积。CS Value 利用平滑表面模型，并基于三角形表面单元对体积进行积分。CS 与解剖轮廓更紧密对齐，推荐用于准确测量。
   3. 要上传来自新动物的数据，请在 文件 菜单中保存并关闭场景。
5. 体成分分析
   1. 使用软件提供的体积测量值（以 cm³ 为单位）将这些体积转换为组织质量，并为每种组织类型应用适当的密度。使用国际辐射单位和测量委员会²² 规定的以下组织密度:0.95 g/cm³（脂肪组织）、1.05 g/cm³（瘦组织）和 1.92 g/cm³（骨骼组织）²。
      1. 要计算组织质量，请将从软件获得的体积 （cm³） 乘以相应的组织密度 （g/cm³）:
         脂肪组织质量:体积_分割 X 0.95 = 质量_脂肪
         瘦组织质量:体积_分割 X 1.05 =_质量稀薄
         骨骼组织质量:体积_分割 X 1.92_{= 骨骼质量}
         总质量_{:脂肪质量 + 瘦体重 + 骨骼质量} =_总质量
6. 骨长测量
   注意:要通过骨长校正组织质量以进行某些分析，必须获得特定的骨长。
   1. 返回到 Segment Editor 菜单。通过单击每个部分旁边的眼睛图标 （） 来隐藏脂肪组织和瘦组织分割。
      注意:只有与骨骼组织相对应的分割应保持可见。
   2. 选择主菜单右上角的 Toggle Markups/Toolbar （） 选项。这将在主菜单正下方打开一个辅助菜单。找到 create new line 按钮 （）。
   3. 单击 创建新线 按钮后，导航到 3D 重建并确定要测量的骨骼。
      注意:推荐的骨骼是胫骨或股骨²²。
   4. 识别出骨骼后，左键单击骨骼的一端，然后再次左键单击组织的另一端。此作允许软件计算骨骼大小。
      注意:为了获得一致的测量结果，请为每只动物选择相同的骨骼解剖区域。例如，股骨头用作股骨的一端，外侧髁用作股骨的另一端。
7. 数据分析和标准化
   注意:质量数据可以按照第 3.5 节中的说明获得，并按原样使用。或者，瘦、脂肪和骨量可以通过两种方式标准化。
   1. 计算获得图像当天组织质量与动物体重之间的比率。
      体重标准化:体重_瘦 ÷体重
   2. 计算质量和骨骼大小（例如，股骨或胫骨）之间的比率。
      股骨标准化:_股骨粗_瘦÷股骨大小
      胫骨正常化:_胫骨粗_瘦÷大小
      注意:归一化参数是根据实验问题选择的。如果预期骨骼大小会发生变化（例如:比较骨骼重塑时），建议按体重进行标准化（第 3.7.1 项）。此外，如果您的实验问题中预计体重会发生变化，则长骨大小是建议的标准化参数（第 3.7.2 项）。

结果

镇静动物在成像台上的正确解剖位置可确保一致且可重复的扫描结果，突出了数据采集在获得可靠结果方面的有效性。在整个成像过程中，适当的动物镇静剂，包括专门的气体输送系统和蒸发器，是精确解剖学评估的基础（图 1）。

图 2 说明了不同解剖平面中的分割和渲染，在冠状面、矢状面和横向平面上呈现了连续图像。这些图像展示了骨骼、脂肪和瘦组织的逐渐分割，最终形成整合了所有组织类型的彻底分割表示，突出了组织之间的明确区别，并展示了基于已识别组织类型的区域特异性标记。尽管设备限制排除了全身捕获，但该方法提供了有关各个解剖平面上组织分布和组成的详细信息。

图 3 展示了 3D 渲染图，强调了组织类型——骨骼（蓝色）、脂肪组织（黄色）和瘦组织（红色），提供了解剖结构的全面可视化。这种可视化强调了该方案在生成对解剖学研究至关重要的详细 3D 模型方面的有效性。

表 1 详细说明了成像日相对于动物体重的标准化组织质量（瘦体重、体脂和骨骼质量）。所示值是将组织体积（以 cm³ 为单位）乘以相应的组织密度得出的，如方法的步骤 3.5.1.1 中所述。

表 2 提供了绝对的身体成分值，显示了每只动物的质量分布和瘦肉、体脂和骨骼组织百分比。它使我们能够评估每种组织类型的总量以及它对每个样本的整体身体成分的贡献。

补充表 S1 显示了每个分析人员完成每只动物的身体成分分析所需的时间以及不同分析人员结果的可变性。它评估有经验的作员（分析师 1、2 和 5）和没有经验的作员（分析师 3 和 4）在测量瘦体重、体脂量和骨骼量等身体成分指标方面是否存在显著差异。

图 4 显示了成人和老年受试者之间的身体成分比较分析。它揭示了瘦体重百分比的降低和体脂的增加，这与典型的衰老模式一致。这些发现共同强调了成像方案在提供关键解剖数据方面的稳健性和精确性，这对于推进临床前研究方法至关重要。

图 1:动物准备。 （A） 在整个成像过程中用于动物镇静的设备，例如气体输送系统和蒸发器;（B） 显微 CT 扫描系统。（C） 被麻醉的动物仰卧在老鼠床上。正确的定位对于获得一致且可重复的结果至关重要。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:不同解剖平面中切片的分割和可视化。 （A） 冠状面，（B） 矢状面，和 （C） 横向平面。图像从左到右分别显示了未分割的扫描（灰色）、骨骼分割（蓝色）、体脂分割（黄色）、瘦组织分割（红色），最后是完整的分割，包括所有分割。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:3D 渲染。 从左到右，图像显示了主体的 3D 渲染，突出了不同的组织类型:蓝色为骨骼，黄色为体脂，红色为瘦组织，最终图像显示了骨骼、脂肪组织和瘦组织的综合视图。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:成年和老年小鼠的身体成分比较。 条形图说明了骨骼组织（成人:10.5 ± 0.5%;老年人:9.9 ± 1.0%，p = 0.19）、体脂（成人:17.2 ± 5.7%;老年人:27.9 ± 4.4%，p = 0.03）和瘦体重（成人:72.3 ± 5.7%;老年人:62.3 ± 3.6%，p = 0.03）的身体成分百分比。数据以动物的 MEAN ± SD 表示 （成年:n = 3;老年人:n = 3）。使用单尾 p 值 （* p < 0.05） 的未配对 t 检验计算统计数据。请单击此处查看此图的较大版本。

瘦
动物 ID	瘦体重 （g）	重量 （g）	归一化（权重）
老年人 1	15.1	37.4	0.4
老年人 2	14.4	44.4	0.3
老年人 3	14.3	37.7	0.4
成人 1	12.3	29.1	0.4
成人 2	16.5	30.4	0.5
成人 3	16.1	31.7	0.5
体脂
动物 ID	体脂量 （g）	重量 （g）	归一化（权重）
老年人 1	6.4	37.4	0.2
老年人 2	8.2	44.4	0.2
老年人 3	5.3	37.7	0.1
成人 1	4.4	29.1	0.2
成人 2	2.7	30.4	0.1
成人 3	3.4	31.7	0.1
骨骼的
动物 ID	骨骼质量 （g）	重量 （g）	归一化（权重）
老年人 1	2.3	37.4	0.06
老年人 2	2.3	44.4	0.05
老年人 3	2.4	37.7	0.06
成人 1	2.0	29.1	0.07
成人 2	2.3	30.4	0.08
成人 3	2.2	31.7	0.07

表 1:成像当天按动物体重对质量进行标准化。 如第 3.7 节所述，组织的质量可以通过检查当天动物的体重来标准化。这种标准化已根据动物的体重应用于瘦、脂肪和骨骼组织。

身体成分 （g）
	细分量 X 1.05	细分量 x 0.95	细分量 x 1.92	瘦 + 脂肪 + 骨骼
动物 ID	瘦体重 （g）	体脂量 （g）	骨骼质量 （g）	总质量 （g）
老年人 1	15.1	6.4	2.3	23.8
老年人 2	14.3	8.2	2.3	24.9
老年人 3	14.3	5.3	2.4	22.0
成人 1	12.3	4.4	2.0	18.6
成人 2	16.5	2.7	2.3	21.5
成人 3	16.1	3.4	2.2	21.7
身体成分 （%）
动物 ID	瘦体重 （%）	体脂量 （%）	骨骼质量 （%）	总质量 （%）
老年人 1	63.6	26.8	9.6	100
老年人 2	58.1	32.8	9.0	100
老年人 3	64.9	24.1	11.0	100
成人 1	65.9	23.5	10.6	100
成人 2	76.8	12.4	10.9	100
成人 3	74.3	15.7	9.9	100

表 2:身体成分。 （A） 动物的身体成分（克）;（B） 身体成分的百分比。

补充表 S1:由不同作员评估的身体成分。 记录每次评估的瘦体重、体脂量、骨骼量和分析时间（以分钟为单位）。分析师 1、2 和 5 是经验丰富的作员，而分析师 3 和 4 缺乏经验，仅遵循研究中描述的方案。 请点击此处下载此文件。

补充图 S1:不同生物和非生物材料的密度范围。 该图说明了各种生物组织和非生物物质的密度范围。这些值是从文献中获得的，并进行调整以实现最佳组织分化。骨骼的密度最高，其次是瘦组织，而体脂的密度明显较低。该装置以水为参考，密度为 0 进行校准。 请点击此处下载此文件。

讨论

通过断层扫描进行评估是获取详细身体成分信息的有效且非侵入性的方法。特别是 Micro-CT，为临床前研究提供了有价值的结果测量。在骨领域，显微 CT 有不同的用途，因为分析微结构²³ 和骨重塑²⁴ 特别有趣。评估内部生物结构的形态与生物医学研究也有关，因为分析特定组织中脉管系统的密度可以评估其功能并推断代谢²⁵。对于脂肪块的内分泌和代谢研究，使用显微 CT 为活体小动物提供了基本信息^26,27。此外，micro-CT 可应用于其他领域，例如动物学和植物学，用于评估小昆虫和植物的结构^28,29。

显微 CT 的一个重大限制是成本高且对图像分析软件的访问有限。此外，先前的解剖学知识，尤其是动物解剖学知识，对于正确测量至关重要。本手稿介绍了能够产生与商业替代品相当的结果的 3D 切片软件。该系统还减少了对广泛解剖学知识的要求，因为它是半自动^{的 30}。

通过显微 CT 获得并由软件分析的图像表明，小鼠的身体成分在衰老过程中遵循与人类相似的轨迹，其特征是脂肪组织总数增加，伴随着瘦体重的减少³¹。当将成年小鼠 （6 个月） 与老年小鼠 （22 个月） 进行比较时，这些发现很明显。

由于设备的限制，麻醉面罩会阻止头部采集。因此，我们无法捕获和准确分割整个头部。因此，我们建立了一个惯例，使用寰椎骨 （C1） 作为解剖参考点，将我们的分析重点放在此处使用的设备中低于该点的区域。因此，C1 上方的所有图像都被选中删除。该设备没有获得完整的尾部长度。因此，在所有分析中，尾部都从基部区域去除。我们建议用户为选定的排除区域建立解剖点，以保持实验之间的可重复性。

本文提出了一种使用可访问且经济高效的协议分析断层扫描图像的方法。该软件成功区分了三种组织类型:瘦块、脂肪组织和骨骼组织。然而，它无法区分骨骼肌和内脏器官，这是小鼠身体成分分析中的一个常见挑战。

显微 CT 缺乏区分内脏组织和骨骼肌质量的能力。尽管存在这一限制，但我们的结果证明了该软件在研究影响身体成分的疾病方面的价值，尤其是那些影响骨骼肌的疾病，如肥大或萎缩。它可以作为非侵入性测试重复进行，从而能够进行纵向体成分监测。这种能力有助于评估保护性治疗并制定对许多代谢疾病进行建模的方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3DSlicer，版本 5.6.2	3D 切片器平台		用于图像分析和科学可视化的免费开源软件。
Amide，版本 1.0.1	Amide 平台		一款免费的开源软件，用于校正已处理的 DICOM 图像中的 Hounsfield 单位值。
Amira，版本 4.1	Thermo Fisher Scientific		用于从模型的原始数据中提取空气和水 Hounsfield 单位值，并将图像转换为 DICOM 文件。
异甲醛	Cristá		Isoflurane 是一种不易燃的液体麻醉剂，用于汽化的一般吸入麻醉。
Triumph XO 子系统	Gamma Medica-Ideas Flex		Advanced 成像子系统专为临床前小动物成像而设计，为定量和定性分析提供高分辨率 CT 和 PET 功能。