尽管在治疗慢性伤口方面已付出大量努力，但成效仍然有限。目前对破坏正常愈合过程并导致慢性伤口发生与发展的细胞和分子机制尚不明确。因此，开发针对这些伤口的有效疗法一直面临挑战。这主要是因为缺乏能够模拟人类慢性伤口的动物模型，以及在患有慢性伤口的人体上进行实验的局限性。此前，我们发表了一种小鼠模型，用于研究与人类糖尿病慢性伤口具有诸多相似特征的慢性伤口。该模型包含由皮肤微生物群和环境中天然存在的细菌自发形成的生物膜，无需向伤口中引入外源性细菌。因此，该模型有望推动对伤口如何转变为慢性状态的基础性理解。本文介绍了对该小鼠模型原始建模方案的更新。我们重点将小鼠的死亡率从约30%降低至约5%。同时，我们还阐述了如何利用该模型结合新一代转录组学方法，研究伤口慢性化的起始与进展过程，阐明感染及生物膜形成过程中细菌种群动态变化，并验证包括小分子在内的各类治疗方法的有效性。迄今为止，这是唯一一种在无干预情况下无法自愈的慢性伤口模型。
本文内容
摘要
方案
更新：
这是对先前所述方案的更新1
所有实验均按照联邦法规以及加州大学的政策和程序进行，并已获得加州大学河滨分校动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 动物
在步骤1.1中添加以下备注：
备注：若直接从供应商处购买纯合子糖尿病小鼠，应将小鼠饲养在常规动物房中，以允许正常皮肤菌群在皮肤上定植。可使用雄性和雌性小鼠。
在步骤 1.3 之后添加以下部分：
1.4. 进行基因分型
注意：在按照前述步骤繁殖动物至步骤1.3后，进行基因分型1。以下方案修改自先前发表的方法2。小鼠无论性别，均可在断奶时（最早14-21天）进行基因分型。
1.4.1. 粗DNA提取
1.4.1.1. 采集小鼠耳部穿孔活检样本，并将组织样本放入微量离心管中。
1.4.1.2. 加入 180 µL 的 50 mM NaOH，确保样品完全浸没。
在95 °C下孵育样品10分钟，每5分钟减压并涡旋振荡试管一次。
1.4.1.4. 将样品置于冰上冷却至少 1 分钟。
1.4.1.5. 加入 20 µL pH 8.0 的 1 M Tris HCl，涡旋混匀。
1.4.1.6. 将样品储存于 -20 °C，直至使用。
1.4.2. 聚合酶链式反应
1.4.2.1 在微量离心管中配制以下引物混合物（引物列表）。
注意：引物扩增 LepR 点突变位点周围的区域。
1.4.2.2. 在PCR管中配制20 µL的聚合酶链式反应体系。加入10 µL的2×Taq聚合酶预混液（包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2和KCl），1 µL引物混合液（见引物列表），4 µL粗DNA提取物，以及5 µL H2O。
1.4.2.3. 设置热循环参数如下：94 °C 预变性 2 min；40 个循环，分别为 97 °C 变性 30 s、52 °C 退火 45 s、72 °C 延伸 45 s；然后 72 °C 延伸 2 min，最后 10 °C 无限保温。
1.4.2.4. PCR 完成后，向 PCR 产物中加入 4 µL 的 6x DNA 上样缓冲液，并在 2% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离（图 1）。
注意：每个 PCR 反应产生 3 个 PCR 产物：610 bp 的共有序列产物、406 bp 的突变型 T 等位基因产物和 264 bp 的野生型 G 等位基因产物。野生型基因型包含 610 bp 和 264 bp 的产物，杂合型基因型包含全部三个产物，而 db/db 基因型则包含 610 bp 和 406 bp 的产物。
2. 动物饲养设施与饲养管理
将步骤 2.1 替换为以下步骤及说明：
2.1 房屋 db/db 在传统动物房（非屏障/无特定病原体设施）中饲养小鼠，以使微生物群能够在皮肤上定植 db/db 小鼠。为了特异性地模拟患有慢性伤口的人类，在饲养过程中无需采取特殊措施来防止小鼠接触其生活环境中的天然病原体，因为更严格的屏障环境洁净条件可能导致研究所需的关键病原体丢失。
注意：由于这些小鼠体型较大且患有糖尿病，最好每笼饲养不超过3只 db/db 每笼饲养数量在用于慢性伤口实验前应保持一致。
慢性伤口形成的条件
在步骤 3.2 之后添加以下步骤
3.3. 始终使用透明薄膜敷料覆盖伤口，以避免伤口组织干燥。
5. 试剂配制
在步骤 5.2 之后添加以下说明
注意：仅可使用 材料表 中所列公司的 ATZ。其他公司的 ATZ 与此模型不兼容，会增加死亡率。
6. 手术
6.1. 治疗与麻醉
注意：以下描述了更新后的麻醉方案。
6.1.5. 在开放系统中，以 2–3.5 L/min 的流速通过 O2 输送 5% 异氟烷对小鼠进行麻醉诱导。持续监测小鼠的状态。
注意：当小鼠失去意识或不再活动后，将其放置在白色手术垫上，并将连接至麻醉机的鼻罩固定在小鼠头部，以便在手术期间持续给予异氟烷。
6.1.6. 在开放系统中，手术期间以相同的流速给予1%异氟烷，并调整异氟烷流量以维持麻醉深度。
6.3. 伤口处理
6.3.5. 在操作结束时停止向小鼠给予1%异氟烷。
7. 术后治疗与恢复
将原方案中的步骤7.1替换为以下 步骤和说明：
7.1. 手术后立即使用透明薄膜敷料，在手术后10分钟内，用胰岛素注射器将MSA通过针头穿透透明薄膜敷料，直接涂抹于小鼠背部创面顶部。使用无菌PBS溶液配制的150 mg/kg MSA。该浓度是基于此前详尽的文献检索所确定的3,4。
注意：若不持续震荡，MSA 容易发生沉淀。在将溶液施用于伤口前，需确保 MSA 已完全溶解，以向小鼠递送准确计算的剂量。
将原方案中的步骤 7.4 替换为以下步骤：
7.4. 手术后 6 小时给予第二剂 Buprenex。随后，在术后前 48 小时内，根据当地 IACUC 规定定期给药。
注意：不建议在此小鼠模型中使用需皮下注射的缓释型镇痛剂。脂质结合的丁丙诺啡可能悬浮于中链脂肪酸甘油三酯（MCT）油中。尽管 MCT 油的作用已在非常年幼的 db/db 小鼠中进行过测试，但其对年长或老年肥胖 db/db 小鼠的影响尚未经过验证5,6。考虑到小鼠的体重，伤口附近皮下注射大体积镇痛剂可能会显著影响伤口愈合以及慢性伤口启动与发展的细胞和分子过程。此外，这种止痛药会溶解于这些小鼠体内高水平的脂肪中，因此可能无法有效缓解疼痛，并可能产生毒性。
8. 数据收集、伤口处理后小鼠的管理、生存策略及额外提示
8.1 数据收集
在步骤 8.1.3 之后添加以下步骤。
8.1.4. 确保用于分析的组织仅包含对照伤口和慢性伤口创缘 2 mm 范围内的组织。可在应用 MSA 后 1-2 小时内通过切除方式采集伤口组织。
8.1.5. 使用无菌注射器穿刺透明薄膜敷料，收集伤口处积聚的过量液体或伤口渗出液。如需进行细菌学研究，则在 -20 °C 下保存；如需进行化学和分子学研究，则在 -80 °C 下保存。
8.1.6 若要在10天后收集包括生物膜在内的完整伤口组织，需先在伤口局部应用4% PFA的PBS溶液固定10分钟 ，然后用镊子和剪刀切除组织。取组织时，应额外保留5–10 mm的伤口边缘，以确保伤口组织周围有正常组织支撑。随后继续在4% PFA的PBS溶液中进行固定，并进行后续的洗涤及包埋前处理。
注意：术后10天的慢性伤口可能过于脆弱，无法用于组织学取材。
8.5. 生存策略
8.5.1. 提供额外的补水支持：观察小鼠是否出现嗜睡、不主动进食或饮水的情况，因为手术及慢性化过程会给小鼠带来应激。术后最初48-72小时内，可按每10克体重0.25 mL的剂量，皮下或腹腔注射温热（35-38 °C）的生理盐水。根据小鼠嗜睡程度，可能需要每天补充水分2-3次。此外，可将食物颗粒和水凝胶置于垫料中以便取用，但可能需要更频繁地更换笼具。
8.5.2. 提供额外保温支持：若将小鼠置于由循环水加热垫保温的笼盒中，术后存活率将显著提高（93 oC）手术后立即以及在动物饲养室期间。将笼子放置于1/2 以及 1/2 离开垫子，以便动物在过热时可以移开远离热源，而在感到寒冷时可以移动到垫子上方。
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结果
图1：基因分型以鉴定杂合子用于建立育种品系。该凝胶示例显示了8个未知小鼠样本的检测结果。样本2和5为杂合子，因其含有3条条带（610 bp、406 bp和264 bp）。样本1、3、4、6、7和8为野生型，因其仅含有2条条带（610 bp和264 bp）。请点击此处查看该图的放大版本。
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讨论
使用该慢性伤口模型的研究发现：
该模型已被用于开展多项研究，旨在阐明慢性伤口启动和进展过程中的细胞与分子机制。研究表明，通过抑制抗氧化酶，可在db/db小鼠中诱导形成慢性伤口。伤口最初含有多种微生物群落，随着时间推移，逐渐被特定的成膜细菌所取代。通过给予小鼠两种抗氧化剂可逆转其慢性状态：腹腔注射α- tocopherol，并将N-乙酰半胱氨酸局部应用于伤口。研究发现，经上述治疗后，氧化应激（OS）显著降低，生物膜对抗菌治疗的敏感性增加，并形成了具有正常胶原沉积与重塑的健康肉芽组织3。这些数据首次表明，慢性伤口可以被诱导产生并实现逆转，揭示了早期且持续存在的氧化还原失衡与生物膜共存，在伤口慢性化发展过程中的关键作用。
利用该小鼠模型，结合系统生物学方法，研究人员确定了慢性伤口启动过程中被激活的信号通路，以及这些通路在向完全慢性化进展过程中的动态变化7,
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 毫米耳标打孔器 | Fisherbrand | 13812201 | 2毫米孔径 |
| 3-氨基-1,2,4-三唑（ATZ） | TCI | A0432 | |
| 70% 乙醇 | |||
| Acu Punch 7毫米皮肤活检打孔器 | Acuderm Inc. | P750 | |
| 琼脂糖 | |||
| B6.BKS(D)-Leprdb/J | The Jackson Laboratory | 00697 | 可提供纯合子和杂合子 |
| Buprenex（盐酸丁丙诺啡） | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0.3 mg/ml，三类药品 |
| 上样缓冲液，紫色（6X） | New England Biolabs | B7024S | |
| 手套 | |||
| 含舒缓芦荟和羊毛脂的脱毛乳液 | Nair | 化学脱毛剂 | |
| 热疗（水）泵 HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| 加热垫 | Conair | 干湿两用加热垫 | |
| 软管接头 | Adroit MedicalSystems | ||
| 胰岛素注射器 | BD | 329461 | 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2") |
| 异氟烷 | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| 异氟烷蒸发器 | JA Baulch & Associates | ||
| Kimwipes 纸巾 | |||
| Maxi-Therm 高温-低温毯 | Cincinnati Sub-Zero | 货号 247 | 22”x30” 可重复使用重型垫 |
| 巯基琥珀酸（MSA） | Aldrich | 88460 | |
| 小鼠鼻罩 | |||
| 氧气 | 气罐必须与蒸发系统兼容 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 高压灭菌 | ||
| 锋利的手术剪刀 | |||
| 小型塑料容器 | |||
| 氢氧化钠 | |||
| Taq 2X 预混液 | New England Biolabs | M0270L | |
| Tegaderm | 3M | 货号：1624W | 透明薄膜敷料（6 cm x 7 cm） |
| 薄金属刮刀 | |||
| Tris-HCl | |||
| 管路 | |||
| 镊子 | |||
| Wahl 电动剪毛器 | Wahl | 锂离子专业款 |
参考文献
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
- Kim, J. H., et al. Targeting anaerobic respiration in Pseudomonas aeruginosa with chlorate improves healing of chronic wounds. Adv Wound Care. 13 (2), 53-69 (2024).
- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
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