本方案旨在将背腹侧融合类脑器官稳定接种于多电极阵列上，用于癫痫建模 体外.
本文内容
摘要
摘要
人脑类器官是由人多能干细胞（hPSCs）衍生的三维（3D）结构，能够模拟 胎儿大脑发育的若干方面。背侧与腹侧区域特化脑类器官的融合 体外 生成具有功能性整合微环路的类器官组装体，其中包含兴奋性和抑制性神经元。由于其结构复杂且神经元类型多样，类器官组装体已成为一种有用的工具 体外 研究异常网络活动的工具。多电极阵列（MEA）记录是一种在不破坏细胞膜完整性的前提下，从神经元群体中获取电场电位、动作电位及纵向网络动态的方法。然而，由于类组装体体积较大且与电极接触表面积有限，将其稳定贴附于电极表面以实现长期记录仍具挑战性。本文展示了一种将类组装体接种至MEA培养板的方法，可实现长达两个月的电生理活动记录。尽管本方案目前使用人源皮层类器官，但亦可广泛适用于分化为其他脑区模型的类器官。该方案建立了一种稳定、可纵向追踪的电生理检测体系，用于研究神经网络的发育过程，且该平台有望应用于癫痫治疗药物开发中的药物筛选。
引言
人多能干细胞（hPSC）来源的脑类器官是具有空间自组织能力的三维结构，可模拟组织结构和发育轨迹 体内它们由多种细胞类型组成，包括前体细胞（神经上皮细胞、放射状胶质细胞、神经元前体细胞、胶质前体细胞）、神经元（皮层样兴奋性神经元和抑制性中间神经元）以及胶质细胞（星形胶质细胞和少突胶质细胞）。1,2类器官组装体代表了脑类器官的下一代技术，能够在三维培养体系中整合多个脑区和/或细胞谱系。它们为模拟不同脑区之间类似体内的连接提供了有力的工具 体内 对应体，捕捉神经元与星形胶质细胞之间的相互作用，以更好地模拟成熟且复杂的神经网络，并研究神经回路的组装。因此，类组装体正成为一种广泛应用的工具，用于重现癫痫病理生理学的关键特征，其中功能检测对于探究潜在致病的异常神经网络至关重要3,4,5,6.
为了模拟皮层谷氨酸能神经元与GABA能中间神经元之间的相互作用，多个研究团队开发了分别类似于背侧和腹侧脑组织的类器官，随后将它们融合形成多区域的类组装体7,8,9,10。本研究采用了先前报道的一种具有区域特异性神经亚型的类组装体培养方案9。然而，一个重要的障碍是缺乏可重复的功能性检测方法来监测神经发育过程中的神经网络活动。目前对类器官中神经网络的许多功能性检测结果在不同批次的分化过程和细胞系之间表现出高度变异性。涉及对类器官进行切片或解离的技术会通过切断突触连接而改变其固有的神经网络结构8。
多电极阵列（MEA）能够在不破坏培养条件或细胞膜完整性的前提下，以高时间分辨率对类器官的电生理特性进行长期、大规模的网络活动监测11与膜片钳电生理技术相比，多电极阵列（MEA）能够基于大量神经元群体而非单个细胞实现高通量数据采集。MEA平台的电极密度各不相同，可满足脑类器官研究中的不同需求12如本方案所示，常用的系统每个孔可记录8至64个电极的数据13,14,15高密度微电极阵列（MEA）每孔可容纳多达26,400个电极，能够提高空间和时间分辨率，实现动作电位传播速度的定量分析，并可与光遗传学刺激相结合14,16,17因此，MEA 是模拟癫痫的一种强大工具 体外 以及用于抗惊厥药物筛选的转化研究范式。
一个主要挑战是如何在疏水性金属表面长期稳定地固定大尺寸的类组装体。本方案详细阐述了将完整类组装体接种到微电极阵列（MEA）板上，用于长期纵向记录并结合药理学检测的方法。该方案的独特优势包括：类组装体能够稳定地附着在电极表面，同时不丧失电活动；使用商业化神经生理学基础培养基，可加速接种后功能网络的成熟；能够开展后续功能检测，如药物处理；以及广泛适用于采用其他区域特异性方案生成的类器官。
本研究旨在提供一种具有高时间分辨率的功能性检测方法，用于研究神经网络活动、检测癫痫相关疾病的特异性变化，并评估潜在治疗药物的疗效。本方案中最具挑战性的步骤均配有视频说明，展示了在多电极阵列（MEA）板上接种类组装体的技术，以及这些培养物的代表性记录结果。
方案
以下展示的所有实验操作均遵循密歇根大学医学院机构审查委员会和人类多能干细胞研究监督委员会的伦理指南。本方案中使用的人诱导性多能干细胞（iPSC）系及代表性实验所用细胞系，均来源于商业渠道获取的人包皮成纤维细胞。本研究中所用细胞系、试剂和设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 从诱导多能干细胞（iPSCs）衍生命运特异性的脑类器官
注意：本方案包含从6孔板中5个汇合度约为85%的孔制备微孔培养板中3个孔所需的信息。iPSC的维持方案因细胞系而异。
- 根据表1中详述的成分配制单个细胞培养基。置于4 °C避光保存，最多可保存2周。
- 使用1 mL DMEM/F-12对拟用于微孔培养板的所有孔进行一次冲洗。每孔加入1 mL mTeSR plus + 50 µM Y-27632，并在室温下以2000 × g离心5分钟，以去除微孔中的气泡。将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。
- 在超净台的显微镜下，使用无菌P10移液器吸头清除iPSC分化区域。用不含钙和镁的PBS每孔1 mL清洗单层细胞，去除细胞碎片。
- 每孔加入1 mL预热的细胞解离试剂，将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育4–7分钟（根据细胞系的特性 和汇合度而定），期间每2–3分钟轻柔振荡一次，直至大多数细胞脱落，形成单细胞悬液。
- 每孔加入4 mL DMEM/F-12以稀释细胞解离试剂，使用10 mL血清移液管适度吹打混匀。将同一细胞系所有孔的细胞悬液收集至一个50 mL锥形管中。
- 在室温下以200 × g离心4分钟，使用10 mL血清移液管吸除上清液，将细胞重悬于2 mL mTeSR plus + 50 µM Y-27632中。取10 µL细胞悬液，按1:1（v/v）与台盼蓝混合，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
- 每孔接种3 × 106个活细胞，每细胞系接种3孔。根据需要补充mTeSR plus + 50 µM Y-27632，使每孔总体积达到2 mL。在室温下以100 × g离心3分钟，随后放回培养箱中。
注意：此处使用的微孔培养板每孔含有300个微孔，因此接种3 × 106个细胞相当于每微孔10,000个细胞。 - 次日，使用P1000移液器吸头轻轻吸出1 mL培养基，并缓慢加入1 mL mTeSR plus培养基（不含Y-27632），进行半量换液。移液时吸头应靠近液面，尽可能缓慢吸取，避免扰动底部正在聚集的细胞。
- 换液后一天在倒置显微镜下观察，可见每个细胞聚集体轮廓清晰。使用P1000移液器吸头将各孔中原有培养基完全移除。
- 使用无菌剪切的P1000吸头，向每孔中均匀喷入0.5 mL含dorsomorphin（DM）和SB-4321542（SB）的神经诱导培养基（NIM）。立即轻柔吹吸悬浮在培养基中的聚集体，并将其转移至无菌10 cm悬浮培养皿中。重复操作直至所有聚集体均被转移。切勿进行吹打混悬（trituration）。
- 根据需要补充NIM + SB/DM，使每皿总体积达到10 mL。将培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱内的轨道摇床上，以防止聚集体自发融合。将转移日期标记为类器官培养的第0天（Day 0）。
- 从第1天开始至实验结束，遵循表1中的培养基配方以及图1中所示的换液时间线9。特别注意：在第4天，类器官被分至两个悬浮培养皿中，分别标记为"背侧"和"腹侧"。
注意：需牢记几个关键时间节点：类器官扩增始于第6天，此时培养基更换为含EGF/FGF的神经分化培养基（NDM）；自第25天起，使用NDM + BDNF/NT3支持神经元分化；自第46天起，类器官维持在不含生长因子的NDM中培养。
2. 病毒标记与类组装体的生成
注意：建议使用病毒标记7,9来识别类器官组装体中每个区域特异性类器官的身份，并将特定电极记录到的电生理活动分配至类器官 的特定区域。每个微电极阵列（MEA）孔中最好仅接种一个类器官。 本方案也可用于单个类器官的接种。
- 计算所需病毒原液和稀释培养基的体积：每个类器官标记需要 200 µL 含病毒的培养基。背侧类器官使用 pAAV1-CAG-tdTomato 标记，通常稀释比例为 1:1000（v/v），或约 2 x 1010 vg/mL。对于腹侧类器官，使用1:300（v/v）或2 x 1011 vg/mL pAAV1-mDLX-GFP 病毒为 使用。
注意：稀释度应根据预期效果进行滴定，并受病毒滴度影响。 - 将适量培养基预热至 37 °C。在冰上解冻保存于 -80 °C 的病毒原液。标记足够数量的 48 孔板，以容纳所有标记的类器官。
- 在通风橱中放置一个盛有10%次氯酸钠溶液的烧杯。将任何接触过病毒的材料排入该烧杯中。在分别标记的15 mL锥形管中，用培养基稀释完全解冻的病毒。 "背侧" 和 "腹侧".
- 将第56天的类器官从培养皿转移至48孔板中。建议每孔接种一个类器官，以防止静态培养中发生自发融合。尽可能去除残留的培养基。
- 向每个孔中分别加入 200 µL 病毒-培养基混合液。将培养板放回 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 培养箱。将培养板倾斜放置在无菌的空板上，以帮助病毒颗粒聚集到孔的底部，从而优化转导效率。
注意：病毒颗粒易沉降至15 mL锥形管底部，因此在将病毒加入各孔前，需频繁倒置混匀病毒与培养基，以确保所有类器官的转导效率均一。 - 第二天（第57天），向每孔加入额外的800 µL培养基，使总体积达到1 mL/孔。
- 三天后（第60天），对标记的类器官进行完全换液。接触过病毒颗粒的材料须用漂白剂处理。
- 三天后（第63天），在落射荧光倒置显微镜下检测荧光表达情况。若信号较强，则开始制备类组装体（参见步骤2.9）。
- 用1 mL/孔的PBS将所有标记的类器官清洗两次，以防止类器官融合过程中残留的病毒颗粒造成交叉污染。使用剪去尖端的P1000移液枪头将一个腹侧类器官转移至每个背侧孔（或反之），并相应重新标记类组装板。参照步骤2.5倾斜培养板，以促进更好地融合。
- 融合操作后第3天（第66天）小心进行半量换液，避免干扰类组装体。通常需要约1周时间形成稳定的类组装体（第70天）。
3. 将类组装体放置于预处理的MEA板上
注意：在接种类组装体之前，MEA 平板的表面处理程序至少需要 4 天才能完成。为节省时间，可同时进行背侧和腹侧类器官的融合（即步骤 2.9）以及 MEA 的预处理。
- 准备表面预处理和包被所需的试剂。
- 配制1%洗涤剂/酶溶液：将0.5 g酶/洗涤剂粉末溶解于50 mL去离子水中，充分涡旋至粉末完全溶解。在生物安全柜中使用无菌管顶真空滤器对溶液进行灭菌，然后加入MEA孔中。每次使用前新鲜配制。
注意：该洗涤剂/酶可对MEA表面进行灭菌，去除MEA制造过程中残留的油脂，并确保表面具有足够的亲水性，以促进与亲水性化合物聚乙烯亚胺（PEI）的相互作用18。 - 配制0.07% PEI溶液19时，首先配制7% PEI储备液：将1 mL 50% PEI溶液加入15 mL锥形管中，再加入6 mL 1×硼酸盐缓冲液混匀。取1 mL 7%储备PEI溶液，加入99 mL 1×硼酸盐缓冲液中稀释，得到最终工作浓度。使用前在生物安全柜中通过0.22 µm滤器过滤灭菌。
注意：PEI是一种带正电荷的聚合物，在初级包被过程中用于促进带负电荷的次级包被物（基底膜基质[BMM]和类组装体）的附着20。由于50% PEI储备液黏度较高，应直接倾倒而非用移液器吸取1 mL至锥形管中；也可通过称重方式更准确地加入，50% PEI溶液的密度为1.08 g/mL。7% PEI储备液可分装为1 mL等份，于-20 °C保存一个月。所有后续操作均应在生物安全柜中进行。
- 配制1%洗涤剂/酶溶液：将0.5 g酶/洗涤剂粉末溶解于50 mL去离子水中，充分涡旋至粉末完全溶解。在生物安全柜中使用无菌管顶真空滤器对溶液进行灭菌，然后加入MEA孔中。每次使用前新鲜配制。
- 考虑到每个类组装体的尺寸，采用每孔64个电极的6孔MEA板，每孔放置一个类组装体。根据实验需求计算所需MEA板的数量，以确保有足够的生物学重复。
- 向无菌MEA板的每孔中加入1 mL 1%洗涤剂/酶溶液。注意避免移液枪头损伤电极。若使用真空吸液器清洗，切勿让吸头接触电极阵列。于37 °C培养箱中孵育2小时。
- 吸除洗涤剂/酶溶液，并用1.5 mL无菌去离子水对每孔清洗5次。由于洗涤剂/酶不具备生物相容性，必须确保残留化学物质被彻底清除。
- 每孔加入1 mL培养基进行预平衡处理。将板放回37 °C、5% CO2培养箱中孵育2天。使MEA表面暴露于细胞培养条件下，有助于细胞附着。
- 完全吸除培养基，每孔用50 µL 0.07% PEI溶液覆盖电极区域，进行初级包被。于37 °C孵育1小时。
- 彻底吸除PEI溶液，每孔用1 mL无菌去离子水清洗，共快速清洗3次。在生物安全柜中打开盖子，室温干燥15分钟。
- 每孔用50 µL以培养基按1:20（v/v）稀释的BMM覆盖电极区域，进行次级包被。将MEA板放回37 °C培养箱过夜。在孔周围隔室中加入无菌水，以保证包被过程中足够的湿度。
- 次日，用真空泵吸除稀释后的BMM，仅在表面留下一层薄层。若形成较厚涂层，使用P1000移液枪头用力喷射培养基冲洗电极接触区域。根据需要反复清洗，直至去除所有厚块。
注意：残留的厚层BMM可能干扰电极与细胞的接触。 - 使用剪切口较大的P1000枪头收集一个类组装体，并将其放置于孔中电极上方，转移过程中尽量减少培养基的带入。
- 在解剖显微镜下的超净工作台中，使用无菌解剖针或P20枪头小心推动类组装体至目标位置，使背侧和腹侧类器官尽可能被电极覆盖。用P20枪头吸除类组装体周围的液体。对所有类组装体或部分样本重复此操作，整个过程可在数分钟内完成。
注意：切勿用移液枪头或针头触碰或刮伤MEA表面。避免用枪头刺破或撕裂类组装体。尽快完成接种，以防类器官完全干燥。 - 将类组装体于37 °C孵育10分钟（无培养基）。将板从培养箱转移至超净工作台，在解剖显微镜下向每个类组装体顶部滴加2–3小滴以培养基按1:50稀释的BMM。再于37 °C孵育30分钟。
- 在解剖显微镜下，小心地在类组装体附近滴加3滴培养基，以保持类器官湿润。于37 °C孵育1小时。
注意：若在后续任何步骤中类组装体发生移动或漂浮，应从步骤3.11重新开始接种。 - 每小时在解剖显微镜下小心向每孔加入20–50 µL细胞培养基。该过程可持续一整天，目标是在当天结束时达到每孔总体积至少250 µL。
- 次日，在解剖显微镜下检查所有类组装体是否已沉降并稳定。每孔额外加入750 µL培养基，使总体积达到1 mL/孔。将板静置至少2天，避免扰动。
- 每周小心更换培养基：吸出500 µL培养基，加入700 µL神经生理学基础培养基。额外添加的培养基体积用于补偿蒸发损失，可根据所用MEA板的蒸发情况适当调整。根据需要在孔周围添加无菌水，以减少MEA孔中的蒸发。
4. 微电极阵列记录与数据分析
- 在切换至神经生理学基础培养基约一周后开始MEA记录（通常在第78天左右）。
- 等待记录室达到设定温度（通常为37 °C）。将培养板转移至设备，并在记录前至少平衡5分钟。
- 硬件实时设置
- 设置采样频率，即原始电压数据的记录速率。推荐使用默认设置（12.5 kHz）。
- 指定模拟模式（通常为Neural Spikes，如本例所示），以配置特定应用的硬件带宽和增益。在记录期间进行活动的可视化监测时，使用Spike Detector 和Burst Detector 模块。
注意：模拟设置会影响原始电压数据的记录方式，数据记录后无法更改。 - （可选）对记录数据应用硬件数字滤波器。低通滤波器选项包括2 kHz或3 kHz凯撒窗。在选择模拟设置后可修改默认设置。
- 设置为中位数参考（默认），在本例中强烈推荐用于神经记录。参考设置通过降低多个通道共有的噪声干扰，提高低幅度信号的质量。
注意：上述参数可根据类器官组装体中观察到的活动情况进行调整，但在同一实验的所有记录中应保持一致。
- 添加培养板图谱和描述（如需要）。从同一培养板的先前记录中导入板图以确保一致性，并便于批量数据处理。确保文件命名正确。
- 如果信号质量良好（噪声和伪影最小），则记录原始数据。通常2-5分钟的记录已足以获得代表性样本。
- 根据实验设计，每周进行一次或两次纵向电活动记录，每次持续5-15分钟。每次换液后需至少等待24小时再开始下一轮记录，因为换液后电活动会立即下降。
- （可选）若需定位并区分背侧和腹侧类器官的电活动，或需单独分析每个电极的活动，可在每次记录后在明场和落射荧光下获取每个类器官组装体的图像（图2B）。
- 在数据分析时，应用分析配置，包括峰电位/簇状放电检测器和统计编译模块。使用自适应阈值（设定为基线以上5.5-6个标准差）进行峰电位检测。将每100毫秒内≥5次峰电位的活动定义为簇状放电13。当在100毫秒内超过25%的总活跃电极放电，且每次网络簇状放电至少包含50次峰电位时，定义为网络活动13,14。
注意：这些参数可根据特定实验的放电特征进行调整。为提高对低幅度峰电位的检测灵敏度，可降低峰电位检测的自适应阈值。对于簇状放电检测，可采用多种方法，并根据与背景活动显著不同的峰电位簇调整参数。当类器官组装体未覆盖全部电极区域时，网络活动参数可调整为较低比例的电极。所有参数在实验期间应保持一致，以便进行纵向比较。 - 在回放记录数据的同时运行Statistics Compiler 模块进行批量处理。导出高级指标和/或峰电位输出文件用于进一步分析。
注意：高级指标输出包含一个.csv文件，其中包含各电极、孔和组的平均放电率、簇状放电和同步性数据。峰电位输出（.spk文件）包含所有峰电位的波形轨迹，可导入其他平台进行高级分析，例如峰电位分类。
5. 终点药理学检测与酶标板回收
注意：在类器官组合体足够成熟且电活动达到高峰后，可进行药物处理实验。记录基线/处理前活动与处理后活动需在同一天完成。
- 将 1–10 µL 药物溶液直接加至类组装体上方，并轻轻摇晃培养板以确保混合均匀。在某些情况下，建议延长在含药物培养基中的孵育时间，例如与突触相关的药物处理实验中使用谷氨酸/GABA 受体激动剂/拮抗剂时（图 2E）（详见结果部分）。
注意：建议向每孔中加入少量药物溶液以达到最终工作浓度，因为较大的体积变化通常会暂时降低电活动。 必须确保所用药物溶解载体本身不会引起电生理参数的显著变化。 - 在给药后记录完成时，进行足够次数的 PBS 洗涤（通常为 3 次），以清除药物。在洗脱药物后的第二天再进行一次记录，观察电活动是否恢复至基线水平。
- 可选步骤：在记录结束后，可用移液器用力吹打培养基，使类组装体从 MEA 板上脱离，以便进行后续实验，例如活细胞成像、用 4% 多聚甲醛固定后进行整体免疫染色，或裂解用于 RNA 或蛋白质提取。
- 为满足分析需求，每种条件应至少设置三个技术重复和生物学重复。电生理数据应以 n ≥ 3 个重复的均值表示。
- 实验结束后若需回收利用培养板，应先移除附着的类组装体，吸除残留培养基，用无菌 PBS 洗涤一次。用 200 µL/孔的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 完全覆盖金属电极区域，并将培养板置于 37 °C 培养箱中过夜。
- 次日，吸除胰蛋白酶溶液，用 70% 无菌乙醇洗涤两次，再用无菌去离子水洗涤三次。
- 将培养板在生物安全柜中打开盖子晾干 15 分钟，或直至完全干燥。将清洁后的培养板密封于塑料袋中，室温保存以备后续使用。
注意：清洗彻底的 MEA 培养板可重复使用三次，且记录质量不会显著下降。
结果
人背侧-腹侧类脑组装体被接种于6孔MEA板（每种分化n = 6，共3种分化），每孔包含64个电极图 2A十个体外组装的类器官中有九个在纵向记录期间牢固地附着在电极上超过50天 体外 (图 2D）。在用于药理学检测的8个类器官中，有6个成功通过了洗脱阶段，并表现出与发育阶段相符的神经网络活动。图2E). 显示了一个代表性孔的相差和荧光图像（图2B），其中AAV-CAG-tdTomato标记的背侧类器官与AAV-mDLX-GFP标记的腹侧类器官可被清晰区分7,9.
通过多种参数，可分析 MEA 上神经元的活动以评估整体细胞兴奋性和网络活性。整个培养物的总体放电频率可提供有关细胞和网络兴奋性的信息，而多个电极上同步簇状放电的频率则反映了神经元突触活性网络的范围。在短时间内，多个空间上分离的电极上反复出现的多个尖峰放电（网络簇发放电）可作为类似癫痫样活动的生物学对应指标，尽管与完整生物体相比，MEA 上的类组装体仍存在局限性 真正有效的 癫痫发作 图2C 展示了类组装体在商业可得的神经生理学基础培养基中培养至第84天和第91天时的网络簇发放电模式，后期时间点放电持续时间增加，可能归因于神经元的功能性成熟。在此情况下，细胞及网络活性自类组装体接种之日起逐渐上升，通常在第92天达到峰值，至第125天时几乎完全消失（图2D后期阶段的成熟度增加可能有助于延长后期记录时间点的同步簇状放电持续时间。
Bicuculline 是一种 GABAA 受体拮抗剂，可增强类器官组装体的同步化网络活动，表现为在第108天加入药物后，放电频率和（网络）簇发放频率显著升高（图2E），这与先前在单细胞电生理记录中所观察到的结果相似21。基于效应量为0.94、显著性水平α为0.05的条件，使用G*Power3对药理学实验进行了功效分析，结果表明，为达到0.8的功效，共需15个类器官组装体样本，并分为三组，每组样本量n = 5（图2E）。实验中设置了溶剂对照组，以确认所观察到的反应为真实的信号事件，而非因加入少量培养基所导致的信号强度变化（图2E）。
图 1：研究概览。 在MEA上生成和接种双标记类组装体的实验流程，以及神经分化方案的时间线，详细标注关键阶段及相应的小分子添加剂（有关成分的更多信息，请参见表 1和材料表）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：类器官组装体的微电极阵列记录。（A）单个微电极阵列板在第82天（即铺板后第10天）的平均放电活动热图（n = 6孔）。所有孔代表相同条件和基因型的培养物。（B）类器官组装体的代表性相差显微图像与共聚焦图像，其中背侧部分以红色标记，腹侧部分以绿色标记。白色箭头指示从腹侧迁移至背侧的GABA能中间神经元。比例尺 = 500 µm。（C）单个孔在120秒记录时间内的代表性点阵图。网络簇状放电以紫色方框标示。展示了两个不同时间点：第78天（铺板后1周，记录起始日）和第92天（铺板后3周，活动峰值期）。（D）从第78天至第127天的平均放电率、簇状放电频率及网络簇状放电频率的定量分析（n = 3次分化，每次分化3个类器官组装体）。每条曲线代表一个独立的类器官组装体，数据整合自3次不同分化实验（以颜色编码）。红色曲线表示平均值。（E）荷包牡丹碱检测结果的定量分析（n = 6个类器官组装体/条件）。柱状图显示为均值 ± 标准误（SEM）。每个点代表一个类器官组装体，数据整合自3批分化实验（以颜色编码）。采用非参数Friedman检验。**p < 0.01；ns，无显著性差异。MEA，微电极阵列（multi-electrode arrays）。热图与点阵图使用分析软件Neural Metric Tool生成。请点击此处查看该图的放大版本。
表1：不同分化阶段培养基的组分。 请点击此处下载该表格。
讨论
基于MEA的方法已被用于记录由iPSC衍生的类组装体中网络活动的电生理学研究 体外 癫痫建模22,23该整合了兴奋性和抑制性突触连接的拟议平台，有望用于研究神经元过度兴奋的机制以及皮层中间神经元在癫痫发生过程中的作用。此外，该平台可实现类器官集合体的稳定维持，并能够连续约50天采集纵向电生理数据。 体外即使在药物干扰存在的情况下，也能实现，从而为测试具有潜在治疗靶点的化合物提供了一种方法。
在疏水表面长期稳定成熟且相对较大的类组装体 体外 在技术上一直具有挑战性。为克服这一障碍，采用带相反电荷的化学物质进行两次涂覆的策略，以促进类器官在电极表面的短期和长期黏附。本方案对先前使用的方法进行了优化24 通过将包被试剂从多聚-L-鸟氨酸（PLO）/层粘连蛋白更换为PEI/BMM，实现了牢固贴壁，且具有高成功率和低毒性。此外，这种稳定的长期培养系统有望产生高通量数据。例如，利用双病毒预先标记可结合单个电极的峰电位分离技术，实现对不同区域神经元活动的定位与比较。该平台还可稳定记录局部场电位，对于研究中间神经元功能具有重要意义，同时不破坏类脑组装体的完整结构。25该方案的主要局限性在于，类器官在接种后会发生扁平化，这引发了人们对初始三维结构是否得以保留的担忧。使用更先进的MEA平台在电极周围培养类器官，该平台可将类器官包裹在电极中26 有望克服这一局限性。
基于微电极阵列（MEA）的类器官电生理记录方法面临的主要障碍之一，是不同分化方案甚至同种方案不同批次之间实验结果的变异性与可重复性问题。先前研究表明，通过MEA测量得到的神经元网络活动依赖于背侧和腹侧类器官中神经元的成熟状态27。在较晚的时间点记录具有相对成熟神经元和神经回路的组装体（assembloid），是提高实验一致性的方法之一。此外，选用可生成高通量数据的多孔MEA系统，将有助于在存在实验变异的情况下进行统计学比较。若某一培养物在特定时间点的电生理活动与预期不符，则从功能平台上回收完整的培养物，用于免疫细胞化学和转录组学分析等质量控制检测，将具有重要意义且十分必要。
该平台的关键在于功能性整合背侧的区域特异性兴奋性皮层神经元和腹侧的抑制性中间神经元。文献中报道的生成脑区特异性类器官的方案在培养基条件、培养时间、产量和成熟特征等方面存在广泛差异28。尽管本方案专注于生成兴奋性神经元和GABA能中间神经元，分别对应皮层和神经节隆起区域，但也可采用已建立的分化技术生成具有其他身份特征的iPSC来源神经元，例如运动神经元29和浦肯野细胞30。因此，该平台有望用于模拟大脑皮层与脊髓/小脑之间的神经环路。在优化接种时间以及通过病毒标记实现细胞类型可视化后，该方法可拓展应用于癫痫以外的其他疾病模型，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）17。
披露
作者无相关披露信息。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS）资助项目R01NS127829（LTD）支持。图1使用biorender.com生成。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 cm Corning 非 TC 处理培养皿 | 康宁 | 08-772-32 | 摇床悬浮培养 |
| 100 mL 烧杯 | Fisher Scientific | FB100100 | |
| 100% 乙醇 | Fisher Scientific | BP28184-4L | |
| 2-巯基乙醇（β-甲氧基乙酯) | 赛默飞世尔科技 | 21985023 | 工作浓度 100 μM |
| 48孔细胞培养板 | Fisher Scientific | 50-202-140 | |
| 6孔细胞培养板 | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Aggrewell 800 | Fisher Scientific | 501974754 | |
| Allegra X-14R 冷冻离心机 | 贝克曼库尔特 | BE-AX14R | |
| 别孕烷醇酮 | Cayman | 16930 | 将5 mg溶于DMSO中，配制成1 mM的储备液。分装后于-20°C冷冻保存。 −80 °C. 按1:10,000稀释后使用，工作浓度为100 nM。 |
| 自动细胞计数仪 | 赛默飞世尔科技 | AMQAX2000 | |
| Axion CytoView MEA 6孔板 | Axion Biosystems | M384-tMEA-6B | |
| Axion Maestro MEA 平台 | Axion Biosystems | Maestro | 带有温度环境控制 |
| B-27添加剂（常规型，含维生素A） | 赛默飞世尔科技 | 21985023 | |
| B-27添加剂（不含维生素A） | 赛默飞世尔科技 | 12587010 | |
| 基底膜基质 - Geltrex | 赛默飞世尔科技 | A1569601 | |
| 珠浴 | Fisher Scientific | 10-876-001 | Isotemp |
| 倒置显微镜（台式） | Olympus | CKX53 | 置于层流洁净工作台中 |
| 荷包牡丹碱 | Sigma-Aldrich | 14340 | 工作浓度 10 μM |
| 漂白剂 | CLOROX | 67619-26 | |
| 20倍硼酸盐缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 28341 | 工作浓度为1x |
| BrainPhys 培养基 | StemCell Technologies | 5790 | |
| 细胞解离试剂（StemPro Accutase） | 赛默飞世尔科技 | A1110501 | |
| Celltron 轨道摇床 | HT-Infors | I69222 | |
| 去垢剂/酶（Terg-A-Zyme） | Sigma-Aldrich | Z273287 | 工作浓度 1% m/v |
| DMEM/F12 + HEPES/L-谷氨酰胺 | 赛默飞世尔科技 | 113300 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67685 | |
| Dorsomorphin | Sigma-Aldrich | P5499 | 将5 mg溶于DMSO中，配制成10 mM的储存液。分装后冻存于 −20 °C. 按1:2000稀释后使用。（工作浓度为5 μM |
| 不含钙或镁的D-PBS | Thermo Fisher | 14190144 | |
| 胶质细胞系衍生神经营养因子（GDNF） | Peprotech | 450-10 | 溶解 100 μg 溶于 1 mL PBS 至 100 μg/mL。分装后于 −20 °C. 按1:5000稀释后使用（工作浓度为20 ng/mL）。 |
| GlutaMAX 补充剂 | 赛默飞世尔科技 | 35050061 | |
| 血细胞计数板 | 电子显微科学 | 63510-20 | |
| HEPES | 赛默飞世尔科技 | 15630080 | |
| Heraguard ECO 超净工作台 | 赛默飞世尔科技 | 51029692 | |
| 湿度可控的细胞培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 370 | 设定为37 °C，5% CO2 |
| IWP-2 | Selleckchem | S7085 | 分装并冻存于 −80 °C. 若在室温下解冻会析出沉淀。冷冻分装样品应直接放入37 °使用前置于冰上。 |
| 无血清替代物（KOSR） | 赛默飞世尔科技 | 10828010 | |
| mTeSRplus（培养基 + 补充剂） | StemCell Technologies | 100-0276 | 人iPSC细胞用cGMP级无饲养层稳定培养基 |
| N2 补充剂 | 赛默飞世尔科技 | 17502048 | |
| Neurobasal A | 赛默飞世尔科技 | 21103049 | |
| 非必需氨基酸（NEAA） | 赛默飞世尔科技 | 11140050 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | 溶解 100 μg 溶于 1 mL PBS 至 100 μg/mL。分装后于 −20 °C. 按1:5000稀释后使用（工作浓度为20 ng/mL）。 |
| 人类新生儿包皮成纤维细胞（NuFF） | MTI-GlobalStem | GSC-3002 | |
| Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| 青霉素/链霉素 | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | |
| 移液器（P10、P200、P1000） | Eppendorf | EP4926000034 | 用于类器官收集的高压灭菌P1000吸头剪切处理 |
| 聚乙烯亚胺（PEI） | Sigma-Aldrich | P3143 | 用无菌硼酸盐缓冲液稀释原液，工作浓度为0.07%。详见论文正文。 |
| 重组人表皮生长因子（EGF） | R&D Systems | 236-EG-200 | 用 PBS 悬浮。分装后于 -20 冻存 °C. |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-碱性） | Peprotech | 100-18B | 用 PBS 悬浮。分装后于 -20 ℃ 冻存 °C. |
| 重组人脑源性神经营养因子（BDNF） | Peprotech | 450-02 | 离心片刻后再进行重悬。溶解100 μg 溶于 1 mL PBS 至 100 μg/mL。分装后于 −20 °C. 按1:5000稀释后使用（工作浓度为20 ng/mL）。 |
| 视黄酸（RA） | Sigma-Aldrich | R2625 | 将100 mg溶解于3.3 mL DMSO中，配制成100 mM的母液。分装该100 mM母液 μL/试管，冷冻保存于 −80 °C. 取 200 μ100 mM 原液取 L，稀释 10 倍（加入 1.8 mL DMSO）制成 10 mM 原液。分装 50 μL/管中并储存于 −80 °C. 使用时按1:100,000比例稀释。（工作浓度为100 nM）。 |
| ROCK抑制剂Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 mM 原液稀释200倍 |
| SAG（平滑受体激动剂） | Selleckchem | S7779 | 分装并冻存于 −80 °C. 储存液浓度 1 mM。使用时按 1:10,000 稀释（工作浓度 100 nM）。 |
| SB-431542 | Tocris | 1614 | 将5 mg溶解于1.3 mL DMSO中，配制成10 mM的储存液。分装后冻存于 −80 °C. 按1:1000稀释后使用。（工作浓度为10 μM |
| 血清移液管吸液器 | Fisher Scientific | 14-387-166 | |
| Steriflip 真空管顶式滤器 | Sigma-Aldrich | SE1M179M6 | |
| 无菌细胞培养罩 | 贝克公司 | SG-600 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | 赛默飞世尔科技 | 15250061 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%） | 赛默飞世尔科技 | 25200056 | |
| 体视显微镜 | 奥林巴斯 | SZ61/SZ51 | 置于层流洁净工作台中 |
参考文献
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