活/死染色法用于定量麦卢卡蜂蜜处理后伤口致病菌中的可存活但不可培养细胞

摘要

本方案描述了一种定量测定麦卢卡蜂蜜处理的细菌培养物中存活但不可培养细胞（VBNC）的方法。

摘要

细菌对抗生素的耐药性和耐受性对全球健康构成重大威胁。导致抗生素耐药性和耐受性的机制分别包括基因突变、获得耐药基因，以及转变为可存活但不可培养（VBNC）状态和其他休眠状态。尽管VBNC细胞在基因上与其非耐药性同类完全相同，但它们通过保持代谢不活跃来逃避抗生素的作用。抗生素仅在其靶向过程（如DNA复制或转录）处于活跃状态时才有效。由于环境压力因素（尤其是抗生素）可促使细菌进入休眠状态，因此需要替代性的抗菌剂以最小化或防止这种反应。麦卢卡蜂蜜（Manuka Honey, MH）对多种细菌具有抗菌效果，且极少引发耐药性的产生。其多方面的抗菌机制使其成为治疗细菌感染的重要抗菌剂。本研究通过检验“MH诱导的VBNC细胞数量少于传统抗生素”这一假设，探讨MH在抑制抗生素耐药性发展方面的抗性能力。为验证该假设，建立了一种实验方案：使用MH或传统抗生素（妥布霉素或美罗培南）的最低抑菌浓度处理引起伤口感染的细菌Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa，随后采用活菌平板计数法检测具有代谢活性的可培养细胞，并结合活/死染色法检测所有存活细胞。VBNC细胞数量等于存活细胞总数减去可培养细胞数。在部分实验中，可培养细胞数高于存活细胞数，导致VBNC细胞数为负值；因此未直接比较VBNC细胞数量。取而代之的是，对每种处理条件下的可培养细胞数与存活细胞数进行比较。只有经妥布霉素处理的P. aeruginosa显示出可培养细胞数显著少于存活细胞数，表明其VBNC细胞数量较高。该方案快速简便，可用于评估MH在其他致病菌中诱导VBNC细胞形成的能力。

引言

处于可存活但不可培养（VBNC）休眠状态的细菌可耐受抗生素治疗，并导致反复发作且有时致命的感染性疾病^1,2,3我们更为熟悉的是抗生素耐药性，其发生是由于 通过 可遗传的基因改变⁴该基因改变可通过多种机制赋予对特定抗生素的耐药性，包括限制抗生素的摄入、增加抗生素的外排、修饰抗生素的作用靶点或使抗生素失活。⁴相比之下，处于休眠状态的细菌通过降低其代谢水平，表现出更广泛且不具遗传性的抗生素耐受性^2,3抗生素靶向特定的代谢过程，包括DNA复制和细胞壁合成，但对代谢失活的活的非可培养（VBNC）细胞无效⁴在大多数细菌群体中，VBNC细胞以极低的数量随机存在，与其基因完全相同的抗生素敏感型同胞共存。⁵然而，环境应激因素（包括抗生素暴露）可诱导敏感细菌细胞进入对抗生素耐受的活的非可培养（VBNC）状态^3,6抗生素处理会杀死种群中对抗生素敏感的细胞，而休眠的活的非可培养（VBNC）细胞则会存活下来。顾名思义，VBNC细胞无法在适合其代谢活跃同类生长的培养基上培养。然而，这些细胞的膜结构和遗传物质并未受损，并且具有繁殖能力^7,8当抗生素被移除后，需要特定的刺激因素（如营养物质、温度或宿主因子）来唤醒处于休眠状态的活的非可培养细胞（VBNC），并恢复其生长。^3,9许多致病性细菌物种中均有休眠但可存活细胞（VBNC）的报道，包括 P. aeruginosa 和 S. aureus, 伤口感染的主要致病因子^10,11.

蜂蜜因其抗菌特性长期以来被用于医疗领域，包括伤口治疗¹²。麦卢卡蜂蜜（MH）源自麦卢卡灌木（Leptospermum scoparium）的花蜜，以其广谱杀菌活性而著称（综述见^13,14,15）。它能够有效杀灭大多数经测试的人类致病菌，包括对传统抗生素具有可遗传耐药性的细菌菌株，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin Resistant Staphylococcus aureus）和耐万古霉素肠球菌（Vancomycin-Resistant Enterococcus）^16,17。此外，细菌对MH产生诱导性耐药的情况较为罕见，仅在暴露于蜂蜜的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物膜以及在逐步增加浓度的特定蜂蜜成分中培养的大肠杆菌（Escherichia coli）中被检测到^18,19,20,21。这表明MH的抗菌机制与传统抗生素不同，可能诱导更少甚至不产生活的非可培养（VBNC）细胞。本研究通过比较MH与传统抗生素对VBNC菌群的影响，验证了这一假设。

VBNC 细胞必须与其具有代谢活性的可培养细胞以及死亡细胞区分开来。可培养细胞的数量可通过活菌平板计数法进行测定，该方法将细胞转移至常规培养基中，并孵育足够长的时间，使其发生足够多次的细胞分裂，从而形成可观察到的菌落。目前已开发出多种方法，可根据细胞膜的完整性及低水平的转录活性来区分 VBNC 细胞与死亡细胞。通过底物和荧光染料摄取实验，结合显微镜或流式细胞术，可直接对细胞进行计数，并以颜色指示细胞膜是否完整^22,23。呼吸活性检测法依赖于完整细胞膜中存在的电子传递链，也可用于区分活细胞与死细胞²⁴。此外，还发展了结合 DNA 修饰染料的定量 PCR（qPCR）方法，该染料可阻止 DNA 扩增；只有来自活细胞的 DNA 才能被扩增，因为完整的细胞膜可阻止染料进入²⁵。尽管 VBNC 细胞处于休眠状态，但仍维持低水平的基因转录，这一特性也可用于通过逆转录 PCR 与死亡细胞相区分²⁶。

本研究建立了一种检测方法，用于定量分析经MH处理后两种致伤口感染的病原菌——S. aureus 和 P. aeruginosa 中的活的但不可培养（VBNC）细胞。该方法描述了使用MH和传统抗生素处理细菌，并通过活菌平板计数法和活/死染色法来检测可培养细胞和活细胞。这一简便且经济的实验方案将有助于分析MH是否能够诱导多种细菌病原体产生耐药性VBNC细胞。

方案

由于P. aeruginosa（ATCC9721）和S. aureus（ATCC29213）被归类为生物安全二级病原体，实验操作必须在受限进入的实验室内进行，并配备生物安全柜，以用于可能产生飞溅或气溶胶的操作，例如振荡和离心培养物。在本实验方案的所有步骤中，均需穿戴个人防护装备（PPE），包括实验服、防护眼镜和手套。实验中使用的所有试剂和设备均列于材料表中。

1. 无菌肉汤和琼脂培养基的制备

1. 准备LB（Luria Bertani）培养基、MH（Mueller Hinton）培养基、NaCl（0.85%）、抗生素及玻璃器皿。
   1. 根据制造商说明配制液体培养基，若配制固体培养基则加入1.5%的琼脂粉。将0.85 g NaCl溶于100 mL去离子水（dH₂O）中，配制0.85% NaCl溶液。在容器上贴好高压灭菌指示胶带，放入耐高压灭菌的容器中，根据所用液体体积选择合适的液体程序进行高压灭菌。
   2. 高压灭菌程序完成后，将琼脂培养基冷却至约60 °C，然后倒入无菌培养皿中。
2. 用去离子水（dH₂O）配制100 μg/mL的抗生素妥布霉素（tobramycin）和美罗培南（meropenem）储备液，用于后续稀释及细菌处理。使用5 mL无菌注射器连接0.2 μm无菌滤器对抗生素储备液进行除菌过滤。
   1. 将除菌后的抗生素储备液分装成多个小份，于-20 °C保存，以避免因反复冻融导致活性下降。

2. 从 -80 °C 复苏保存的 Staphylococcus aureus 和 Pseudomonas aeruginosa 菌株（第1天）

1. 准备从-80 °C冻存管中划线接种少量冻存菌株至Luria Bertani（LB）琼脂平板所需的材料。包括多根无菌木签和一个已标记菌种名称及日期的LB琼脂平板。
2. 打开-80 °C超低温冰箱，迅速取出目标菌株冻存管并立即关闭冰箱门。依次打开每根冻存管，用无菌木签刮取少量冻存细菌，接种到相应标记的LB琼脂平板上。盖好管盖，并迅速将冻存管放回-80 °C超低温冰箱。
3. 将接种后的LB琼脂平板倒置（琼脂面朝上），在37 °C、有氧（大气）条件下培养18–24小时。培养结束后，用封口胶带密封接种好的LB琼脂平板，并置于4 °C保存，保存时间不超过一周。根据实验需要，每周从-80 °C冻存菌种中重新接种新鲜细菌培养物。

3. 金黄色葡萄球菌（S. aureus）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的处理前准备（第2天）

1. 准备每种菌株的LB液体培养基培养所需材料，包括小型无菌试管、5 mL刻度移液管、无菌LB液体培养基和接种环。同时准备用于刻度移液管的手动或电动移液器、本生灯和摇床培养箱。
2. 在本生灯火焰旁操作，使用刻度移液管将2 mL LB液体培养基转移至两支无菌试管中。将接种环在本生灯火焰上灭菌后，从LB琼脂平板上取四分之一环细菌，转移至相应标记的含LB液体培养基的试管中。
   1. 将试管置于37 °C摇床培养箱中，在有氧条件下振荡（约250 rpm）培养18–24小时。

4. 准备MH并设置MH及抗生素对S. aureus和P. aeruginosa的处理（T = 0）（第3天）

1. 准备实验所需材料，包括 Mueller Hinton 肉汤和琼脂平板、第 2 天的 LB 肉汤细菌培养物、无菌试管、置于冰上的抗生素储备液、移液器（P20、P200 和 P1000）及吸头、15 mL 离心管、刻度移液管及移液器、微量离心管。
   1. 在实验当天新鲜配制 25% 和 50% 的 MH 储备溶液。根据 MH 的密度（1.47 g/mL），在无菌 15 mL 管中称取适量 MH，并加入适量无菌 Mueller Hinton 肉汤。通过将管子置于温水中并根据需要颠倒混匀，使 MH 重新悬浮。
2. 在无菌 15 mL 管中，将过夜培养的细菌培养物用 Mueller Hinton 肉汤稀释 1:1000（约 10⁶ CFU/mL），即取 10 μL 细菌培养物加入 10 mL Mueller Hinton 肉汤中。
   1. 使用稀释后的培养物为每种细菌制备三个样本：未处理对照组、 MH 处理组（最低抑菌浓度，MIC）和抗生素处理组（S. aureus 使用妥布霉素，P. aeruginosa 使用美罗培南，均为 MIC 浓度）。
   2. 按照 表 1  和 表 2 中所示体积，向各样本中加入稀释后的细菌培养物、MH 和相应的抗生素。
3. 分别取 0.1 mL 和 0.5 mL 的未处理样本转移至无菌微量离心管中，用于 T = 0 样本的活菌平板计数（步骤 5）和活/死染色（步骤 6）。
   1. 将未处理对照组、MH 处理组以及抗生素处理组（妥布霉素或美罗培南）在 37 °C、有氧条件下于摇床（250 rpm）中孵育 24 小时。对 T = 0 的未处理样本进行活菌平板计数（步骤 5）和活/死染色（步骤 6）操作。

5. 使用活菌平板计数法测定样品中的可培养细胞（第3-5天）

1. 第4天，在样品孵育24小时后，分别取0.1 mL和0.5 mL各样品至微量离心管中，用于活菌平板计数和活/死染色（步骤6），这些样品即为T = 24 h样品。
2. 在采集当天对 T = 0 和 T = 24 h 的样品进行活菌平板计数，将活菌平板计数样品在 LB 肉汤中进行10倍系列稀释，以获得可计数的细胞数量（约25–150个）。
   1. 涂布50 μ每种稀释样品各取 L 涂布于 ½ LB 琼脂平板的。将 LB 琼脂平板在 37 ℃ 有氧条件下孵育 °C 培养 24 小时。
3. 次日，从培养箱中取出LB琼脂平板，选择菌落数约为25–150的稀释平板。准确计数平板上的菌落数量，并使用菌落形成单位（CFU）公式（CFU/mL = 计数的菌落数 /（涂布体积，mL）×（稀释倍数））计算每毫升中可培养的细胞数量。
   注意：T = 0 样品将于第3天接种平板，第4天进行分析；T = 24 h 样品将于第4天接种平板，第5天进行分析。

6. 使用活/死染色法和荧光显微镜测定样品中的活细胞（第3或第4天）

1. 准备活/死染色所需的材料，包括0.85%无菌NaCl（用于维持细胞适宜的渗透压环境）、移液器（P20、P200和P1000）、无菌移液器吸头、细菌用活/死染色试剂盒以及一次性血细胞计数板。准备配备异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片的荧光显微镜，用于检测染色活细胞的SYTO 9染料。
2. 向以下各活/死染色样品中加入0.5 mL的0.85% NaCl：所有未稀释的T = 0样品、未稀释的T = 24 h MH处理样品和抗生素处理样品，以及T = 24 h未处理对照样品的1:1000稀释液。
   1. 注意：所有样品的最终活细胞计数需乘以2，而稀释后的T = 24 h未处理对照样品需乘以1000。每份样品中加入1.5 μL SYTO 9和1.5 μL碘化丙啶，混匀后向每份样品中加入3 μL混合染液。将样品置于21 °C避光孵育15分钟。
3. 将每份染色后并轻轻混匀的样品取6 μL转移至一次性血细胞计数板，使用配备FITC滤光片和40倍物镜的荧光显微镜观察，并拍摄一张同时显示血细胞计数板网格线和绿色活细胞的照片。
   1. 对每份样品的六个视野中的绿色细胞进行计数，记录网格的尺寸，以便计算单位体积内的绿色细胞数量。
      注：当前实验中每个视野的尺寸为1.05 mm × 0.6 mm × 0.1 mm，对应体积为0.063 mm³或6.3 × 10^-5 mL。为获得每毫升的活细胞数，将计数得到的活细胞数除以6.3 × 10^-5 mL，再乘以2（若为T = 24 h未处理对照样品，则乘以2000）。

7. 确定活的但不可培养细胞（VBNCs）的数量

注意：使用活菌平板计数法获得的可培养细胞数量和活/死染色法获得的活细胞数量来确定VBNC细胞的数量。

1. 通过从每毫升活细胞数中减去可培养细胞数/mL来计算VBNCs/mL。
2. 使用Wilcoxon配对检验比较每种处理的VBNCs/mL或 可培养细胞数/mL与活细胞数/mL。

结果

当细菌受到包括抗生素处理在内的各种应激因素作用时，会进入一种“可存活但不可培养”（VBNC）的生命状态，这种状态因其对抗生素的耐受性而导致感染反复发生。由于MH是一种广谱抗菌剂，且极少检测到对其产生耐药性的情况，因此推测MH诱导产生的VBNC细胞数量少于传统抗生素。本文所述方法用于定量两种引起伤口感染的细菌——S. aureus 和 P. aeruginosa——所形成的VBNC细胞数量。VBNC细胞数量等于通过活/死染色法测定的活细胞数减去通过活菌平板计数法测定的可培养细胞数。表3显示了在指定时间点和处理条件下，分别检测到的S. aureus 和 P. aeruginosa 的VBNC细胞平均数量。这些实验中面临的一个挑战是，有时测得的活细胞数量低于可培养细胞数量，从而导致VBNC数量为负值。根据定义，所有可培养细胞均为活细胞，因其具备增殖并形成菌落的能力。为此，我们通过统计分析判断每种处理条件下可培养细胞数量与活细胞数量之间是否存在显著差异，以解决该问题。结果显示，经抗生素处理的S. aureus 和 ...

讨论

本方案可用于检测经最低抑菌浓度（MIC）的MH及常规抗生素处理后，伤口致病菌中处于活但不可培养（VBNC）状态的细胞群体。方案中的关键步骤包括：在实验当天配制MH稀释液，防止活/死染色过程中样品损失，以及正确计算分析体积。在本研究及其他相关研究中，S. aureus 和 P. aeruginosa 的MH MIC值系通过实验测定²⁷。为开展1%-20% MH浓度范围的测试，实验中使用培养基配制了25%或50%的MH储备液。有趣的是，随着稀释样品存放时间延长，其抑菌效果略有增强，导致MIC值降低（Carlson，未发表观察结果）。100% MH 的存放时间似乎不影响其有效性，但此现象尚未经过系统验证。为避免MH活性出现差异，25%和50%的稀释液均在实验当日 freshly 配制。

在多次实验中，由于可存活细胞数量少于可培养细胞数量，计算出的VBNC细胞数为负值。由于所有可培养细胞均为可存活细胞，因此不可能出现可存活细胞数量少于可培养细胞数量的情况。推测在收集处理后样品进行活/死细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
穆勒-欣顿肉汤	Fisher Bioreagents	B12322
劳里亚-伯塔尼（LB）肉汤	Fisher Bioreagents	BP142602
BD Difco 琼脂	Fisher Scientific	DF0812-07-1
氯化钠	Sigma	S3014-500g
美罗培南	TargetMol	T0224
妥布霉素	Selleck Chemicals	S2514
金黄色葡萄球菌	ATCC	ATCC29213
铜绿假单胞菌	ATCC	ATCC9721
摇床培养箱	Eppendorf	M13520000
培养箱	Benchmark Scientific	H2200-H
Manukaguard 麦卢卡蜂蜜	Amazon	NA
DMIL 倒置荧光显微镜	Leica Microsystems	11521265
数码相机	Leica Microsystems	12730522
15 mL 离心管	Genesee Scientific	28-103
血清移液管	Diagnocine	DP-LB0100005, DP-LB010010
Pipet Aid 移液器	Drummond Scientific Company	4-000-101
本生灯	Fisher Scientific	S48108
Rainin 移液管	Pipette.com	L-20, L-200, L-1000
天平	Mettler Toledo	XS603S
96 孔板	Falcon	351172
接种环	Fisher Scientific	13-104-5
异丙醇	Fisher Scientific	BP2618-1
玻璃涂布棒	自制	NA
细菌活/死染色试剂盒	Invitrogen	L7012
微量离心管	Biologix Research Company	SKU 80-1500/P80-1500
锡箔纸	Costco	NA
图表绘制软件	GraphPad	NA	使用 GraphPad Prism 绘制图表并进行统计分析。