活/死染色法用于定量麦卢卡蜂蜜处理后伤口致病菌中的可存活但不可培养细胞

摘要

本方案描述了一种定量测定麦卢卡蜂蜜处理的细菌培养物中存活但不可培养细胞（VBNC）的方法。

摘要

细菌对抗生素的耐药性和耐受性对全球健康构成重大威胁。导致抗生素耐药性和耐受性的机制分别包括基因突变、获得耐药基因，以及转变为可存活但不可培养（VBNC）状态和其他休眠状态。尽管VBNC细胞在基因上与其非耐药性同类完全相同，但它们通过保持代谢不活跃来逃避抗生素的作用。抗生素仅在其靶向过程（如DNA复制或转录）处于活跃状态时才有效。由于环境压力因素（尤其是抗生素）可促使细菌进入休眠状态，因此需要替代性的抗菌剂以最小化或防止这种反应。麦卢卡蜂蜜（Manuka Honey, MH）对多种细菌具有抗菌效果，且极少引发耐药性的产生。其多方面的抗菌机制使其成为治疗细菌感染的重要抗菌剂。本研究通过检验“MH诱导的VBNC细胞数量少于传统抗生素”这一假设，探讨MH在抑制抗生素耐药性发展方面的抗性能力。为验证该假设，建立了一种实验方案：使用MH或传统抗生素（妥布霉素或美罗培南）的最低抑菌浓度处理引起伤口感染的细菌Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa，随后采用活菌平板计数法检测具有代谢活性的可培养细胞，并结合活/死染色法检测所有存活细胞。VBNC细胞数量等于存活细胞总数减去可培养细胞数。在部分实验中，可培养细胞数高于存活细胞数，导致VBNC细胞数为负值；因此未直接比较VBNC细胞数量。取而代之的是，对每种处理条件下的可培养细胞数与存活细胞数进行比较。只有经妥布霉素处理的P. aeruginosa显示出可培养细胞数显著少于存活细胞数，表明其VBNC细胞数量较高。该方案快速简便，可用于评估MH在其他致病菌中诱导VBNC细胞形成的能力。

引言

处于可存活但不可培养（VBNC）休眠状态的细菌可耐受抗生素治疗，并导致反复发作且有时致命的感染性疾病^1,2,3我们更为熟悉的是抗生素耐药性，其发生是由于 通过 可遗传的基因改变⁴该基因改变可通过多种机制赋予对特定抗生素的耐药性，包括限制抗生素的摄入、增加抗生素的外排、修饰抗生素的作用靶点或使抗生素失活。⁴相比之下，处于休眠状态的细菌通过降低其代谢水平，表现出更广泛且不具遗传性的抗生素耐受性^2,3抗生素靶向特定的代谢过程，包括DNA复制和细胞壁合成，但对代谢失活的活的非可培养（VBNC）细胞无效⁴在大多数细菌群体中，VBNC细胞以极低的数量随机存在，与其基因完全相同的抗生素敏感型同胞共存。⁵然而，环境应激因素（包括抗生素暴露）可诱导敏感细菌细胞进入对抗生素耐受的活的非可培养（VBNC）状态^3,6抗生素处理会杀死....

方案

由于P. aeruginosa（ATCC9721）和S. aureus（ATCC29213）被归类为生物安全二级病原体，实验操作必须在受限进入的实验室内进行，并配备生物安全柜，以用于可能产生飞溅或气溶胶的操作，例如振荡和离心培养物。在本实验方案的所有步骤中，均需穿戴个人防护装备（PPE），包括实验服、防护眼镜和手套。实验中使用的所有试剂和设备均列于材料表中。

1. 无菌肉汤和琼脂培养基的制备

1. 准备LB（Luria Bertani）培养基、MH（Mueller Hinton）培养基、NaCl（0.85%）、抗生素及玻璃器皿。
   1. 根据制造商说明配制液体培养基，若配制固体培养基则加入1.5%的琼脂粉。将0.85 g NaCl溶于100 mL去离子水（dH₂O）中，配制0.85% NaCl溶液。在容器上贴好高压灭菌指示胶带，放入耐高压灭菌的容器中，根据所用液体体积选择合适的液体程序进行高压灭菌。
   2. 高压灭菌程序完成后，将琼脂培养基冷却至约60 °C，然后倒入无菌培养皿中。
2. 用去离子水（dH₂O）配制100 μg/mL的抗生素妥布霉素（tobramycin）和美罗培南（meropenem）储备液，用于后续稀释及细菌处理。使用5 ....

结果

当受到抗生素处理等应激因素影响时，细菌可进入“可存活但不可培养”（VBNC）状态，由于其对抗生素具有耐受性，可能导致感染反复发生。由于MH是一种广谱抗菌剂，且极少检测到对其产生耐药性的情况，因此推测MH诱导产生的VBNC细菌数量少于传统抗生素。本文所述方法用于定量两种引起伤口感染的细菌——S. aureus 和 P. aeruginosa——所形成的VBNC细胞数量。VBNC细胞数量等于通过活/死染色法测定的活细胞数减去通过活菌平板计数法测定的可培养细胞数。表3展示了在指定时间点和处理条件下分别检测到的 S. aureus 和P. aeruginosa的VBNC细胞平均数量。此类实验面临的一个挑战是，当测定的活细胞数量低于可培养细胞数量时，会导致VBNC细胞数量为负值。根据定义，所有可培养细胞均为活细胞，因其具备增殖并形成菌落的能力。为此，我们通过统计分析判断每种处理条件下可培养细胞数与活细胞数之间是否存在显著差异，以解决该问题。对于经抗生素处理的S. aureus和P. aeruginosa，其.......

讨论

本方案可用于检测经最低抑菌浓度（MIC）的MH及常规抗生素处理后，伤口致病菌中处于活但不可培养（VBNC）状态的细胞群体。方案中的关键步骤包括：在实验当天配制MH稀释液，防止活/死染色过程中样品损失，以及正确计算分析体积。在本研究及其他相关研究中，S. aureus 和 P. aeruginosa 的MH MIC值系通过实验测定²⁷。为开展1%-20% MH浓度范围的测试，实验中使用培养基配制了25%或50%的MH储备液。有趣的是，随着稀释样品存放时间延长，其抑菌效果略有增强，导致MIC值降低（Carlson，未发表观察结果）。100% MH 的存放时间似乎不影响其有效性，但此现象尚未经过系统验证。为避免MH活性出现差异，25%和50%的稀释液均在实验当日 freshly 配制。

在多次实验中，由于可存活细胞数量少于可培养细胞数量，计算出的VBNC细胞数为负值。由于所有可培养细胞均为可存活细胞，因此不可能出现可存活细胞数量少于可培养细胞数量的情况。推测在收集处理后样品进行活/死细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
穆勒-欣顿肉汤	Fisher Bioreagents	B12322
劳里亚-伯塔尼（LB）肉汤	Fisher Bioreagents	BP142602
BD Difco 琼脂	Fisher Scientific	DF0812-07-1
氯化钠	Sigma	S3014-500g
美罗培南	TargetMol	T0224
妥布霉素	Selleck Chemicals	S2514
金黄色葡萄球菌	ATCC	ATCC29213
铜绿假单胞菌	ATCC	ATCC9721
摇床培养箱	Eppendorf	M13520000
培养箱	Benchmark Scientific	H2200-H
Manukaguard 麦卢卡蜂蜜	Amazon	NA
DMIL 倒置荧光显微镜	Leica Microsystems	11521265
数码相机	Leica Microsystems	12730522
15 mL 离心管	Genesee Scientific	28-103
血清移液管	Diagnocine	DP-LB0100005, DP-LB010010
Pipet Aid 移液器	Drummond Scientific Company	4-000-101
本生灯	Fisher Scientific	S48108
Rainin 移液管	Pipette.com	L-20, L-200, L-1000
天平	Mettler Toledo	XS603S
96 孔板	Falcon	351172
接种环	Fisher Scientific	13-104-5
异丙醇	Fisher Scientific	BP2618-1
玻璃涂布棒	自制	NA
细菌活/死染色试剂盒	Invitrogen	L7012
微量离心管	Biologix Research Company	SKU 80-1500/P80-1500
锡箔纸	Costco	NA
图表绘制软件	GraphPad	NA	使用 GraphPad Prism 绘制图表并进行统计分析。