本文介绍了优化的组织透明化方案，用于对小鼠主动脉进行三维（3D）成像。我们详细阐述了免疫染色、光学透明化和成像的前沿操作步骤，旨在明确在动脉粥样硬化中，外周神经系统与动脉粥样硬化斑块及外膜之间的解剖学邻近关系。
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本文内容
摘要
摘要
近期研究加深了人们对动脉粥样硬化作为一种跨壁性慢性炎症性疾病的理解，该疾病累及动脉壁的全部三层结构，包括内膜斑块、中膜以及构成动脉外层结缔组织被膜的外膜。我们最近的研究表明，外膜被周围神经系统用作通向所有组织细胞的传导通路。我们还发现，周围神经系统（即感觉神经系统和交感神经系统）会发生显著的重塑过程，包括在动脉粥样硬化斑块邻近区域新生轴突网络。在此背景下，阐明神经网络的结构及其与病变动脉血管组分之间的相互作用，对于深入理解心血管疾病的发生机制具有重要意义。为实现这些目标，需要开发能够对完整健康的和病变的动脉及其周围的血管周围结构进行亚细胞水平成像的方法。组织透明化技术使得对原本难以触及的较大组织区域进行完整的深层组织成像成为可能，它通过整合标记、透明化、先进显微成像和图像处理工具，实现对完整动脉的三维成像。本文中，我们描述了两种不同但互补的被动组织透明化方法，即基于水相的2,2-硫代二乙醇（TDE）透明化法和基于溶剂的免疫标记辅助的溶剂透明化器官三维成像法（iDISCO），用于对分离的小鼠主动脉节段或原位全主动脉进行成像。
引言
组织学技术通过切片组织/器官，为生物样本提供基本的认识。然而，直到最近，要在三维（3D）条件下清晰界定复杂的解剖结构中细胞与细胞、组织与组织之间的相互作用仍然十分困难。这一未满足的需求在心血管系统于健康与疾病状态下的研究中尤为突出。由于光吸收和光散射的影响，完整组织的成像在过去一直具有挑战性，导致其本质上不透明。组织透明化技术通过最大限度减少这些限制，使完整的生物样本变得透明。近年来组织透明化技术的发展，使得对未经切片的透明化组织进行高分辨率三维成像成为可能，从而在微米分辨率下深入揭示整个器官的细胞与结构微细架构，并实现对解剖连接网络的精确界定。
动脉粥样硬化涉及动脉壁的三层结构，包括内层的内膜、中层的中膜以及外层的结缔组织层，后者称为外膜。数十年来，动脉内膜中的动脉粥样硬化斑块一直是研究的传统靶点1,2。然而，外膜层含有血管、淋巴管以及周围神经系统中的神经纤维。此外，外膜还与血管周围脂肪组织和神经组织成分相连，包括周围神经和血管周围神经节3,4。已知周围神经利用外膜作为通路，以到达远端靶组织乃至细胞5。我们近期的研究推动了对多个主要生物系统之间多层次相互作用的理解，这些系统包括免疫系统、神经系统....
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方案
本研究遵循当地和国家动物使用与护理委员会的指南进行。实验中使用了C57BL/6J背景的高脂血症雄性Apoe-/-小鼠，这些小鼠在标准啮齿类动物饲料喂养下，随着年龄增长会自发形成动脉粥样硬化。
1. 主动脉组织整体成像与TDE透明化处理
- 组织制备
- 准备麻醉剂，剂量为每公斤体重150 mg的氯胺酮（Ketamine）和每公斤体重30 mg的赛拉嗪（Xylazine）（参见 材料表每只小鼠进行腹腔注射以深度麻醉，并通过深部疼痛测试无反应来确认麻醉程度。
注意：注射剂的浓度和体积如下：氯胺酮 100 mg/mL；赛拉嗪 20 mg/mL；注射体积为氯胺酮与赛拉嗪按体积比 50:50 混合，剂量为 3 µL/g。 - 将小鼠置于覆盖有手术纸巾的泡沫板上，用胶带将其四肢固定于仰卧位。用75%乙醇消毒胸部（参见 材料表）并使用1 mL一次性注射器通过左心室采血，以清除血液，从而获得更佳的灌注效果。
注意：也可通过开胸术采集心脏血液。 - 在胸部正中做切口以暴露心脏，并在右心房做一小切口，以便进行经心脏灌注。通过左心室向小鼠灌注 10 mL 5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA；参见 材料表) 磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育 5....
- 准备麻醉剂，剂量为每公斤体重150 mg的氯胺酮（Ketamine）和每公斤体重30 mg的赛拉嗪（Xylazine）（参见 材料表每只小鼠进行腹腔注射以深度麻醉，并通过深部疼痛测试无反应来确认麻醉程度。
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结果
为了展示完整健康的和病变主动脉的显微解剖结构，并揭示动脉粥样硬化小鼠模型中免疫系统、神经系统与心血管系统之间的物理连接关系，我们采用了两种互补的组织透明化方法：分离主动脉的TDE透明化处理，以及整只小鼠的iDISCO透明化处理（图1）。在进行整体免疫染色后，采用一系列TDE工作液对enface主动脉进行透明化处理。折射率（RI）被匹配至1.4–1.5，具体数值取决于最终步骤中TDE溶液的浓度，以在不改变主动脉组织体积的前提下实现最佳透明效果（图1A）。与TDE透明化不同，iDISCO透明化流程在整体免疫染色前包含脱色和通透步骤，随后使用不同的有机溶剂进行脱脂和脱水，并将折射率匹配至1.56（图1B）。由于组织在该过程中发生收缩，iDISCO透明化可实现大尺寸组织甚至整只小鼠全身的可视化。
对经TDE透明化处理的完整en face主动脉进行共聚焦和多光子三维成像，可实现对.......
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讨论
动脉粥样硬化可被视为一种累及动脉壁全层的跨壁性炎症性疾病。此外，动脉周围还分布着血管周围脂肪组织和神经组织。在动脉粥样硬化进展过程中，这些组织均会发生显著的细胞和结构改变，因此需要能够对健康和病变动脉周围完整组织实现亚细胞光学通透性的研究方法。本文提供的方法有助于深入理解细胞间及细胞与组织间的相互作用，推动对心血管疾病发病机制的认识。组织透明化结合后续的三维显微成像技术，可实现对以往难以触及的大范围完整组织区域进行成像，从而获得动脉的精细三维重建图像。本文介绍了TDE和iDISCO组织透明化技术的操作流程，重点阐述了这些方法在实现近乎完全的组织透明性、利用共聚焦/多光子或光片显微镜进行高效成像的同时，保持组织结构完整性的有效性与简便性。
TDE 透明化技术利用水溶性试剂通过调节折射率（RI）实现组织透明，从而有效保留组织中的荧光信号。该方法适用于微米至毫米尺度、无组织收缩的小型血管组织，是一种高效的组织透明化方法。然而，对于毫米至厘米尺度的较大组织，该方法需要更长的处理时间。重要的是，用户可通过调整试剂浓度和孵育时间，灵活优化实验流程以满足特定需求。相比之下，iDISCO 技术采用.......
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披露
SKM、CJY 和 AJRH 是 Easemedcontrol R &D GmbH 和 Co. KG 的联合创始人。
致谢
本工作由德国研究基金会（DFG）SFB1123/Z1项目、德国心血管研究中心（DZHK）DZHK 81X2600282项目以及Corona基金会授予SKM的资助项目（S199/10087/2022）提供经费支持；同时获得ERA-CVD（PLAQUEFIGHT）01KL1808项目以及德国政府对Easemedcontrol R &D GmbH and Co. KG公司AJRH的资助项目支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,2’-硫代乙醇 (TDE) | Sigma | 166782 | 透明化试剂 |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 三维可视化软件；用于对三维图像进行手动分割和追踪的图像处理软件 | |
| 苯甲醇 | Sigma | W213713 | 透明化试剂 |
| 苯甲酸苄酯 | Sigma | B6630 | 透明化试剂 |
| CD16/32 | eBioscience | 14-0161-82 | 封闭溶液 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | TCS-SP8 3X | 用于对完整生物组织或切片进行多维、高分辨率成像的成像设备，可在亚细胞分辨率下实现高特异性成像。 |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 细胞核标记物 |
| 二氯甲烷 (DCM) | Sigma | 270997 | 透明化试剂 |
| 解剖盘-黑色蜡 | Thermo Scientific | S17432 | 主动脉解剖与固定 |
| 体视显微镜 | Leica Microsystems | Stemi 2000 | 小鼠器官解剖 |
| 乙醇 | Sigma | E7023 | 脱脂 |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | Roth | 8040.1 | 灌注缓冲液 |
| Fiji | (ImageJ, NIH) | 用于二维和三维图像的开源图像处理软件 | |
| 山羊抗仓鼠IgG，Cy3 | Dianova | 127-165-099 | 二抗 |
| 山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific / Invitrogen | A-21109 | 二抗 |
| 山羊抗大鼠IgG，Cy5 | Dianova | 712-175-150 | 二抗 |
| 仓鼠抗CD3e | BD Bioscience | 145-2C11 | 泛T细胞标记物 |
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging, 荷兰 | 版本 19.10 | 图像恢复软件；主要用于二维和三维图像去卷积的图像处理软件 |
| 图像处理工作站 | MIFCOM | MIFCOM X5 | 配备所有图像处理软件（包括Leica Application Suite X、Fiji和Imaris）的图像处理工作站，用于共聚焦、多光子和光片显微镜所获取图像的后期处理 |
| Imaris | Bitplane | 版本 8.4 | 图像分析软件；用于三维图像自动分割的图像处理软件 |
| 孵育与旋转仪 | Marshall Scientific | Innova 4230 | 组织 透明化过程中的孵育与旋转装置 |
| iSpacer | Sunjin Lab | IS4020 | 作为样品载体的矩形孔板 |
| 氯胺酮 | Livisto | 麻醉剂 | |
| Leica Application Suite X (LAS-X) | Leica Microsystems | 版本 3.5 | 用于处理Leica显微镜所获取图像的图像处理软件 |
| 光学显微镜 | Leica Microsystems | DM LB | 用于明场成像的成像设备 |
| 光片 显微镜 | LaVision BioTech | Ultramicroscope II | 一种成像技术，通过快速获取薄层光学切片图像，实现对大型生物样本或整只小鼠的快速、高分辨率成像，同时具有低光照损伤的特点。 |
| 多光子显微镜 | Leica Microsystems | TCS-SP5II MP | 一种成像方式，可在长时间内对完整且存活的生物组织进行多维、高分辨率成像，达到亚细胞和分子水平，成像深度大且侵入性极小。 |
| 正常山羊血清 | Sigma | G9023 | 封闭溶液 |
| 多聚甲醛 (PFA) | Sigma | P-6148 | 固定 |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Sigma | P4417-100TAB | 洗涤缓冲液 |
| 猪皮明胶 | Sigma | G1890 | 孵育缓冲液 |
| Quadrol | Sigma | 122262 | CUBIC透明化试剂 |
| 兔抗NF200 | Sigma | N4142 | 泛神经元标记物 |
| 大鼠抗B220 | BD Bioscience | RA3-6B2 | 泛B细胞标记物 |
| 蔗糖 | Sigma | 90M003524V | 脱水 |
| Sytox | Thermo Fisher Scientific | S11380 | 细胞核标记物 |
| 四氢呋喃 | Sigma | 401757 | 透明化试剂 |
| 吐温X-100 | Roth | 3051.1 | 通透 |
| 尿素 | Sigma | U5128 | CUBIC透明化试剂 |
| 二甲苯 | Fisher Chemical | x/0250/17 | 麻醉剂 |
参考文献
- Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
- Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice. Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).
- Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., W....
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重印与许可
