本方案描述了一种构建浅表性膀胱癌原位模型的独特方法。
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摘要
摘要
本研究介绍了一种高效且肿瘤定位精确的原位小鼠膀胱肿瘤模型建立新方法。将雌性C57BL/6J小鼠仰卧位麻醉后，插入24 G静脉穿刺针至膀胱以排空其内容物。随后通过导管引入34 G给药针，在膀胱顶部黏膜处旋转五次以造成局部损伤，然后将其撤出。吸取MB49细胞悬液并连接至30 G给药针，将该针插入膀胱 通过 导管。在压力作用下将肿瘤细胞经导管注入小鼠膀胱壁黏膜下层。该技术对小鼠造成的创伤极小，成瘤率高，且肿瘤位置固定，具有操作简便、可重复性好的特点。该模型为膀胱癌膀胱内治疗策略的研发提供了理想的实验平台，有助于推动和优化该恶性肿瘤的治疗方案。
引言
膀胱癌是全球重大健康负担之一，在发病率和预后方面存在显著的性别差异。该恶性肿瘤具有不同的分子亚型，每种亚型均与特定的致病通路相关。非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）与肌层浸润性膀胱癌（MIBC）在分子和病理特征上存在显著差异1,2。NMIBC约占病例总数的75%，其肿瘤起源于移行上皮，局限于原位，无转移或扩散。相反，MIBC的特征是癌细胞侵入膀胱肌层，并伴有较高的播散风险，在临床实践中常需行膀胱切除术3。
在临床前研究中，能够准确模拟疾病表浅阶段的模型对于评估药物治疗至关重要。因此，建立表浅性膀胱原位癌模型具有极其重要的意义，可作为临床药物开发及新型灌注治疗研究的关键工具。
小鼠原位膀胱癌模型的建立传统上面临诸多挑战。化学诱导模型通常始于表浅性肿瘤，但可能进展为浸润性肿瘤，其变异性限制了其在大规模实验中的应用4。传统的原位移植模型依赖于通过膀胱壁注射肿瘤细胞5，难以真实再现表浅性膀胱癌。已有研究尝试其他方法，包括黏膜损伤联合肿瘤细胞灌注6,7,8,9,10，但这些方法受限于高死亡率和低成瘤率，阻碍了其广泛应用。
本研究旨在建立一种新的浅表性膀胱癌模型构建方法，与现有模型相比，该方法具有更高的稳定性、更低的死亡率以及固定的肿瘤定位。通过更精确地模拟疾病早期阶段，该模型有望加强预防性和治疗性干预措施的严格评估，从而推动膀胱癌治疗的发展。
方案
所有动物实验方案和操作均经中国天津医科大学动物实验伦理审查委员会批准（批准号：SYXK: 2020-0010）。本研究使用6至8周龄的雌性C57BL/6J小鼠。动物饲养于环境受控的条件下，包括12小时光照-黑暗循环、温度21–25 °C、湿度30%–70%可调，以及自由获取食物和水，除非另有说明。所用试剂和设备的详细信息列于 材料表.
1. 细胞准备
- 在完全添加10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养小鼠膀胱癌细胞系MB49，以支持其最佳生长。
- 将细胞培养物置于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中，在标准条件下维持培养。每2–3天更换一次培养基，以确保细胞健康和存活率。
- 采用标准化的胰蛋白酶消化法收集细胞。加入胰蛋白酶并短暂孵育后，轻轻吹打以使细胞从培养瓶表面脱落。
- 使用血细胞计数板对收集的细胞进行计数，以确定确切的细胞密度。将细胞重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成浓度为2 × 103/µL的单细胞悬液。将此悬液置于冰上保存，以维持细胞活性。
2. 动物准备
- 将小鼠分组饲养（每笼5只），置于独立通风的聚碳酸酯笼具中。
- 在研究开始前，让小鼠适应环境7天。
3. 动物原位肿瘤模型的建立
- 对小鼠实施麻醉 通过 使用2.5% Avertin溶液进行腹腔注射（遵循机构批准的实验方案）。
- 等待小鼠达到适合手术的麻醉水平，表现为呼吸频率减慢且深度增加、眼睑和角膜反射消失、肌张力和反射反应减弱，以及对尾部夹捏无反应。
- 将麻醉后的小鼠置于仰卧位，以方便操作。
- 使用24 G静脉留置针（去除针芯）进行尿道导尿操作。在导管上充分涂抹润滑剂，以减轻不适并促进顺利插入。
- 保持小鼠仰卧位，辨认位于阴唇皱襞后方、阴道前方的尿道。
- 以45度角接近尿道，以便在耻骨下缘下方穿行。调整为更小的角度，将导管沿尿道引导进入膀胱。
- 避免在遇到阻力时施加过大的力量，以免导致尿道或膀胱穿孔。通过观察导管内是否有尿液流出，确认导管已位于膀胱腔内。
- 轻轻按压小鼠下腹部，以促进膀胱内尿液排出。确保膀胱完全排空，为后续实验步骤做好准备。
- 轻柔地将24 G静脉导管推向膀胱顶部，确保导管尖端与膀胱顶端接触。
- 确认接触后，松开导管，使其轻微回缩。保持导管相对于小鼠的固定位置，以确保稳定性并防止脱落。
- 将改造后的34 G给药针插入24 G导管中，推进针头直至到达膀胱顶端。
- 针头定位后，旋转六次，以在膀胱顶端造成局部黏膜损伤。完成旋转后，沿导管小心拔出针头。
- 将30 G分配针连接到1 mL注射器的顶部，确保针头与注射器之间连接牢固。
- 连接后，轻轻回拉活塞，将预先配制的浓度为 2 x 10³/µL 的 MB49 细胞悬液吸入注射器中。确认细胞悬液已完全吸入注射器，且无气泡混入。
- 将30 G给药针插入24 G导管中。确保针头在导管内正确对齐并固定。
- 定位后，对1 mL注射器的推杆施加压力，注入步骤1中制备的溶液。持续对推杆施加稳定压力60秒，以确保内容物完全注入且体积无明显减少。
- 60 秒后，小心地将注射器和 30 G 分注针从导管中抽出。
4. 术后监测
- 将麻醉后的小鼠仰卧置于加热垫上，直至翻正反射恢复。
- 确保动物在恢复足够意识之前始终有人看护。
- 在动物完全恢复之前，不得将其放回与其他动物同笼饲养的环境中。
结果
通过注射台盼蓝初步评估了黏膜下注射的效果。注射后，染料在黏膜下层的分布情况清晰可见，证实了注射物质的精确且可控的递送（图1）。
肿瘤的发育过程被严密监测。在植入后约14天，观察到明显的血尿发生率，这是膀胱肿瘤形成的关键症状。肿瘤被确认牢固地定植于膀胱黏膜下层。这些肿瘤的早期生长模式表现为扩张性、非侵袭性生长，符合非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）的分类。组织学检查证实肿瘤未侵犯肌层，局限于黏膜下层，符合非肌层浸润性膀胱癌的诊断标准（图2）。
大体观察进一步证实了肿瘤形成过程。肿瘤在形态上具有明显特征，呈现乳头状生长，大小和形状各异（图3）。此外，肿瘤生长相对缓慢，为实验研究提供了充足的时间（图4）。
在本研究中，为了验证肿瘤位置及排除尿道种植，我们采用MB49-luc细胞进行移植，随后进行小动物成像。 图5 显示 体内 肿瘤细胞注射35天后采集的生物发光图像，清晰显示肿瘤位于膀胱内，未见异位种植（如尿道）的迹象。
肿瘤组织通常在植入后14天可被检测到。根据我们的经验，到第14天时，70%或更多的小鼠会出现血尿。该操作通常不会导致动物死亡。若不进行干预，到第60天时需实施安乐死。安乐死的标准包括嗜睡、恶病质、毛发竖立、弓背、无反应行为，或初始体重下降≥20%。
图 1：台盼蓝黏膜下注射的效果。使用台盼蓝演示黏膜下注射的效果。箭头指示注射位点，即使经过三次 PBS 洗涤后，残留的台盼蓝仍可见。请点击此处查看本图的放大版本。
图2：肿瘤植入的组织学验证。 通过苏木精-伊红（H&E）染色在黏膜下层确认肿瘤植入。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：膀胱肿瘤的直接可视化。 膀胱肿瘤的直接可视化图像，显示肿瘤基底部明显的血管增生。比例尺：2 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：植入后第 35 天的肿瘤状态。 植入后第 35 天对肿瘤状态的评估。肿瘤基底部的膀胱壁显示出扩张且结构紊乱的血管，伴有广泛扩展的肿瘤基底。比例尺：2 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5: 体内 膀胱癌的生物发光成像 体内 小鼠植入 MB49-LUC 膀胱癌细胞后第 35 天的生物发光成像。图像采用颜色编码表示荧光强度：红色表示高荧光（高肿瘤活性），蓝色表示低荧光（低肿瘤活性）。在膀胱区域选定感兴趣区域（ROI），用于定量肿瘤特异性的生物发光信号。结果显示肿瘤定位于膀胱内，未见异位种植的证据（如尿道内）。低信号区域可能是高信号区域的散射光穿透组织所致，并不一定代表肿瘤细胞的存在。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6：癌细胞膀胱内灌注示意图。 膀胱内灌注癌细胞以建立浅表性膀胱癌原位模型的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 7：改装分配针头的配置。改装分配针头在24 G导管内的布置。（A）34 G分配针头置于24 G导管内的照片。（B）30 G分配针头置于24 G导管内的照片。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
膀胱癌的研究依赖于动物模型，这些模型对于基础和应用研究都不可或缺。为了更好地模拟肿瘤生长环境，原位膀胱肿瘤模型相较于皮下肿瘤模型提供了一种更优的方法11。
目前，原位膀胱癌模型可根据实验目的分为两大类：一类使用免疫缺陷型小鼠，例如患者来源的异种移植（PDX）模型1和细胞系来源的异种移植（CDX）模型5；另一类使用免疫健全型小鼠，例如同源移植模型12。
PDX 模型涉及将患者来源的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，从而实现对肿瘤对化疗药物反应的个体化评估。然而，这些小鼠缺乏完整的免疫系统，这为研究免疫相关机制带来了显著局限性。类似地，CDX 模型使用人类来源的肿瘤细胞系，虽然具有较高的成瘤率，但也同样缺乏免疫微环境5。
在免疫功能健全的小鼠中，构建原位膀胱肿瘤的主要方法是将小鼠来源的 MB49 细胞系注入膀胱壁，以形成原位膀胱肿瘤12。该操作需要进行剖腹手术并实施膀胱内注射肿瘤细胞，存在肿瘤细胞泄漏和针道种植等挑战。因此，难以建立表浅性膀胱肿瘤模型，从而阻碍了对人类膀胱癌从非肌层浸润性向肌层浸润性阶段进展过程的准确模拟13。
为了建立浅表性原位膀胱肿瘤，传统的建模技术通常需要使用酸碱溶液或电灼等方法诱导黏膜损伤，随后将肿瘤细胞悬液经膀胱内灌注，并保留2小时或更长时间8,14。然而，这些方法存在若干显著局限性。首先，它们无法确保膀胱内肿瘤种植的数量和位置具有一致性，从而影响模型的可重复性。此外，这些技术常导致严重的膀胱损伤，造成较高的动物死亡率。由此产生的膀胱瘢痕形成及容量减小，为需要多次膀胱内灌注的新型治疗药物研究带来了重大障碍。这不仅削弱了实验结果的可靠性，也引发了有关动物福利的伦理问题。
因此，建立一种能够准确模拟人类浅表性膀胱癌的动物模型，将为研究肿瘤的增殖与进展提供更理想的实验平台。这种模型对于研发新型膀胱内治疗药物以及深入理解膀胱癌生物学特性具有重要价值。
本研究阐明了一种 原位 一种采用钝头给药针在压力下将肿瘤细胞注射至黏膜下的植入方法（图6). 本研究利用MB49细胞系和雌性C57BL/6J小鼠构建模型 原位 肿瘤模型
在构建该模型的过程中，正常膀胱黏膜表面的保护层对直接灌注肿瘤细胞构成了重大挑战，常常阻碍有效的肿瘤形成8。因此，有必要使用34 G钝针在膀胱顶部诱导局部损伤，以创造适合肿瘤细胞植入的“土壤”环境。
本研究中使用的34 G和30 G给药针头经过了部分改造。34 G针头的尖端被夹紧，形成略微不规则的末端，以增强其造成黏膜损伤的能力。34 G和30 G针头的连接部位均已被修剪，以确保其在24 G导管上暴露的部分分别为0.3 mm至0.5 mm（图7A）和1 mm至1.5 mm（图7B）。
整个操作过程可在10分钟内完成，无需开腹手术或长时间的尿道结扎即可实现膀胱内灌注。然而，该方法也存在局限性。由于建模过程涉及多个技术步骤——例如将留置导管经尿道插入膀胱，以及旋转34G钝针以在不穿破膀胱壁的前提下达到适当的黏膜损伤程度——实验人员需要经过练习以提高肿瘤植入的成功率。此外，若在造成黏膜损伤或注射肿瘤细胞时用力过大，可能导致膀胱穿孔或将肿瘤细胞植入肌层。
综上所述，该技术相较于传统方法具有显著优势，包括缩短操作时间、降低死亡率，以及在肿瘤定位和生长方面具有更高的稳定性，且无需侵入性操作或长时间膀胱内留置。这些优点使其成为评估膀胱癌新治疗药物的临床前研究中的重要工具。
披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本研究由天津市卫生健康行业重点攻关项目基金（项目编号：TJWJ2022XK014）、天津市教育委员会科研项目基金（项目编号：2022ZD069）、天津泌尿外科研究所人才资助项目（项目编号：MYSRC202310）、天津医科大学第二医院临床医学研究项目基金（项目编号：2023LC03）、天津医科大学第二医院青年基金（项目编号：2022ydey15）以及天津医科大学第二医院泌尿外科人才培养项目（项目编号：MNRC202313）资助。资助方参与了稿件的撰写、审阅和批准过程。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 34 G 分配针 | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China | SGL-362 | |
| 30 G 分配针 | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China | SGL-362 | |
| Avertin | Sigma-Aldrich LLC | T48402 | |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich LLC | 302643 |
参考文献
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