建立小鼠浅表性膀胱癌模型 通过 一种膀胱内细胞给药技术

摘要

本方案描述了一种构建浅表性膀胱癌原位模型的独特方法。

摘要

本研究介绍了一种高效且肿瘤定位精确的原位小鼠膀胱肿瘤模型建立新方法。将雌性C57BL/6J小鼠仰卧位麻醉后，插入24 G静脉穿刺针至膀胱以排空其内容物。随后通过导管引入34 G给药针，在膀胱顶部黏膜处旋转五次以造成局部损伤，然后将其撤出。吸取MB49细胞悬液并连接至30 G给药针，将该针插入膀胱 通过 导管。在压力作用下将肿瘤细胞经导管注入小鼠膀胱壁黏膜下层。该技术对小鼠造成的创伤极小，成瘤率高，且肿瘤位置固定，具有操作简便、可重复性好的特点。该模型为膀胱癌膀胱内治疗策略的研发提供了理想的实验平台，有助于推动和优化该恶性肿瘤的治疗方案。

引言

膀胱癌是全球重大健康负担之一，在发病率和预后方面存在显著的性别差异。该恶性肿瘤具有不同的分子亚型，每种亚型均与特定的致病通路相关。非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）与肌层浸润性膀胱癌（MIBC）在分子和病理特征上存在显著差异^1,2。NMIBC约占病例总数的75%，其肿瘤起源于移行上皮，局限于原位，无转移或扩散。相反，MIBC的特征是癌细胞侵入膀胱肌层，并伴有较高的播散风险，在临床实践中常需行膀胱切除术³。

在临床前研究中，能够准确模拟疾病表浅阶段的模型对于评估药物治疗至关重要。因此，建立表浅性膀胱原位癌模型具有极其重要的意义，可作为临床药物开发及新型灌注治疗研究的关键工具。

小鼠原位膀胱癌模型的建立传统上面临诸多挑战。化学诱导模型通常始于表浅性肿瘤，但可能进展为浸润性肿瘤，其变异性限制了其在大规模实验中的应用⁴。传统的原位移植模型依赖于通过膀胱壁注射肿瘤细胞⁵，难以真实再现表浅性膀胱癌。已有研究尝试其他方法，包括黏膜损伤联合肿瘤细胞灌注^6,7

方案

所有动物实验方案和操作均经中国天津医科大学动物实验伦理审查委员会批准（批准号：SYXK: 2020-0010）。本研究使用6至8周龄的雌性C57BL/6J小鼠。动物饲养于环境受控的条件下，包括12小时光照-黑暗循环、温度21–25 °C、湿度30%–70%可调，以及自由获取食物和水，除非另有说明。所用试剂和设备的详细信息列于 材料表.

1. 细胞准备

1. 在完全添加10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养小鼠膀胱癌细胞系MB49，以支持其最佳生长。
2. 将细胞培养物置于37 °C、含5% CO₂的湿化培养箱中，在标准条件下维持培养。每2–3天更换一次培养基，以确保细胞健康和存活率。
3. 采用标准化的胰蛋白酶消化法收集细胞。加入胰蛋白酶并短暂孵育后，轻轻吹打以使细胞从培养瓶表面脱落。
4. 使用血细胞计数板对收集的细胞进行计数，以确定确切的细胞密度。将细胞重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成浓度为2 × 10³/µL的单细胞悬液。将此悬液置于冰上保存，以维持细胞活性。

2. 动物准备

1. 将小鼠分组饲养（每笼5只），置于独立通风的聚碳酸酯笼具中。
....

结果

通过注射台盼蓝初步评估了黏膜下注射的效果。注射后，染料在黏膜下层的分布情况清晰可见，证实了注射物质的精确且可控的递送（图1）。

肿瘤的发育过程被严密监测。在植入后约14天，观察到明显的血尿发生率，这是膀胱肿瘤形成的关键症状。肿瘤被确认牢固地定植于膀胱黏膜下层。这些肿瘤的早期生长模式表现为扩张性、非侵袭性生长，符合非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）的分类。组织学检查证实肿瘤未侵犯肌层，局限于黏膜下层，符合非肌层浸润性膀胱癌的诊断标准（图2）。

大体观察进一步证实了肿瘤形成过程。肿瘤在形态上具有明显特征，呈现乳头状生长，大小和形状各异（图3）。此外，肿瘤生长相对缓慢，为实验研究提供了充足的时间（图4）。

在本研究中，为了验证肿瘤位置及排除尿道.......

讨论

膀胱癌的研究依赖于动物模型，这些模型对于基础和应用研究都不可或缺。为了更好地模拟肿瘤生长环境，原位膀胱肿瘤模型相较于皮下肿瘤模型提供了一种更优的方法¹¹。

目前，原位膀胱癌模型可根据实验目的分为两大类：一类使用免疫缺陷型小鼠，例如患者来源的异种移植（PDX）模型¹和细胞系来源的异种移植（CDX）模型⁵；另一类使用免疫健全型小鼠，例如同源移植模型¹²。

PDX 模型涉及将患者来源的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，从而实现对肿瘤对化疗药物反应的个体化评估。然而，这些小鼠缺乏完整的免疫系统，这为研究免疫相关机制带来了显著局限性。类似地，CDX 模型使用人类来源的肿瘤细胞系，虽然具有较高的成瘤率，但也同样缺乏免疫微环境⁵。

在免疫功能健全的小鼠.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
34 G 分配针	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
30 G 分配针	Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China	SGL-362
Avertin	Sigma-Aldrich LLC	T48402
台盼蓝	Sigma-Aldrich LLC	302643