本方案详细介绍了一种通过“环路法”制备四种碳-11放射性示踪剂的详细步骤[11C]甲基化。我们描述了合成[11C]ER-176 以及另外三种放射性示踪剂的数据：[11C]MRB，[11C]mHED，以及[11C]PiB。与传统反应容器相比，环路法可实现更高效的合成，并提高放射化学产率。11C]甲基化
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摘要
摘要
一个成功的碳-11放射性示踪剂正电子发射断层扫描成像项目需要快速、高效且可靠的合成方法，这要求配备现场回旋加速器和放射化学团队，以及经过培训、能够在碳-11放射性核素特殊限制条件下操作的临床工作人员。本研究探讨了采用封闭溶剂“环路法”对四种示踪剂进行碳-11放射性标记的优越性与优势，所制备的放射性配体包括[11C]ER-176、[11C]MRB、[11C]mHED 和 [11C]PiB。
在相同的全自动平台上合成相同放射性示踪剂的过程中，将“环路法”与传统的基于反应器的碳-11甲基化方法进行了比较。此外，还全面概述了[11C]ER-176放射性示踪剂的临床研究制备过程。以[11C]ER-176的制备为例表明，非均相烷基化中的密闭溶剂“环路法”效率更高，其放射化学纯度优异（99.6 ± 0.6%，n = 25），放射化学产率更高且更稳定（合成结束时（EOS）= 5.4 ± 2.2 GBq，n = 25），优于反应器法（EOS = 1.6 ± 0.5 GBq，n = 6）；摩尔活度也更高（环路法 = 194 ± 66 GBq/µmol，n = 25；反应器法 = 132 ± 78 GBq/µmol，n = 6），同时平均反应步骤缩短约5分钟。
引言
在分子影像学的多种技术中，正电子发射断层扫描（PET）因其能够解析与特定生理靶点或感兴趣区域相关的生化过程而独具特色1,2。PET 具有特征性的高灵敏度和非侵入性，可用于疾病病理生理过程的 体内 可视化与定量分析，常常揭示出通过计算机断层扫描（CT）3 或磁共振成像（MRI）4 等解剖学成像技术无法观察到的靶点。现代分子影像学常将 PET 与 CT 或 MRI 结合使用（分别为 PET/CT 和 PET/MR），利用 PET 高对比度的分辨率和可量化的成像参数，提供高精度的衰减校正图（PET/CT）以及更高的空间分辨率（PET/MR）5，从而克服了诸如镓-68 和铷-82 等放射性核素释放的正电子具有较高动能所带来的部分技术挑战6。这些双模态成像技术整合了各模态的独特优势，为临床医生或研究人员提供了关于研究对象的丰富且配准良好的解剖与生化信息5。
该成像技术的临床应用范围十分广泛，能够可视化并测量多种分子水平的生理过程，例如葡萄糖代谢7,8、神经递质受体结合9、心肌灌注10以及各种神经系统疾病11。在临床应用之外，正电子发射断层扫描（PET）的固有特性使其在诊断和治疗性药物研发中发挥关键作用，可通过直接观察药理学、药代动力学与药效学之间的相互作用，定量测定结合势能（BP）、生物分布、分布容积（VT）以及药物-受体占有率（RO%）等参数。这进而有助于判断化合物是否以有效剂量（ED50）浓度到达靶点、穿透血脑屏障的有效程度、化合物的代谢稳定性，以及合适的剂量和给药间隔11。
在开发用于PET成像的有效探针时，首先需确定合适的生物标志物并选择相应的配体，随后将生物分子与适当的PET放射性核素进行放射性标记，从而获得用于PET研究的放射性示踪探针。在用于研究生物学、药理学或医学问题的PET放射性核素中，碳-11因其合成上的灵活性和优良的物理特性，能够在多种生物分子和符合条件的配体中广泛应用6。碳-11具有99.8%的正电子发射率和20.4分钟的半衰期12，允许在短时间内对受试者进行多次给药，同时仍可进行多步合成。然而，这些优势要求具备现场回旋加速器和放射化学操作的设施条件5。
此类设施需要可靠、高效且可重复的甲基化方法，以实现前体分子的放射性标记，通常使用亲电性[11C]碘甲烷（[11C]CH3I）或[11C]三氟甲磺酸甲酯（[11C]CH3OTf）作为底物13。制造商提供的放射合成模块通常采用反应容器方式进行[11C]甲基化反应14。该方法包括在[11C]碘甲烷或[11C]三氟甲磺酸甲酯输送到位后冷却容器以有效保留试剂，密封并加热容器以促进反应进行，随后淬灭反应，再将反应产物转移至高效液相色谱（HPLC）系统进行半制备级纯化13。尽管该方法有效15，但存在多个潜在的结构失效点，涉及小瓶隔垫、针头及相关传输管路。
对一种更可靠且可重复的甲基化方法的需求，引导了我们对多种碳-11放射性配体合成方案中采用封闭溶剂修饰的探索与研究。该方法旨在克服传统反应容器法的局限性，同时保持或提高放射性标记效率。
![PET示踪剂合成过程示意图；回旋加速器装置，[11C]CO2路径，环路/反应器方法。](/files/ftp_upload/67406/67406fig2.jpg "figure-introduction-1")
图2：反应器合成与环路方法的设计与流程。 请点击此处查看此图的放大版本。
笼溶剂化学通过将前体溶液涂布于大面积的载体材料或结构表面，随后使气态标记试剂与涂覆材料接触，从而有望高效地捕获标记试剂并促使其发生反应16,17。该方法增强了两种反应相之间的接触程度与接触质量16,18。此类技术的多种实现方式与变体最早自1985年起已有文献记载16,17,18,19,20，已成功应用于[11C]碘甲烷、[11C]三氟甲磺酸甲酯以及格氏试剂[11C]二氧化碳的放射标记反应20。Wilson 等人最初描述的笼溶剂“环路法”化学进一步优化了该技术，该方法无需额外的支撑材料，仅利用高效液相色谱（HPLC）纯化环路本身所提供的支持，且无需对反应环境进行加热或冷却13。研究发现，笼溶剂“环路法”放射标记可使碘甲烷和三氟甲磺酸甲酯的[11C]甲基化反应具备转移损失极小、放射化学产率高、摩尔活度高、反应时间缩短以及操作简便等优点7,21,22,23。
本文介绍了我们课题组对“环路法”[11C]甲基化技术，最初由 Wilson 描述13以及其他后续研究者14,15,18,21,22,23，（参见 图2）通过机械修饰（参见 图3）添加至我们的合成模块（下文简称 模块）。尽可能贴近简约这一理想理念，这些机械改造被控制在最低限度且易于实现，从而整体上降低了工程复杂性，仅添加了与模块制造商默认反应容器放射标记装置相关联的必要组件。这一点体现在我们决定采用模块制造商已提供并预装的不锈钢HPLC纯化环，如下所述，该纯化环在所研究的合成中被证实具有兼容性和有效性。我们详尽地讨论了在临床研究生产中用于放射性示踪剂[18F]标记的完整且经过验证的环路法放射标记方案11C]-(R)-N-秒叔丁基-4-(2-氯苯基)-N甲基喹唑啉-2-甲酰胺，[11C]ER-176 (1)，使用碳-11碘甲烷进行标记。此外，我们通过反应器法和环路法对另外三种放射性配体的放射标记效率相关多项属性进行了比较，其中包括（S,S)-[11C]甲基瑞波西汀([11C]MRB (2)),[11C]-间羟基麻黄碱 ([11C]mHED (3)），以及 2-[4-[(11C)甲氨基]苯基]-1,3-苯并噻唑-6-醇([11C]PiB (4)）在本机构开发，经合成批次分析确定（见 表1 和 图1）这一对比清楚地说明了采用“环路法”放射性标记所带来的显著优势，例如放射化学产率和摩尔活度的提升，这种优势通过简单、低成本的模块化改造即可在放射化学实验室中实现。
方案
注意：所有设备操作和合成均在铅屏蔽的热室或微型热室内进行。警告：回旋加速器会产生并使用高能正电子发射粒子。该区域使用校准的盖革计数器进行监测，人员需佩戴辐射安全机构发放的剂量计环和剂量计徽章。所有人员均接受过高能放射性物质操作的培训。
所有合成均按照本机构的标准操作程序（SOP）在洁净且已灭菌的模块上进行。模块反应部分的清洁过程包括使用 1 N HCl、水、丙酮和乙腈。同时，模块的制剂部分则用水和乙醇进行清洁和灭菌。
1. 通过环路法对[ 11C]ER-176 (1) 进行放射性标记
注意：有关制备[11C]ER-176(1)所用材料的列表，请参见材料表。
- 为循环法生产重新连接模块（参见图4A-D）。将一个V8阀连接至直接接入HPLC循环管路的接头，以绕过反应容器。
- 在模块上进行所有生产操作之前，先用100 mL/min的氢气流对甲烷（CH4）炉在350 oC下预热20分钟。随后冷却至45 oC再继续操作。
- 在模块上进行所有生产操作之前，先用50 mL/min的氦气流对CH4捕集阱在120 oC下预热20分钟。随后冷却至70 oC再继续操作。
- 在模块上进行所有生产操作之前，先用50 mL/min的氦气流对碘甲烷捕集阱在190 oC下预热20分钟。随后冷却至50 oC再继续操作。
- 模块的试剂加载：
- 使用100 µL注射器，通过六通阀内部HPLC循环管路位置#1处的接头注入以下混合物：(R)-N-仲丁基-4-(2-氯苯基)-喹唑啉-2-甲酰胺（1.0 ± 0.05 mg）溶于二甲基亚砜-d6（100 ± 10 μL）和6 N氢氧化钠（4 μL）中。
注：选择氘代溶剂是因为其以安瓿形式易得，且在制造过程中通常经过蒸馏，确保无水。 - 向V4储液罐中加入3.0 mL的0.9%氯化钠注射液。
- 向V5储液罐中加入1.0 mL的200度乙醇。
- 向V6储液罐中加入10 mL无菌去离子水。
- 向大接收瓶中加入25 mL无菌去离子水。
- 向配制瓶中加入6.0 mL的0.9%氯化钠注射液。
- 确保输送管路连接至无菌预组装的最终产品小瓶。
- 用37:63（v/v）的乙腈与20 mM氢氧化铵混合液配制流动相。
- 用四倍柱体积的流动相对半制备柱进行平衡。
注：所用色谱柱为C18 100 mm x 10 mm反相柱。
- 使用100 µL注射器，通过六通阀内部HPLC循环管路位置#1处的接头注入以下混合物：(R)-N-仲丁基-4-(2-氯苯基)-喹唑啉-2-甲酰胺（1.0 ± 0.05 mg）溶于二甲基亚砜-d6（100 ± 10 μL）和6 N氢氧化钠（4 μL）中。
- 在自动化模块准备过程中，使用11 MeV回旋加速器以55 μA电流对碳-11回旋加速器靶（1%氧气，99%氮气）轰击60–80分钟，在双束流靶上通过14N(p,α)11C核反应生成[11C]二氧化碳。
- 在将[11C]二氧化碳从回旋加速器卸载至模块前约20分钟，点击开始按钮启动[11C]ER-176合成的验证时间程序。在接收放射性[11C]二氧化碳前，使CH4柱冷却至45 oC（参见图3）。使碳分子筛柱捕集阱（CH4捕集阱）冷却至-75 oC。
- 启动模块中内置的方法，通过干法化学工艺将[11C]二氧化碳转化为[11C]碘甲烷，具体步骤如下：
- 在350 oC下，使[11C]二氧化碳与氢气在镍催化剂（Shimalite-Nickel）上反应，生成[11C]甲烷。使用阿斯卡瑞特捕集阱（氢氧化钠）保留未转化的[11C]二氧化碳及生成的水。
- 在-75 oC下，将生成的[11C]甲烷捕集于碳分子筛柱捕集阱（CH4捕集阱）中，以进一步纯化和浓缩。为释放被捕集的[11C]甲烷，将碳分子筛柱加热至80 oC。
- 在720 oC下，使纯化的[11C]甲烷与单质碘反应，通过氦气循环泵生成[11C]碘甲烷（[11C]CH3I），其中生成的碘化氢由另一阿斯卡瑞特捕集阱保留，未转化的[11C]甲烷则返回循环过程。
- 在室温下，将循环过程中积累的[11C]CH3I捕集于碘甲烷（MeI）柱上。
- 循环过程结束后，在氦气流（15 mL/min）下将MeI捕集阱中收集的[11C]CH3I加热至190 oC释放，绕过MeTf柱，并通过单向阀导入含有预加载前体溶液（步骤1.5.1）的1.5 mL不锈钢循环管路中。
- 当[11C]CH3I通过循环管路180秒后，将反应混合物注入半制备HPLC柱进行纯化。HPLC条件如下：流动相为37:63（v/v）乙腈:20 mM氢氧化铵，流速5.0 mL/min，紫外检测波长235 nm；[11C]ER-176的保留时间（tR）约为12–14分钟。参见图5。
- 将馏分样品收集至含有25 mL无菌去离子水的大接收瓶中。将稀释后的混合物加载至C18轻型固相萃取（SPE）小柱上。
- 用额外10 mL无菌去离子水洗涤产物(1)。
- 使用200度乙醇 （1 mL）从C18轻型SPE小柱上洗脱目标产物。将洗脱液直接导入预加载有0.9%氯化钠注射液（6 mL）的配制瓶中。
- 通过V4储液罐用额外3 mL的0.9%氯化钠注射液进一步冲洗C18轻型SPE小柱。
- 将最终溶液收集至配制瓶中（约10 mL），并通过0.22-μm除菌滤膜转移至预组装的无菌、无热原、USP I型50 mL玻璃小瓶中，小瓶以橡胶隔垫密封并用铝盖压封。
- 使用遥控操作装置，从最终产品小瓶中取出一份等分试样作为质量控制（QC）样品。对该样品进行多项QC检测，以确保其符合既定 标准后方可放行并用于患者给药（参见表2）。
注：使用[11C]CH3I的循环法程序进行(2)的放射标记；生成并使用[11C]CH3OTf制备(3)和(4)（参见补充文件1）。- 为遵循该设施常规的质量控制分析流程，使用遥控操作装置将最终产品小瓶中的样品转移至TB注射器，再通过铅屏蔽运输容器送至质量控制室。
- 在铅屏蔽区域（L区），将样品排出至无热原试管中，再分装至较小的玻璃小瓶（50–100 μL）中，用于高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）分析。
- 用无热原水稀释第二份样品至适合细菌内毒素分析的浓度。
- 将最终产品溶液样品接种至胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和流体硫乙醇酸盐培养基（FTM）中作为无菌检查样品。在14天内培养并观察样品是否生长。
- 将少量等分试样滴加至pH试纸上，通过目视判断最终产品溶液的酸碱性。
2. 用于[11C]ER-176 (1) 放射性标记的反应容器法
- 根据内部清洁规程，确保模块已彻底清洁。
- 使用 1 N HCl、水、丙酮和乙腈清洁模块的反应部分，使用水 followed by 乙醇清洁并灭菌模块的配制部分。
- 在模块进行所有生产前，以 100 mL/min 的氢气流在 350 oC 下对甲烷（CH4）炉进行 20 分钟的预处理。继续操作前冷却至 45 oC。
- 在模块进行所有生产前，以 50 mL/min 的氦气流在 120 oC 下对 CH4 捕集阱进行 20 分钟的预处理。继续操作前冷却至 70 oC。
- 在所有生产前，以 50 mL/min 的氦气流在 190 oC 下对 MeI 捕集阱进行 20 分钟的预处理。继续操作前冷却至 50 oC。确保 V8 管路已连接至容器中的针头。
- 使用氦气进行泄漏测试，测试范围从接收阀（V24 至 V16）到内部 MeI 环路，以及从 V8 到容器，使用 V23 作为密封/排气源。
- 模块的试剂装载：
- 向反应容器中加入以下物质：(R)-N-仲丁基-4-(2-氯苯基)-喹唑啉-2-甲酰胺（1.0 ± 0.05 mg）溶于二甲基亚砜-d6（100 ± 10 μL）中，并加入 6 N 氢氧化钠（4 μL）。
- 向 V2 储液罐中加入 1.0 mL 的 37:63 乙腈:20 mM 氢氧化铵溶液。
- 向 V4 储液罐中加入 3.0 mL 的 0.9% 注射用氯化钠溶液。
- 向 V5 储液罐中加入 1.0 mL 的 200 度乙醇。
- 向 V6 储液罐中加入 10 mL 无菌去离子水。
- 向大接收瓶中加入 25 mL 无菌去离子水。
- 向配制瓶中加入 6.0 mL 的 0.9% 注射用氯化钠溶液。
- 确保输送管路已连接至预组装的无菌终产品小瓶。
- 用 HPLC 流动相（37:63 (v/v) 乙腈:20 mM 氢氧化铵）填充一个储液罐，并连接至 HPLC 泵。
注：所用半制备色谱柱与上述相同，并用流动相预平衡（4 柱体积）。
- 在自动化模块准备过程中，使用 11 MeV 回旋加速器以 55 μA 的束流强度对碳-11 回旋加速器靶材（1% 氧气，99% 氮气）进行 60–80 分钟的轰击，通过 14N(p,α)11C 核反应在双束流靶上生成 [11C]二氧化碳。
- 在将 [11C]二氧化碳从回旋加速器卸载至模块前约 20 分钟，点击开始按钮，启动 [11C]ER-176 合成的验证时间表。在接收放射性 [11C]二氧化碳前，使 CH4 柱冷却至 45 oC（见图 3）。使碳分子筛柱捕集阱（CH4 捕集阱）冷却至 -75 oC。
- 让模块内嵌的方法按以下步骤进行，通过干法化学工艺将 [11C]二氧化碳转化为 [11C]碘甲烷：
- 在 350 oC 下，使 [11C]二氧化碳与氢气在镍催化剂（Shimalite-Nickel）上反应，转化为 [11C]甲烷。使用阿斯卡里特捕集阱（氢氧化钠）保留未转化的 [11C]二氧化碳和生成的水。
- 在 -75 oC 下将 [11C]甲烷捕集于碳分子筛柱上，以进一步纯化和浓缩。为释放 [11C]甲烷，将碳分子筛柱加热至 80 oC。
- 在 720 oC 下，使纯化的 [11C]甲烷与单质碘反应生成 [11C]碘甲烷，通过循环气体泵实现，其中反应生成的氢气被另一个阿斯卡里特捕集阱保留，而未转化的 [11C]甲烷返回循环过程，称为内部循环。
- 在室温下将循环过程中积累的 [11C]碘甲烷捕集于 MeI 柱上。
- 循环过程结束后，在氦气流（30 mL/min）下将多孔聚合物吸附捕集阱加热至 190 oC，释放收集的 [11C]碘甲烷，并通过单向阀引导至 3 mL 反应容器，用于对（1）进行碳-11放射性标记。
- 一旦 [11C]碘甲烷的生成和积累 达到 平台期 ，旁路三氟甲磺酸银柱，将放射性气体通过 V8 导入含有前体混合物的反应容器中。让 [11C]碘甲烷鼓泡 3 分钟，然后密封反应容器并在 80 oC 下加热 5 分钟。
- 标记完成后 5 分钟，将反应容器冷却至 30 oC，并用 V2 储液罐中的 1 mL 流动相稀释。
- 将混合物注入半制备型 HPLC 柱进行纯化，HPLC 条件如下：流动相为 37:63 (v/v) 乙腈:20 mM 氢氧化铵，流速 5.0 mL/min，紫外检测波长 235 nm；[11C]ER-176 （1） 的 tR：约 9–11 分钟，见图 6。
- 将馏分收集至含有 25 mL 无菌去离子水的大接收瓶中。将此稀释后的混合物加载至 C18 轻型固相萃取（SPE）小柱上。
- 用额外的 10 mL 无菌去离子水洗涤被捕获的产物 （1）。
- 使用 200 度乙醇（1.0 mL）从 C18 轻型 SPE 小柱上洗脱目标产物，并导入预装有 0.9% 注射用氯化钠溶液（6.0 mL）的配制瓶中。
- 用额外的 3.0 mL 0.9% 注射用氯化钠溶液冲洗 C18 轻型 SPE 小柱。
- 收集配制瓶中的终溶液（约 10 mL）。将此溶液通过 0.22-μm 除菌滤器，转移至预组装的无菌、无热原、USP I 型 50 mL 玻璃小瓶中，用橡胶塞密封并用铝盖压封。
- 使用远程操作装置从终产品小瓶中取出一份样品作为质量控制（QC）样品（见步骤 1.15）。对该样品进行多项测试，放射性示踪剂必须在释放和给予患者前通过所有验收标准（见表 2）。
注：使用 [11C]CH3I 采用此反应容器方法对 （2） 进行放射性标记；生成并使用 [11C]CH3OTf 制备 （3） 和 （4）（见补充文件 1）。
结果
纽约大学朗格尼健康中心（NYULH）放射化学团队提供多种用于人体研究和临床前应用的碳-11、氟-18和镓-68放射性示踪剂。正电子发射断层成像（PET）放射性示踪剂的制备采用了多种方法。本团队采用环路法合成(1)、(2)、(3)和(4)（见图1和图8）。生产完成后，从无菌终产品小瓶中取出一份等分试样。该样品既用于终产品溶液的接种（分别接种于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和液体硫乙醇酸盐培养基（FTM）中作为无菌检测样品），也作为整体溶液的代表性样品用于质量控制（QC）检测。每种放射性示踪剂在放行给药前均需经过QC检测（见表2）。
质量控制检测包括产品外观的目视检查、滤器完整性验证、放射性核素鉴定、pH值、放射化学鉴定（放射性高效液相色谱法）、放射化学纯度（放射性高效液相色谱法）、化学纯度（高效液相色谱法）、摩尔活度、活度、残留溶剂、内毒素和无菌性（见表2）。以下结果来自上述每种放射性示踪剂的临床生产（见表1）。
有关典型的分析型高效液相色谱图，请参见图7和补充文件1。每种放射性示踪剂在放行并给予受试者之前，均须通过所有质量控制指标（见表2）。
有关前体和试剂的用量以及[11C]MRB (2)（补充图1）、[11C]mHED (3)（补充图2）和[11C]PiB (4)（补充图3）的分析型HPLC色谱图，请参见补充文件1。
| 化合物 | 参数 | 环路法（平均值 ± 标准差） | 反应器法（平均值 ± 标准差） |
| [11C]ER-176 | 生产次数 | 25 | 6 |
| 合成起始活度 | 86 ± 5.0 GBq | 52 ± 25.7 GBq | |
| 合成结束活度 | 5.4 ± 2.2 GBq | 1.6 ± 0.5 GBq | |
| 放射化学纯度 | 99.6 ± 0.6% | 99.9 ± 0.1% | |
| ER-176 浓度 | 1.1 ± 0.5 μg/mL | 0.63 ± 0.37 μg/mL | |
| 摩尔活度 | 194 ± 66 GBq/μmol | 132 ± 78 GBq/μmol | |
| 总合成时间 | 36 ± 3 min | 44 ± 6 min | |
| [11C]MRB | 生产次数 | 70 | 6 |
| 合成起始活度 | 84 ± 5.4 GBq | 39 ± 11.9 GBq | |
| 合成结束活度 | 3.0 ± 1.2 GBq | 1.9 ± 0.7 GBq | |
| 放射化学纯度 | 99.5 ± 0.5% | 99.7 ± 0.8% | |
| MRB 浓度 | 0.52 ± 0.24 μg/mL | 0.68 ± 0.41 μg/mL | |
| 摩尔活度 | 190 ± 50 GBq/μmol | 99 ± 55 GBq/μmol | |
| 总合成时间 | 35 ± 3 min | 42 ± 3 min | |
| [11C]mHED | 生产次数 | 5 | 11 |
| 合成起始活度 | 69 ± 10.5 GBq | 82 ± 4.3 GBq | |
| 合成结束活度 | 5.5 ± 1.3 GBq | 3.3 ± 1.0 GBq | |
| 放射化学纯度 | 98.2 ± 1.3% | 99.1 ± 0.7% | |
| mHED 浓度 | 0.40 ± 0.10 μg/mL | 0.52 ± 0.37 μg/mL | |
| 摩尔活度 | 301 ± 48 GBq/μmol | 155 ± 77 GBq/μmol | |
| 总合成时间 | 27 ± 4 min | 32 ± 2 min | |
| [11C]PiB | 生产次数 | 51 | 10 |
| 合成起始活度 | 86 ± 5.4 GBq | 57 ± 17.2 GBq | |
| 合成结束活度 | 3.2 ± 0.8 GBq | 1.4 ± 0.2 GBq | |
| 放射化学纯度 | 97.0 ± 1.5% | 99.1 ± 1.4% | |
| PiB 浓度 | 0.22 ± 0.51 μg/mL | 0.30 ± 0.24 μg/mL | |
| 摩尔活度 | 201 ± 68 GBq/μmol | 207 ± 124 GBq/μmol | |
| 总合成时间 | 35 ± 2 min | 36 ± 5 min |
表1：采用环路法或反应容器法合成 [11C]ER-176 (1)、[11C]MRB (2)、[11C]mHED (3) 和 [11C]PiB (4) 的结果。 所有数值均为合成结束时（end-of-synthesis）的数据。缩写：[11C]ER-176 = [11C]-(R)-N-sec-丁基-4-(2-氯苯基)-N-甲基喹唑啉-2-甲酰胺；[11C]MRB = (S,S)-[11C]甲基瑞博西汀；[11C]mHED = [11C]-间-羟基麻黄碱；[11C]PiB = 2-[4-[(11C)甲氨基]苯基]-1,3-苯并噻唑-6-醇。
图1：[11C]ER-176 (1)、[11C]MRB (2)、[11C]mHED (3) 和 [11C]PiB (4) 的结构。缩写：[11C]ER-176 = [11C]-(R)-N-sec-丁基-4-(2-氯苯基)-N-甲基喹唑啉-2-甲酰胺；[11C]MRB = (S,S)-[11C]甲基瑞波西汀；[11C]mHED = [11C]-间-羟基麻黄碱；[11C]PiB = 2-[4-[(11C)甲氨基]苯基]-1,3-苯并噻唑-6-醇。请点击此处查看本图的放大版本。
图3：对自动化模块所做的修改。 红色部分表示重新布管的合成模块，用于通过碳-11甲基化方法合成PET放射性示踪剂的环路。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4: 模块管路连接及重新管路设计，以整合环路法用于正电子发射断层显像放射性示踪剂的碳-11甲基化。 (A) 带有接头连接器的HPLC进样环路。 (B) 反应容器法。红色箭头显示V8连接位置。 (C) 环路法的重新管路设计，绕过反应容器。注意V8与HPLC入口的连接绕过了反应容器，使[11C]碘甲烷或[11C]三氟甲磺酸甲酯可直接进入HPLC环路。 (D) 接头相对于反应容器的位置。注意与不锈钢HPLC环路的连接。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 5：采用环路法制备的 ER-176 和 [11C]ER-176 的半制备型 HPLC 谱图。（A）通过环路法制备获得的 ER-176（1）在 UV = 235 nm 下的半制备型 HPLC 谱图；tR = 13.2 min。（B）[11C]ER-176（1）的放射性半制备型 HPLC 谱图；tR = 12.4 min。色谱条件：流动相为乙腈:20 mM 氢氧化铵（v/v = 37:63），流速为 5.0 mL/min。缩写：[11C]ER-176 = [11C]-(R)-N-sec-丁基-4-(2-氯苯基)-N-甲基喹唑啉-2-甲酰胺。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：采用反应器法制备的 ER-176 和 [11C]ER-176 的半制备型 HPLC 谱图。（A）通过反应器法制备的 ER-176（1）在 UV = 235 nm 下的半制备型 HPLC 谱图；tR = 9.8 分钟。（B）[11C]ER-176（1）的半制备型放射性 HPLC 谱图；tR = 9.2 分钟。条件：流动相为乙腈:20 mM 氢氧化铵（v/v）37:63，流速为 5.5 mL/min。缩写：[11C]ER-176 = [11C]-(R)-N-仲-丁基-4-(2-氯苯基)-N-甲基喹唑啉-2-甲酰胺；tR = 保留时间。请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：ER-176 的分析型 HPLC 谱图。（A）ER-176（1）在 235 nm 处的紫外光谱分析型 HPLC 谱图；tR = 6.10 min。（B）[11C]ER-176（1）放射性示踪剂的分析型 HPLC 谱图；tR = 6.36 min。条件：10 µm C18 (2) 100 
LC 柱 250 x 4.6 mm；甲醇/水（74/26），流速 1.5 mL/min。缩写：[11C]ER-176 = [11C]-(R)-N-sec-丁基-4-(2-氯苯基)-N-甲基喹唑啉-2-甲酰胺；tR = 保留时间 请点击此处查看该图的放大版本。
![用于ER-176和PiB等化合物的[11C]标记放射化学合成示意图。](/files/ftp_upload/67406/67406fig8.jpg "figure-results-8")
图8：碳-11化合物的合成路线图。 (i) [11C]CH3I 和 [11C]CH3OTf 的生成；(iia.) [11C]ER-176 (1) 的放射标记，(iib.) [11C]MRB (2) 的放射标记，(iic.) [11C]mHED (3) 的放射标记，以及 (iid.) [11C]PiB (4) 的放射标记。请点击此处查看此图的放大版本。
| 检测/参数 | 规格 |
| 外观（目视检查） | 澄清、无色、无颗粒物的溶液 |
| 膜过滤器完整性 | ≥ 50 psi |
| pH | 4.5 - 8.0 |
| 放射性核素身份（半衰期） | 19.3 - 21.3 min |
| 放射化学身份（放射性HPLC） | 0.90 ≤ tR Prod / t R Std ≤ 1.10 |
| 放射化学纯度（放射性HPLC） | ≥ 95.0%† |
| 药物浓度（HPLC） | 见备注* |
| 总化学杂质（HPLC） | 见备注** |
| 摩尔活度（@ EOS） | > 9.25 GBq/μmol |
| 残留乙腈（GC） | ≤ 410 ppm |
| 残留丙酮（GC） | ≤ 5,000 ppm |
| 残留二甲基亚砜（GC） | ≤ 5,000 ppm |
| 残留乙醇（GC） | ≤ 10% (v/v) |
| 残留甲醇（GC） | ≤ 3,000 ppm |
| 残留N,N-二甲基甲酰胺（GC） | ≤ 880 ppm |
| 鲎试剂（LAL） | ≤ 17.5 EU/mL |
| 无菌性（30小时内启动检测） | 无菌（14天） |
| 制备记录 | 完整且准确 |
| 标签 | 完整、准确、经核对 |
表2：碳-11放射性示踪剂放行或拒收的质量控制标准。† 放射化学纯度：[11C]mHED ≥ 90.0%；* 药物浓度：[11C]ER-176 ≤ 10 µg/剂量；[11C]MRB ≤ 10 µg/剂量；[11C]mHED ≤ 50 µg/剂量；[11C]PiB ≤ 13.4 µg/剂量；** 总化学杂质含量：[11C]ER-176 ≤ 1.0 µg/剂量；[11C]MRB ≤ 1.0 µg/剂量；[11C]mHED ≤ 5.0 µg/剂量；[11C]PiB ≤ 1.34 µg/剂量。缩写：[11C]ER-176 = [11C]-(R)-N-sec-丁基-4-(2-氯苯基)-N-甲基喹唑啉-2-甲酰胺；[11C]MRB = (S,S)-[11C]甲基瑞波西汀；[11C]mHED = [11C]-间羟基去甲麻黄碱；[11C]PiB = 2-[4-[(11C)甲氨基]苯基]-1,3-苯并噻唑-6-醇；EOS = 合成结束；GC = 气相色谱法；LAL = 鲎试剂裂解物。
补充文件 1：环式或反应器方法所用化学品与材料、试剂、质量控制测试、分析型高效液相色谱图。请点击此处下载该文件。
讨论
使用碳-11碘甲烷或甲基三氟甲磺酸酯对末端杂原子进行传统的放射性标记时，需将放射性亲电气体通入反应容器中，捕获后使溶液长时间反应18。这种非均相反应的传统鼓泡方式可能反应缓慢，常需加热以加快反应速率。在纯化前，需先将反应体系冷却至室温，再使用溶剂（例如流动相）转移至高效液相色谱（HPLC）进样环中，以纯化目标放射性示踪剂。这些步骤耗时较长，且在转移过程中可能导致短寿命的放射性标记产物损失。
在本机构，我们已证明使用环路法的合理性，即在高效液相色谱（HPLC）不锈钢环路上涂覆前体溶液，并在室温下于环路内部完成化合物的放射性标记。该环路与放射性同位素[11C]CH3I或[11C]CH3OTf的输送系统串联连接，并接入HPLC系统的进样口。放射性标记过程无需加热，在本文所示所有情况下，反应均在3分钟内完成。
流动速率以及不锈钢HPLC进样环的尺寸似乎对本过程的高效运行至关重要。实验首先通过改变载气（氦气）的流速，从8.0 mL/min到15.0 mL/min，以将放射性气体输送至进样环。Buckley研究了采用合适流速以及合适溶剂和进样环材料的重要性15。对于本系统，无论是放射性亲电试剂[11C]CH3I还是[11C]CH3OTf，15 mL/min的流速均适用于本文所讨论的四种放射性示踪剂的放射性标记。所有合成所用的进样环均为1.5 mL的不锈钢HPLC进样环，外径为1/16英寸，内径为1 mm。
比较两种方法（反应容器法与环路法），在我们实际操作中，环路法在合成四种经人体研究批准的放射性示踪剂时，表现出更高的标记效率以及终产物（EOS）摩尔活度的显著提升。以放射性示踪剂[11C]mHED (3) 为例，其终产物的分离产生活度提高了1.6倍，同时EOS时的摩尔活度达到原来的两倍。这种总体活度提升的趋势在全部四种放射性示踪剂中均能观察到（见 表1）。采用环路法的其他有利结果还包括： setup时间缩短5分钟，且无需清洗反应容器，从而节省了操作人员的时间以及清洁流程中溶剂的使用。
该方法的一些局限性包括：并非所有放射性示踪剂都能有效采用环路法进行标记。如果放射性标记过程需要加热，则很难对系统进行改造以实现HPLC环路内部加热。该系统需要对管路进行改装；由于不具备即装即用的便利性，这一特点可能会使其他用户不愿对其自动化平台进行此类改动14。由于该方法需要额外的管路和接头（见 图4A-D），在这些条件下进行标记时，放射性物质泄漏的潜在风险位点会增加。因此，每次在模块上运行前都应进行泄漏检查，这是十分必要的。
我们团队已在获得新药研究申请（IND）和放射性药物研究委员会（RDRC）批准的四种碳-11放射性示踪剂的生产中实施了环路法。在我们的实践中，该方法被证明比传统的反应容器法更高效且产率更高。在将此方法应用于大多数自动化模块时，需额外考虑管路设置以及载气氦气流速的调整。最后，该方法存在局限性，并不适用于某些碳-11放射性示踪剂，例如[11C]UCB-J，因其需要活化钯（II）中间体并对反应混合物进行加热24 。
披露
作者声明他们没有与本研究相关的任何重大利益或经济利益需要披露。
致谢
我们谨感谢前纽约大学朗格尼健康放射化学实验室成员 Raul Jackson 和 Grace Yoon，他们在采用环路法进行碳-11甲基化的初步工作中做出了贡献。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-(4'-氨基苯基)-6-羟基苯并噻唑 | ABX | 5101 | PiB合成前体（6-OH-BTA-0） |
| (2S,3S)-去乙基瑞波西汀 | ABX | 4407 | MRB合成前体 |
| 乙酸 | Sigma Aldrich | 695092 | 用于合成[11C]PiB |
| 丙酮-d6 | Sigma Aldrich | 444863 | 用于合成[的溶剂11C]PiB |
| 乙腈，HPLC级 | Sigma Aldrich | 34998 | 用于放射性示踪剂制备的流动相中不同浓度的使用 |
| 乙腈-d3 | Sigma Aldrich | 151807 | 用于合成[的溶剂11C]mHED |
| 甲酸铵 | Sigma Aldrich | 798568 | 用于合成[的试剂11C]MRB |
| 氨水 | Ricca Chemical | 642-16 | 用于合成[的试剂11C]ER-176 |
| 分析天平 | Mettler Toledo | M-XS104 | 用于称量生产所需物料的天平 |
| Ascarite II | 赛默飞世尔科技 | CN-C049U90 | 用于 FxC Pro 模块的干燥柱 |
| 生物安全柜 | Comecer | M-BH4 | 用于FPV组装 |
| (R)-N-仲丁基-4-(2-氯苯基)喹唑啉-2-甲酰胺 | ABX | 1665.0001 | ER-176 前体 |
| C18轻质Sep-Pak小柱 | WATERS | WAT023501 | 用于碳-11放射性示踪剂合成的固相萃取小柱 |
| Carboxen, 60 – 80目 | Supelco | CN-10478-U | FxC Pro 模块中使用 |
| 压缩的 – NOS（99% 氮气/1% 氧气） | Airgas | CN-X02NI99C3003091 | 回旋加速器轰击中使用的靶气体 |
| 热室分装系统（DHC） | Comecer | M-MIP1-1390 | 放射性示踪剂的分装 |
| 剂量校准仪 | Capintec | M-CRC-55t | 测量放射性示踪剂的活性 |
| Endosafe nexgen-PTS | 查尔斯河实验室 | PTS150 | Endosafe PTS，便携式检测系统 |
| 内毒素PTS - 鲎试剂（LAL）测试卡 | 查尔斯河实验室（Charles River） | PTS20F | 用于检测放射性示踪剂中内毒素水平的LAL试剂盒 |
| 乙醇，200度，HPLC级 | Sigma Aldrich | 459828 | 用于 最终产物和 ER、MRB、mHED 和 PiB 的流动相 |
| 气相色谱图 2030 | 岛津 | M-GC-2030 | 测量放射性示踪剂生产中的辅料 |
| Graphpac | Supelco, Millipore Sigma | 10258 | 用于 FxC Pro 模块中的 [11C]ER-176, [11C]MRB, [11C]mHED 和 [11C]PiB |
| 氦气，研究级 | Airgas | CN-HER-300 | 氦气罐，99.9999%（研究级气罐） |
| 岛津 LC-20 系列 | 岛津 | 各种 | 分析型高效液相色谱系统 |
| 氢气，超高纯度级 | Airgas | CN-HYUHP-300 | 用于 FxC Pro 模块的氢气罐 |
| 碘 | 赛默飞世尔科技 | I35 | 用于 FxC Pro 模块的 [11C]CH4 至 [11C]CH3I |
| Luna 10 毫米 C18 (2) 100 Å 250 x 10 mm 色谱柱 | Phenomenex | 00G-4253-N0 | 用于MRB合成的半制备柱 |
| Luna 5 mm C18（2）100 Å 250 x 10 mm 色谱柱 | Phenomenex | 00G-4252-N0 | 用于PiB合成的半制备柱 |
| Macherey-Nagel MN VP 250/10 Nucleosil 100-5 C18 Nautilus 色谱柱 | Macherey-Nagel | 715412.1 | 用于mHED合成的半制备柱 |
| 间羟胺（游离碱） | ABX | 3380.0001 | 用于[产物]生产中的前体11C]mHED |
| Milli-Q Direct 8 去离子水系统 | Millipore | M-ZROQ00800 | 去离子水系统 |
| N,N-二甲基甲酰胺-d7 | Sigma Aldrich | 189979 | 用于合成[的溶剂11C]MRB |
| 18 G × 1 针头 | Becton Dickinson | BD 305195 | 生产设置各阶段使用的针头 |
| 针头，20 G × 1-1/2” | Becton Dickinson | BD 305176 | 生产设置各阶段使用的针头 |
| 针头，22 G × 4”脊柱 | Air-Tite 产品 | N224 | 生产设置各阶段使用的针头 |
| Onyx Monolithic C18 100 x 10 mm 色谱柱 | Phenomenex | CH0-7878 | 用于ER-176合成的半制备柱 |
| 五氧化二磷与Sicapent指示剂 | Sigma Aldrich | 79610 | 用于碳-11放射性示踪剂合成模块的制备 |
| Porapak N | 沃特斯 | WAT027047 | FxC Pro 模块中用于填充 MeI 柱的材料 |
| 压力计 | Omega | M-DPG1100B-100G | 用于滤器完整性测试 |
| Shimalite-Ni | 岛津公司 | 221-66062 | CH 中包装的材料4 FxCPro模块中用于从[的转化的烘箱11C]CO2 至 [11C]CH4 |
| 西门子Eclipse 11-MeV回旋加速器 | 西门子 | RDS 111 | 用于生成[的粒子加速器11C]CO2 用于碳-11生产的气体 |
| 三氟甲磺酸银 | Sigma Aldrich | 483346 | FxC Pro模块中用于[11C]mHED 和 [11C]PiB |
| 0.9% 氯化钠注射液（生理盐水，50 mL） | Hospira | 0409-4888-50 | 放射性示踪剂配制过程中使用的生理盐水 |
| 氯化钠注射液（生理盐水，0.9%），500 mL | 布劳恩 | L8001 | 用于[11C]mHED 和流动相。 |
| 氢氧化钠 | Sigma Aldrich | 221465 | 用于[11C]ER-176 及其他组分在不同浓度下的情况。 |
| 碘化钠探测器 | Eckert &和 Ziegler | PMT/Na-BFC3200 | 与高效液相色谱仪联用的伽马探测器 |
| 无菌瓶，50 mL | ALK 过敏反应 | SEV50 | 50 mL 无菌小瓶用作 |
| 不锈钢环 | 通用电气 | 980314/IEG-005118 | 1.5 mL、外径1/16英寸的HPLC进样环”，内径：1 mm。 |
| 1 mL注射器 | 布劳恩 | NJ-9166017-02 | 生产设置不同阶段使用的注射器 |
| 注射器，10 mL | Henke Sass Wolf | 4100-X00V0 | 生产设置不同阶段使用的注射器 |
| 注射器，20 mL | Henke Sass Wolf | 4200-X00V0 | 生产设置不同阶段使用的注射器 |
| 5 mL注射器 | Becton Dickinson | 309632 | 生产设置不同阶段使用的注射器 |
| TracerLab FX2C 模块 | 通用电气 | M-P5360QB | 碳-11放射性示踪剂的自动化生产模块 |
| 三乙胺 | Sigma Aldrich | 471283 | 用于合成[的试剂11C]PiB |
| 结核菌素注射器，配21 G × 1针头，一次性使用，无菌（1 mL） | Becton Dickinson | BD 309624 | 预组装最终产品小瓶中使用的注射器 |
参考文献
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