方法文章

通过主动免疫诱导小鼠产生抗肌肉特异性激酶（MuSK）自身免疫性重症肌无力

DOI：

10.3791/67408

⸱

2025年7月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Aziz Sancar Institute of Experimental Medicine, Istanbul University, 2Department of Immunology, Hellenic Pasteur Institute

本文内容

摘要

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本文介绍了一种用于研究自身免疫性肌肉特异性激酶（MuSK）重症肌无力发病机制及潜在治疗策略的实验性小鼠模型的完整方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重症肌无力（MG）是一种影响神经肌肉接头的自身免疫性疾病。尽管大多数MG患者会产生针对乙酰胆碱受体（AChR）的自身抗体，但有一部分患者则表现出靶向肌肉特异性激酶（MuSK）的自身抗体。MuSK型MG以严重的肌无力、难治性临床表现为特征，并常出现重症肌无力危象，往往需要机械通气支持。因此，患者通常需要长期使用免疫抑制剂，而这可能带来长期的不良反应。鉴于MuSK-MG的严重性和罕见性，建立实验性动物模型对于开发新的治疗方法以及深入理解其潜在的病理生理机制至关重要。实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）是MuSK-MG的动物模型，能够有效但部分地模拟人类MG的临床和免疫学特征。自身免疫动物模型的诱导可通过主动免疫或被动免疫实现。在本研究所述的实验方案中，采用主动免疫方法，即将纯化的人源MuSK胞外域与含灭活结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂乳化后，通过皮下注射于四个位点进行免疫，并在第28天给予MuSK加强注射。该含结核分枝杆菌的佐剂可通过TLR4激活免疫系统，并增强对注射抗原的吞噬作用。本文系统详述了MuSK-EAMG模型从建立到表征的全过程。

引言

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重症肌无力（MG）是一种通过T细胞依赖性、抗体介导机制发生的自身免疫性疾病。在80%–85%的患者中，该病主要由针对神经肌肉接头（NMJ）突触后膜上烟碱型乙酰胆碱受体（AChR）的抗体引起；另有约5%的患者由抗肌肉特异性激酶（MuSK）抗体以及其他NMJ蛋白的抗体所致。重症肌无力已成为自身免疫性疾病的典型代表，并作为研究突触后功能的重要模型1。自身免疫性疾病的动物模型可分为两大类：（1）自发性模型，即动物自然发生自身免疫性疾病；（2）诱导性模型，即通过人工手段模拟并复制自身免疫性疾病。针对重症肌无力（MG）的研究表明，主动免疫和被动免疫均可诱导疾病发生，这对理解抗体介导的疾病机制具有重要意义2。

被动转移是评估自身抗体介导疾病急性效应的一种高效方法，已广泛用于研究重症肌无力（MG）患者来源的抗体。该方法有助于深入理解疾病背后的免疫学因素。例如，被动转移研究已证实抗MuSK IgG4在减少乙酰胆碱受体（AChR）簇方面的致病作用3。然而，被动转移模型也存在一些局限性，如人与啮齿类动物的IgG及免疫系统之间存在功能差异，以及该模型无法充分模拟在淋巴组织中发生的抗MuSK自身免疫的初始激活机制。

另一方面，免疫学研究的一个潜在局限性在于不同小鼠品系之间的免疫遗传学差异4。例如，C57BL/6（B6）小鼠对乙酰胆碱受体（AChR）的主动免疫具有易感性，而AKR/J小鼠则具有抗性。因此，在建立实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）动物模型时，准确选择动物种类、免疫方法及免疫方案内容，以真实反映疾病特征，至关重要5。

此外，使用靶抗原的完整蛋白质通常会产生高抗体滴度。然而，并非所有抗体都能与小鼠抗原发生交叉反应或产生致病性表位。因此，主动免疫模型并不总能准确反映人类疾病的病理特征。尽管如此，当这些模型成功构建出适当的临床和生理表型时，可为实验性治疗的测试提供长期的研究平台。

临床研究表明，MuSK-MG具有不同的疾病机制和治疗需求，凸显了进一步明确该型重症肌无力特异性致病特征的必要性4,5,6。既往基于主动免疫的MuSK实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）研究显示，Th2型免疫反应及抗小鼠IgG1在MuSK自身免疫中起主导作用，并鉴定出多种潜在的人MuSK-MG治疗手段（如特立氟胺、间充质干细胞、FCRLB shRNA）7,8,9。这表明MuSK EAMG模型在验证新治疗靶点和研究MuSK-MG发病机制方面具有重要意义。

本文详细描述了诱导动物模型、监测疾病进展以及验证EAMG诱导的方法。临床评估包括由观察者监测体重、姿势、抓握力和临床评分。在第二次免疫后28天处死小鼠，并采集血液、后肢肌肉、脾脏以及腋窝和腹股沟淋巴结等多种组织，以确认疾病模型的建立。采用ELISA方法定量检测血清中的抗MuSK抗体。此外，对肌肉组织进行免疫荧光染色，以观察神经肌肉接头处的抗体沉积情况。为展示并比较不同MuSK EAMG易感性小鼠组的临床和免疫反应，根据前期研究结果，经KCNS3 shRNA处理的小鼠表现出促炎作用（未发表数据），而FCRLB shRNA则表现出抗炎作用9。

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方案

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该方案已获得伊斯坦布尔大学动物实验地方伦理委员会（HADYEK）批准，批准编号为2020/29。在我们之前的研究中7,8,9在8-10周龄的BALB/c或B6小鼠中诱导EAMG模型 通过 使用MuSK蛋白进行主动免疫。本文展示了利用MuSK免疫的BALB/C小鼠（每组4-8只）在不同实验中获得的示例性数据。所用试剂和设备列于下文 材料表.

1. 用于免疫的人源 MuSK 的制备与准备

  1. 将人源 MuSK 胞外域氨基酸 24-495（NCBI 参考序列：NP_005583.1）克隆至 pPIC9 载体中。
  2. 在酵母 Pichia pastoris（菌株 GS115）系统中进行分泌表达。
  3. 通过向培养基中添加甲醇（2.5% v/v）诱导表达。
  4. 在 C 末端添加 6×HIS 标签以用于纯化。
  5. 将蛋白以分泌型糖基化蛋白形式表达，并在天然条件下进行纯化。将培养基对 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 8.0）、300 mM NaCl 进行透析。
  6. 随后采用 Ni2+/次氮基三乙酸琼脂糖（Ni-NTA）进行镍离子亲和层析。加入 10% 甘油后，于 -80 °C 保存纯化蛋白，该条件下蛋白至少可稳定保存两年10。
    注意：经 Ni-NTA 纯化后估计的表达水平约为 0.4 mg/L 培养液。通过 SDS-PAGE 分析的样品中未检测到其他蛋白杂质。
  7. 免疫前，通过凝胶电泳验证分离的 MuSK 蛋白胞外域的纯度（补充图 1）。
  8. 将 MuSK 配制成每只小鼠 45 µg/100 µL PBS 的浓度。
  9. 将 MuSK 与 PBS（100 µL）和含结核分枝杆菌 H37Ra（10 mg/10 mL）的完全弗氏佐剂（CFA，100 µL）按 1:1 比例混合并充分乳化（每只小鼠乳化液总体积为 200 µL）。

2. 麻醉与免疫程序

  1. 免疫前，用PBS按1:5的比例稀释丙泊酚。
  2. 按每只小鼠50 mg/kg的剂量进行腹腔注射。
    注意：异氟烷也可用于麻醉 通过 吸入（遵循机构批准的方案）。初始浓度通常设定为3%-5%，氧气流速为1-2 L/min；维持浓度通常为1%-3%，氧气流速为0.5-1 L/min。
  3. 初次免疫：将制备好的MuSK抗原共45 µg/200 µL溶于完全弗氏佐剂（CFA）中，皮下注射至肩部和后肢内侧足垫（每部位约11.25 µg/50 µL）。
  4. 第二次免疫：将45 µg/200 µL用CFA配制的MuSK抗原，皮下注射至肩部和髋部（每部位约11.25 µg/50 µL）。
    注意：为建立模型，需间隔28天进行两次注射。肌肉注射可能引起肌肉疼痛，从而干扰临床肌无力的评估。由于实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）本身是一种肌肉疾病，采用肌肉注射可能诱发与疼痛相关的非重症肌无力性虚弱，进而构成混杂因素。建议设置仅使用完全弗氏佐剂（CFA）而不含MuSK的对照组。

3. 临床评分

  1. 通过轻轻拖动小鼠使其在笼顶网格上移动40次，同时小鼠试图抓紧网格以诱导疲劳，从而对小鼠进行运动刺激，因为重症肌无力症状在小鼠运动和疲劳后会更加明显。
  2. 运动后，仔细观察小鼠活动性、体重和肌肉力量的变化。根据这些观察结果赋予相应的评分，以指导评估标准。
    注：评分0分：小鼠保持活跃，继续探索周围环境；1分：运动后出现弓背姿势，但小鼠能恢复正常的活动性和社交行为，毛发梳理基本维持；2分：运动前即可见弓背姿势，运动后更加明显，自我梳理和活动性下降；3分：运动前后均出现显著弓背姿势，活动、社交和肌肉力量明显减弱，每2–3天体重减轻1–2克，出现脱水症状，导致小鼠难以触及饮水和食物；脱水表现为捏起皮肤后回弹缓慢以及粪便性状改变；疼痛小鼠表现为眯眼和弓背姿势；出现严重疼痛且体重减轻超过20%的小鼠应予以安乐死；4分：小鼠在笼中死亡，应立即移除尸体并更换笼具5。
  3. 在第二次免疫后约10天症状迅速进展期间，每日检查小鼠。在前28天内每周进行一次临床评分和测量，之后改为每周两次。
  4. 进行体重测量。
    注：体重测量是追踪疾病进展的重要参数。由于小鼠代谢率较高，体重可能有较大波动。应使用同一台天平进行所有测量，并在每天相同时间进行测量，以确保一致性。
  5. 进行肌肉力量测量。使用带有网格金属丝的水平测力计测量肌肉力量。
    1. 为进行临床评分，通过轻轻拖动小鼠在笼顶移动40次以诱导疲劳。
    2. 立即将每只小鼠放置于测力计的网格上，轻轻抓住尾巴向后拉，确保所有爪子牢固抓住网格。仅记录四只爪子均抓住网格时的测量值。
      注：每次测量时应尽量施加相同的拉力，建议由同一名研究人员完成所有测量，以保证结果的可靠性并减少变异性。由于易疲劳性是重症肌无力肌肉无力的特征，应在不记录抓力数值的情况下先进行一系列抓力测试以诱导疲劳。随后对每只小鼠进行七次测量，剔除最大值和最小值，取剩余五次测量的平均值，以确保结果可靠。

4. 组织样本制备

注意：根据机构批准的方案，在第二次免疫后28天处死小鼠。收集处死小鼠的血液、肌肉、脾脏和淋巴结将有助于进一步的研究。

  1. 心脏采血
    注意：采集心脏血时，需使用伦理委员会批准的适当麻醉剂（如丙泊酚）对小鼠进行麻醉。心脏穿刺需要麻醉，且为终末性操作，意味着动物在采血后必须立即实施安乐死。
    1. 在大鼠深度麻醉后，将其仰卧放置，打开腹腔，定位心脏，心脏位置约在最低肋骨上方1 cm处，并稍偏右侧。
    2. 使用25–35 G针头，以45度角从左心室小心抽取血液，过程中避免移动注射器，以防并发症11。
    3. 将血液样本转移至干燥试管中用于血清分离，和/或转移至EDTA试管中用于后续RNA提取（如计划进行）。
    4. 通过离心分离血清，并将血清样本保存于-20 °C，直至使用。
  2. 肌肉样本保存与制备
    1. 采集胫前肌11,12,13，用冰冻PBS冲洗。
    2. 将样本放入冻存管中，立即浸入液氮冷却的异戊烷中（-20 °C），随后储存于-80 °C冰箱中。
      注意：为获得更准确的实验结果，样本应进行速冻处理。
    3. 将组织垂直置于切片托上（可使用软木塞固定），并用OCT包埋剂（最佳切割温度化合物）包埋，用于免疫荧光染色。
    4. 使组织在液氮冷却的异戊烷中漂浮，随后储存于-80 °C冰箱中，直至使用冷冻切片机进行切片。

5. 神经肌肉接头的评估 通过 免疫荧光标记

  1. 冷冻切片与固定
    1. 使用冷冻切片机在 -24 °C 条件下对包埋于 OCT 中的冷冻组织进行切片，厚度为 7 µm。
    2. 用预冷至 -20 °C 的丙酮固定切片，随后用 PBS 洗涤 5 分钟。
    3. 再用含 0.4% Triton X 的 PBS（PBS-T）洗涤 10 分钟。
      注意：可进行通透处理，以纠正因固定而受影响的分子构象，确保更准确的结合。通透步骤包括用含 1% FBS 的 PBS 处理 10 分钟，再用 PBS-T 处理 10 分钟。
    4. 用含 10% FBS 的 PBS-T 封闭切片 30 分钟，以防止非特异性结合。
  2. 免疫荧光染色
    注意：染色时可使用以下抗体：C3、IgG、乙酰胆碱受体标记物 α-银环蛇毒毒素（α-bungarotoxin）。
    1. 将所选抗体用含 1% FBS 的 PBS-T 稀释。
    2. 室温避光孵育 2.5 小时。
    3. 用含 1% FBS 的 PBS-T 洗涤切片。
    4. 用 DAPI 复染。
    5. 将切片置于 4 °C 的黑暗潮湿环境中保存，直至进行荧光显微镜观察。
    6. 进行成像与分析。
      注意：应使用荧光显微镜计数每张切片中 BTX（银环蛇毒毒素）阳性的神经肌肉接头。以 20 倍放大倍数采集图像。分析时，在显微镜下手动计数 BTX 与 C3 或 IgG 阳性的神经肌肉接头。分析应采用连续切片中双阳性接头占总 BTX 标记接头的百分比。

6. 蛋白质印迹

  1. 蛋白质分离与定量
    1. 使用速冻的肌肉样本。
    2. 配制含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液。
    3. 加入与样本重量相等的0.5 mm氧化锆珠，并加入2倍体积的裂解缓冲液。
    4. 使用匀浆器对样本进行匀浆处理。
    5. 在4 °C条件下，以12,000 × g 离心15分钟。
    6. 收集含有蛋白质裂解物的上清液。
    7. 使用BCA法检测试剂盒或Bradford试剂测定蛋白质浓度。
    8. 用裂解缓冲液将蛋白质样本调整至所需浓度。每孔上样25 μg蛋白质可有效检测AChR。
  2. SDS-PAGE凝胶电泳
    1. 将蛋白质样本与4× Laemmli缓冲液混合。
    2. 在95 °C加热5分钟以使蛋白质变性。
    3. 将等量的蛋白质样本和蛋白质分子量标准品加入SDS-PAGE凝胶的加样孔中。
    4. 以200 V电压电泳30分钟（时间可能因不同电源设备而异）。
  3. 蛋白质转膜
    1. 进行半干转膜时，使用硝酸纤维素膜，并用预冷的转膜缓冲液浸湿所有组件。
    2. 组装转膜“三明治”结构：海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵。
      ​注意：确保各层之间无气泡。应根据制造商说明选择合适的转膜程序（参见材料表）。
  4. 封闭与抗体孵育
    1. 在室温下，用含5%脱脂奶粉或BSA的TBST缓冲液封闭膜1小时，同时轻轻摇动。
    2. 将膜与用2.5%封闭缓冲液稀释的一抗（抗AChR抗体）在4 °C孵育过夜，同时轻轻摇动。
    3. 用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。
    4. 将膜与用2.5%封闭缓冲液稀释的HRP标记二抗（IgG HRP）在室温下孵育1小时。
    5. 用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。
  5. 检测与成像
    1. 根据制造商说明将ECL底物溶液加至膜上。
    2. 使用成像系统捕获化学发光信号。
    3. 使用图像分析软件分析条带。
      注意：始终将蛋白质和试剂置于冰上以防止降解。通过同时检测内参蛋白（如beta-actin、alpha-tubulin或GAPDH）来确保上样量一致。优化抗体浓度和孵育时间以获得最佳结果。证明MuSK免疫小鼠中AChR蛋白表达减少至关重要。

7. 自制抗MuSK IgG ELISA

  1. 在100 µL碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（包被缓冲液）中，将MuSK抗原配制为每孔0.5 µg的浓度（包被）。
  2. 将100 µL抗原溶液加入免疫分析板的每个孔中。
  3. 在4 °C下孵育过夜。
  4. 用含0.5% Tween 20的PBS（洗涤液）洗涤板孔。
  5. 加入含5% FBS的PBS（封闭液），在4 °C下孵育90分钟，以封闭非特异性结合位点（封闭）。
  6. 由于优化实验显示MuSK-IgG水平较高，将血清样本用封闭液稀释1/50,000。
  7. 封闭后无需洗涤，直接将稀释后的血清样本加入各孔中。
  8. 在37 °C下孵育90分钟。
  9. 用洗涤液洗涤板孔三次。
  10. 将HRP标记的抗小鼠IgG二抗（ab97023）用封闭液稀释1/5000。
  11. 向每孔加入100 µL稀释后的二抗溶液。
  12. 在37 °C下孵育90分钟。
  13. 用洗涤液洗涤板孔三次。
  14. 向每孔加入100 µL TMB底物溶液，并观察颜色变化。
  15. 使用2 M H2SO4在适当时间终止反应。
  16. 使用分光光度计在450 nm处测定吸光度。
  17. 为保证一致性，所有样本应设复孔，并在同一块板上进行检测。
    注意：由于无标准品稀释液，分析时应直接使用吸光度值。阴性对照孔（空白孔）应无颜色变化。颜色变化较快，因此应将终止液置于附近，以便立即终止反应。

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结果

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在评估和验证肌肉特异性激酶实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）模型时，多个关键参数和实验结果对于证明该疾病模型的成功建立和特征鉴定至关重要。以下是确认MuSK EAMG模型建立的代表性结果。

临床评分
通过标准化的临床评分系统对小鼠进行监测，并对其重症肌无力的临床症状进行评分。该评分包括评估肌肉力量、姿势以及整体身体状况。与基线水平和对照组小鼠相比，实验组小鼠临床评分随时间逐渐升高，表明疾病进展且严重程度增加。临床评分数据应显示出明确且进行性的上升趋势，突出该模型在模拟人类MuSK型重症肌无力方面的有效性（图1）。

握力和体重测量
对小鼠的功能评估包括测量握力和体重。这些参数对于评估 MuSK EAMG 的临床表现至关重要。实验组小鼠的握力和体重应显著低于对照组。这些下降反映了与该疾病相关的肌肉无力和整体身体状况的恶化（图2...

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讨论

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小鼠MuSK-EAMG模型在临床表现和免疫病理特征方面均模拟了人类MuSK-MG，包括肌无力、因球部肌肉无力导致的体重减轻、循环中的抗MuSK抗体以及骨骼肌乙酰胆碱受体（AChR）减少。关于该MuSK-EAMG模型的关键节点和预期时间进程，第二次免疫后第一周内应出现肌无力的临床症状。约有5%的小鼠可能在首次免疫后即出现疾病征象。 >预计在两次免疫后，EAMG（至少1级）的发生率可达70%。如果疾病发生率较低，可进行第三次免疫。7,14,15两次免疫均使用完全弗氏佐剂（CFA）配制的MuSK蛋白免疫的MuSK免疫小鼠，其抗体反应和临床反应略高于首次免疫使用CFA、第二次免疫使用不完全弗氏佐剂（IFA）配制MuSK蛋白的小鼠。14尽管这种差异很小，但为了获得最佳效果并提高EAMG的发病率，两次免疫均使用了CFA。第二次免疫时，注射部位改为臀部，以便在两次免疫过程中将抗原引入尽可能多样的浅表淋巴结（腋下...

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披露

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无任何披露事项需要声明。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们谨此感谢伊斯坦布尔大学健康科学研究所和阿齐兹·桑贾尔实验医学研究所对本研究完成所提供的支持与贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
125I-α-bungarotoxinInvitrogenBTX T1175
2-甲基丁烷Sigma-AldrichM32631
40 μm细胞筛NEST258369
96孔Maxisorp板Sigma-AldrichM9410
辅助剂不完全Becton Dickinson & Co. 263910
抗AChR α1 AlomoneANC-001
辣根过氧化物酶标记的抗小鼠 IgGAbcamab97023
Bullet Blender Storm下一步进展组织匀浆器
C3NovusNB200-540G
碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液默克C3041
冷冻切片机LeicaCM1860 
Dynamometer Imada DST-50NMuromachiMK380Si
荧光显微镜LeicaDM4M
带鲁尔锁的玻璃注射器ISOLAB094.92.005
IgGAbcamab96871
微孔板光度计，Multiskan FC赛默飞世尔科技51119000
小鼠手术器械套装Kent Scientific 公司INSMOUSEKIT
结核分枝杆菌 H37RaBecton Dickinson & Co. 231141
OCT包埋剂Agar ScientificAGR1180
1 mL注射器Becton Dickinson & Co. 309625
2 mL注射器B. Braun7389
通用动物固定器默克Z756911-1EA
WesternBright Sirius 化学发光 Western 印迹检测试剂盒AdvanstaK-12043-D10ECL

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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