通过主动免疫诱导小鼠产生抗肌肉特异性激酶（MuSK）自身免疫性重症肌无力

摘要

本文介绍了一种用于研究自身免疫性肌肉特异性激酶（MuSK）重症肌无力发病机制及潜在治疗策略的实验性小鼠模型的完整方案。

摘要

重症肌无力（MG）是一种影响神经肌肉接头的自身免疫性疾病。尽管大多数MG患者会产生针对乙酰胆碱受体（AChR）的自身抗体，但有一部分患者则表现出靶向肌肉特异性激酶（MuSK）的自身抗体。MuSK型MG以严重的肌无力、难治性临床表现为特征，并常出现重症肌无力危象，往往需要机械通气支持。因此，患者通常需要长期使用免疫抑制剂，而这可能带来长期的不良反应。鉴于MuSK-MG的严重性和罕见性，建立实验性动物模型对于开发新的治疗方法以及深入理解其潜在的病理生理机制至关重要。实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）是MuSK-MG的动物模型，能够有效但部分地模拟人类MG的临床和免疫学特征。自身免疫动物模型的诱导可通过主动免疫或被动免疫实现。在本研究所述的实验方案中，采用主动免疫方法，即将纯化的人源MuSK胞外域与含灭活结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂乳化后，通过皮下注射于四个位点进行免疫，并在第28天给予MuSK加强注射。该含结核分枝杆菌的佐剂可通过TLR4激活免疫系统，并增强对注射抗原的吞噬作用。本文系统详述了MuSK-EAMG模型从建立到表征的全过程。

引言

重症肌无力（MG）是一种通过T细胞依赖性、抗体介导机制发生的自身免疫性疾病。在80%–85%的患者中，该病主要由针对神经肌肉接头（NMJ）突触后膜上烟碱型乙酰胆碱受体（AChR）的抗体引起；另有约5%的患者由抗肌肉特异性激酶（MuSK）抗体以及其他NMJ蛋白的抗体所致。重症肌无力已成为自身免疫性疾病的典型代表，并作为研究突触后功能的重要模型¹。自身免疫性疾病的动物模型可分为两大类：（1）自发性模型，即动物自然发生自身免疫性疾病；（2）诱导性模型，即通过人工手段模拟并复制自身免疫性疾病。针对重症肌无力（MG）的研究表明，主动免疫和被动免疫均可诱导疾病发生，这对理解抗体介导的疾病机制具有重要意义²。

被动转移是评估自身抗体介导疾病急性效应的一种高效方法，已广泛用于研究重症肌无力（MG）患者来源的抗体。该方法有助于深入理解疾病背后的免疫学因素。例如，被动转移研究已证实抗MuSK IgG4在减少乙酰胆碱受体（AChR）簇方面的致病作用³。然而，被动转移模型也存在一些局限性，如人与啮齿类动物的IgG及免疫系统之间存在功能差异，以及该模型无法充分模拟在淋巴组织中发生的抗MuSK自身免疫的初始激活机制。

另一方面，免疫学研究的一个潜在局限性在于不同小鼠品系之间的免疫遗传学差异

方案

该方案已获得伊斯坦布尔大学动物实验地方伦理委员会（HADYEK）批准，批准编号为2020/29。在我们之前的研究中^7,8,9在8-10周龄的BALB/c或B6小鼠中诱导EAMG模型 通过 使用MuSK蛋白进行主动免疫。本文展示了利用MuSK免疫的BALB/C小鼠（每组4-8只）在不同实验中获得的示例性数据。所用试剂和设备列于下文 材料表.

1. 用于免疫的人源 MuSK 的制备与准备

1. 将人源 MuSK 胞外域氨基酸 24-495（NCBI 参考序列：NP_005583.1）克隆至 pPIC9 载体中。
2. 在酵母 Pichia pastoris（菌株 GS115）系统中进行分泌表达。
3. 通过向培养基中添加甲醇（2.5% v/v）诱导表达。
4. 在 C 末端添加 6×HIS 标签以用于纯化。
5. 将蛋白以分泌型糖基化蛋白形式表达，并在天然条件下进行纯化。将培养基对 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 8.0）、300 mM NaCl 进行透析。
6. 随后采用 Ni²⁺/....

结果

在评估和验证肌肉特异性激酶实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）模型时，多个关键参数和实验结果对于证明该疾病模型的成功建立和特征鉴定至关重要。以下是确认MuSK EAMG模型建立的代表性结果。

临床评分
通过标准化的临床评分系统对小鼠进行监测，并对其重症肌无力的临床症状进行评分。该评分包括评估肌肉力量、体态及整体身体状况。与基线水平和对照组小鼠相比，实验组小鼠临床评分随时间逐渐升高，表明疾病进展且严重程度增加。临床评分数据应显示出明确且进行性的上升趋势，突出该模型在模拟人类MuSK型重症肌无力方面的有效性（图1）。

握力和体重测量
对小鼠的功能评估包括测量握力和体重。这些参数对于评估 MuSK EAMG 的临床表现至关重要。实验组小鼠的握力和体重应显著低于对照组。这些下降反映了与该疾病相关的肌肉无力和整体身体状况的恶化（图 2.......

讨论

小鼠MuSK-EAMG模型在临床表现和免疫病理特征方面均模拟了人类MuSK-MG，包括肌无力、因球部肌肉无力导致的体重减轻、循环中的抗MuSK抗体以及骨骼肌乙酰胆碱受体（AChR）减少。关于该MuSK-EAMG模型的关键节点和预期时间进程，第二次免疫后第一周内应出现肌无力的临床症状。约有5%的小鼠可能在首次免疫后即出现疾病征象。 >预计在两次免疫后，EAMG（至少1级）的发生率可达70%。如果疾病发生率较低，可进行第三次免疫。^7,14,15两次免疫均使用完全弗氏佐剂（CFA）配制的MuSK蛋白免疫的MuSK免疫小鼠，其抗体反应和临床反应略高于首次免疫使用CFA、第二次免疫使用不完全弗氏佐剂（IFA）配制MuSK蛋白的小鼠。¹⁴尽管这种差异很小，但为了获得最佳效果并提高EAMG的发病率，两次免疫均使用了CFA。第二次免疫时，注射部位改为臀部，以便在两次免疫过程中将抗原引入尽可能多样的浅表淋巴结（腋下.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
125I-α-bungarotoxin	Invitrogen	BTX T1175
2-甲基丁烷	Sigma-Aldrich	M32631
40 μm细胞筛	NEST	258369
96孔Maxisorp板	Sigma-Aldrich	M9410
辅助剂不完全	Becton Dickinson & Co.	263910
抗AChR α1	Alomone	ANC-001
辣根过氧化物酶标记的抗小鼠 IgG	Abcam	ab97023
Bullet Blender Storm	下一步进展		组织匀浆器
C3	Novus	NB200-540G
碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液	默克	C3041
冷冻切片机	Leica	CM1860
Dynamometer Imada DST-50N	Muromachi	MK380Si
荧光显微镜	Leica	DM4M
带鲁尔锁的玻璃注射器	ISOLAB	094.92.005
IgG	Abcam	ab96871
微孔板光度计，Multiskan FC	赛默飞世尔科技	51119000
小鼠手术器械套装	Kent Scientific 公司	INSMOUSEKIT
结核分枝杆菌 H37Ra	Becton Dickinson & Co.	231141
OCT包埋剂	Agar Scientific	AGR1180
1 mL注射器	Becton Dickinson & Co.	309625
2 mL注射器	B. Braun	7389
通用动物固定器	默克	Z756911-1EA
WesternBright Sirius 化学发光 Western 印迹检测试剂盒	Advansta	K-12043-D10	ECL