本文介绍了一种利用Fura-2/AM染料进行单细胞Ca2+成像，实时定量监测细胞内钙离子（Ca2+）浓度的方法。该技术可实现高效的染料加载，并通过荧光强度比值准确计算Ca2+水平，是一种简便、快速适用于科研应用的技术方法。
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摘要
摘要
单细胞Ca2+ 成像对于Ca的研究至关重要2+ 由温度、电压、内源性化合物和化学物质等多种刺激激活的通道。该方法主要依赖显微成像技术及相关Ca2+ 指示剂Fura-2/AM（AM是乙酰氧基甲酯的缩写）。进入细胞后，Fura-2/AM被酯酶水解为Fura-2，后者可逆性地与胞质游离Ca²⁺结合2+最大激发波长从380 nm漂移至340 nm（当与Ca饱和时）2+) 结合后发出的荧光强度与结合的 Ca 浓度呈定量关系2+通过测量340/380比值，可检测Ca2+ 细胞质中的浓度可以被准确测定，从而消除因不同样本间荧光探针加载效率差异所导致的误差。该技术可实现对Ca²⁺的实时、定量和同步监测2+ 多个细胞中的变化。结果以“.XLSX”格式存储，便于后续分析，具有快速生成直观变化曲线的优点，显著提高了检测效率。从不同实验角度，本文列举了利用该技术检测Ca2+ 内源性或过表达通道蛋白细胞中的信号。同时，展示了不同细胞激活方法并进行了比较。旨在帮助读者更清晰地理解单细胞Ca²⁺检测的使用方法及其应用2+ 成像
引言
Ca2+ 在细胞信号转导中起着至关重要的作用，可调控多种细胞功能，如肌肉收缩1、神经传导2、分泌3和基因表达4，从而影响多种生理过程。异常的 Ca2+ 浓度可导致心律失常5、凝血障碍6和激素失衡7等疾病。因此，研究细胞内 Ca2+ 浓度变化的机制具有极其重要的意义。
多种离子通道参与调控Ca2+ 细胞内的浓度，包括高浓度 Ca2+选择性钙释放激活钙（CRAC）通道8 TRP家族的非选择性阳离子通道9这些离子通道可被温度等刺激激活10，中药中发现的化合物和活性成分11，在多种Ca2+-相关的生理过程。
有效监测细胞内Ca2+ 浓度变化对于研究Ca2+相关的离子通道，尤其是在中医药领域，钙信号调控在多种治疗策略中起着核心作用。目前，测量细胞内Ca2+ 可分为两类：电学测量和光学测量。电学测量方法采用膜片钳技术，检测由Ca引起的细胞膜电位变化2+ 流入12.
在光学测量中，荧光探针可特异性结合 Ca2+，使研究人员能够追踪细胞荧光强度的变化。常用的光学方法包括基于荧光蛋白和基于荧光染料的技术。在基于荧光蛋白的方法中，研究人员可在细胞中过表达对 Ca2+ 敏感的荧光蛋白（如 Cameleon13 和 GCaMP14），并通过荧光显微镜或流式细胞术监测荧光信号的变化，从而观察胞质 Ca2+ 浓度的动态变化。此外，研究人员还可将这些蛋白在小鼠中过表达，并利用双光子荧光显微镜对细胞内 Ca2+ 浓度进行实时的活体或组织水平监测，实现高分辨率和深层组织穿透10。
对于基于荧光染料的方法，常用的 Ca2+ 探针包括 Fluo-3/AM、Fluo-4/AM 和 Fura-2/AM10。研究人员将细胞孵育在含有这些荧光探针的溶液中，探针可穿过细胞膜，并被细胞内的酯酶切割，生成保留在细胞内的活性化合物（如 Fluo-3、Fluo-4 和 Fura-2）。这些探针在其游离配体形式下荧光极弱，但与细胞内 Ca2+ 结合后会发出强烈的荧光，从而反映细胞质中 Ca2+ 浓度的变化。与其他荧光蛋白和染料相比，Fura-2 通常在 340 nm 和 380 nm 波长下激发。当与细胞内游离 Ca2+ 结合时，Fura-2 发生吸收光谱偏移，使其激发波长峰值从 380 nm 移至 340 nm，而发射峰值（约 510 nm）保持不变。荧光强度与结合的 Ca2+ 浓度之间存在定量关系，因此可通过测量这两个激发波长下的荧光强度比值来计算细胞内 Ca2+ 浓度。比值测量法可减少光漂白、荧光探针泄漏、染料加载不均以及细胞厚度差异带来的影响，从而获得更可靠且可重复的结果（图 1）。
单细胞 Ca2+ 成像系统主要利用显微镜技术和 Ca2+ 荧光探针 Fura-2/AM 来检测细胞内 Ca2+ 浓度。该系统由荧光显微镜、Ca2+ 成像光源和荧光成像软件组成，可同时对多个细胞（每视野最多达 50 个细胞）的胞质内 Ca2+ 变化进行实时、定量监测。结果以 ".xlsx" 格式保存，便于后续分析。该系统具有较快的分析速度（约 1 分钟即可完成一个视野内一组细胞的分析），并可生成直观的变化曲线，显著提高了检测效率。单细胞 Ca2+ 成像是研究 Ca2+ 相关通道的重要技术手段，在离子通道相关的生物医学研究中具有重要价值。该技术在单细胞钙成像领域的应用有望极大地推动中医药作用机制的研究进展。
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方案
实验方法经清华大学和北京中医药大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其指导方针。本方案介绍了针对多种细胞类型的单细胞 Ca2+ 成像方法，包括从多只新生小鼠（出生后三天内，性别随机的同窝仔鼠，C57BL/6 小鼠）皮肤中分离的原代角质形成细胞。本研究中使用的试剂和设备详情列于材料表中。
1. 细胞准备
注意： 原代细胞、内源性靶基因的细胞系，或转染了过表达质粒的细胞均适用于单细胞 Ca2+ 成像。本研究中所用质粒由清华大学肖百龙教授实验室提供。这些质粒通过将绿色荧光蛋白 GFP 的序列与人源 STIM1、DsRed 荧光蛋白与人源 Orai1、mRuby 荧光蛋白与兔源 TRPV1，以及红色荧光蛋白 mCherry 分别插入噬菌体质粒载体而构建10。
- 在24孔板中准备直径为8 mm的无菌玻璃载玻片。向每孔加入500 μL多聚-D-赖氨酸（PDL）缓冲液（50 μg/mL，溶于DPBS中）。
- 将载玻片置于37 °C孵育1 h以完成包被，然后用移液器弃去包被液。
- 用DPBS洗涤载玻片一次，并将其置于一旁备用。
- 根据各自特定的培养方法分别培养原代细胞和细胞系10。
- 将细胞以约1.5 × 105个细胞/孔的密度接种至已准备好的24孔板中。待细胞贴附于盖玻片后，用于Ca2+成像实验。
- 对于过表达质粒的细胞，使用Lipofectamine 2000（或Lipofectamine 3000）转染试剂以1:1的比例转染目标质粒（1 μg/孔）10,15，并在细胞培养箱中孵育约24 h。
注意：对于较大的表达蛋白，可能需要更长的孵育时间。
2. Fura-2/AM 工作液的配制
- 向含有 50 μg Fura-2/AM 粉末的离心管中加入 50 μL 二甲基亚砜（DMSO），充分混匀，配制浓度为 1 μg/μL 的 Fura-2/AM 储存液。
- 将 Fura-2/AM 储存液与 Pluronic F-127 混合至含 1.3 mM Ca2+ 的 Hank's 缓冲液中。
注意： 工作液中 Fura-2/AM 和 Pluronic F-127 的终浓度为 2.5 μg/mL。Hank's 缓冲液通过向 1× HBSS 缓冲液中添加 10 mM HEPES 配制而成。 - 使用铝箔包裹以避免 Fura-2/AM 工作液暴露于光照下。
3. 单细胞 Ca2+ 成像的细胞预处理
- 将带有细胞的玻片转移至一个新的24孔板中，孔内预先加入Hank's缓冲液用于洗涤。
- 用移液器弃去缓冲液，每孔加入500 μL Fura-2/AM工作缓冲液。
- 室温避光孵育30分钟，使探针充分加载。
- 移除Fura-2/AM工作缓冲液，用Hank's缓冲液洗涤细胞三次，以去除多余的Fura-2/AM。此时细胞已准备就绪，可供使用。
4. 启动 Ca2+ 成像系统
注意：本研究中使用荧光显微镜进行 Ca2+ 成像。
- 依次启动以下组件：DG4光源（氙灯）、相机、白光光源、显微镜载物台控制器、显微镜、计算机以及荧光成像软件。
注意：若需检测温度对离子通道激活的影响，还需开启以下组件：灌流系统、加热系统、温度控制器以及液体循环加热/冷却装置。
5. 细胞内 Ca2+ 反应实验步骤
- 打开荧光成像软件（参见材料表）。
- 选择实验方案，然后依次选择文件，再选择加载实验方案。选中所需的实验方案后点击确定。
- 在菜单列表中配置实验。
- 选择新建实验。
- 将灌流 chamber 安装到显微镜上。
注意：每次使用粗调焦旋钮安装或拆卸 chamber 时，务必先将物镜完全降下，以防止物镜受损。 - 取出经 Fura-2/AM 处理的细胞载玻片，并将其放入含有 Hank's 缓冲液的 chamber 中。
- 启动灌流系统。
- 选择20x DIC 物镜，并在白光下调节焦距。
- 点击任务栏上的Cfg Exp。
- 选择用于成像的所需荧光染料。
- 确定采集频率和屏幕显示设置（采集：勾选 340、380、GFP；采集间隔：1 s；保存间隔：1 s）。
- 对焦
- 在实验控制面板上，点击对焦按钮。
- 根据需要调整采集时间（通常为 100 ms）和增益，然后"为该波长保存设置"。
注意：对于紫外光，应使用增益而非曝光时间。 - 选择用于对焦的合适波长（例如 380），然后点击开始对焦。
- 将视野从双目镜切换至计算机屏幕。
- 确保通过双目镜可观察到微弱的绿色荧光。
- 先使用粗调焦使物镜接近焦平面，再使用细调焦对细胞进行对焦。
注意：当物镜过于接近载物台时，显微镜会发出蜂鸣声。若发生此情况，请降低物镜，重新对齐载物台上的样品板，然后再次对焦。尽量减少对焦时间，以降低激光对细胞的损伤。 - 在对焦过程中检查细胞的荧光强度。
- 通过调节曝光时间和增益来调整细胞的荧光强度。
注意：340 和 380 的曝光时间和增益必须保持一致。 - 当获得清晰对焦后，按下显微镜上的按钮，将视野切换至计算机。
- 根据需要重新对焦以获得最清晰的图像，然后点击停止对焦。
- 寻找 GFP 阳性细胞的替代操作流程
- 首先使用 340/380 波长进行对焦，以获得良好的细胞图像。
- 选择 FITC，然后点击开始对焦。
- 使用载物台控制器寻找 GFP 阳性细胞。
- 将视野切换至计算机，然后点击停止对焦。
- 区域选择
- 点击菜单栏中的区域按钮。
- 选择所需的照明类型（340/380/FITC/TRITC）。对于过表达目标质粒的细胞，分别选择 FITC 和 TRITC 滤光片以检测 GFP 和 mCherry/DsRed/mRuby；否则选择 Fura-2。
注意：应避免选择状态不佳或已死亡的细胞，例如明显呈圆形或荧光蛋白过度曝光的细胞。 - 点击采集图像，然后点击确定。
- 新窗口将弹出，使用椭圆工具点击细胞区域以选择细胞。
- 在目标蛋白所携带的荧光（FITC 或 TRITC）下选择目标细胞；在 380 nm 条件下选择不表达目标蛋白的对照细胞。
- 通过右键点击圆形区域并选择“删除区域”来撤销选定区域。
- 将背景区域作为最后一个区域选中，并记录其 ID 编号。
- 点击保存，然后点击完成。
- 背景扣除
- 点击菜单按钮参考。
- 输入背景区域的编号。
注意：如果背景是最后选择的区域，输入一个非常大的数字将自动切换到最后一个选定的区域。 - 勾选扣除参考复选框，然后点击确定。
- 记录数据
- 点击实验控制面板上的记录数据按钮。
注意：仅当需要回放实验时才保存图像；通常仅勾选数据框即可。 - 确保出现提示框，询问首选的数据文件类型；建议选择 .xlsx 格式。
- 将打开一个".xlsx" 类型的工作表。将其最小化可避免占用屏幕空间。
- 点击实验控制面板上的记录数据按钮。
- 数据采集
- 在控制面板的时间间隔部分，将数据采集间隔设置为1 s。
注意：可根据实际需求进行调整。 - 点击实验控制面板上的归零时钟和采集按钮以开始实验。图中将显示各选定细胞区域的基线。
- 根据实验要求对细胞进行一系列处理。
- 为观察细胞的温度响应，使用温度控制器将灌流系统中的缓冲液加热至适当温度。
- 为观察药物对细胞的影响，通过灌流或手动添加含药物的缓冲液，并记录细胞变化。
- 数据采集完成后，点击暂停。
注意：实验过程中可随时暂停数据采集，并重置时钟。 - 保存并分析数据。
- 在控制面板的时间间隔部分，将数据采集间隔设置为1 s。
- 点击文件和关闭实验以结束实验，并在弹出的对话框中选择否以保存实验方案。
- 通过点击菜单中的新建开始新实验，并重复上述流程。
- 关闭系统
- 关闭软件，并将数据从计算机中转移。
- 按启动步骤的逆序关闭设备。
- 在登记表上记录使用时长，并清理实验台面。
- 数据分析
- 用 Fura-2 340/380 荧光比值表示细胞内 Ca2+ 浓度，或将其转换为相应的 Ca2+ 浓度。
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结果
温度响应检测
原代角质形成细胞
原代角质形成细胞从小鼠新生鼠中分离，并根据已建立的方案进行制备10。将这些细胞接种于含有玻璃盖玻片的24孔板中。在加载Fura-2探针后，在显微镜下调节焦距，激发波长为380 nm，以清晰观察细胞形态，如图2A所示。若在操作过程中探针加载失败，则细胞不可见。通过灌流系统持续更换腔室中的细胞外缓冲液，以维持细胞的最佳状态。温度控制系统与灌流系统相连，通过调控细胞外缓冲液的温度变化，实现对细胞热反应的检测。该过程包括逐步加热细胞外缓冲液，随后再逐步冷却。
单细胞 Ca2+ 成像系统被用于监测在不同实验条件下细胞内 Ca2+ 浓度的变化。如图2B所示，角质形成细胞在受热时表现出明显的热反应，同时在冷却阶段也呈现出显著的反应。值得注意的是，当敲除主要介导该反应的 STIM1 基因后，...
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讨论
单细胞Ca2+成像系统的应用十分广泛，可用于研究多种细胞类型中的Ca2+信号，包括角质形成细胞、干细胞16、肝细胞、心肌细胞17、足细胞18、免疫细胞以及过表达目标蛋白的细胞系10,19。该技术可测量细胞内Ca2+浓度的变化及绝对值，在研究Ca2+相关离子通道方面发挥着关键作用，是离子通道研究实验室中不可或缺的重要工具之一。
随着研究的深入，钙离子（Ca2+）信号相关离子通道的重要性在中医药研究领域日益受到重视。研究人员试图通过离子通道的视角来解析中医药的核心问题。例如，中药的寒热药性体现了“寒者热之，热者寒之”的治疗原则""。许多介导Ca2+信号的温度敏感性离子通道与这一原则密...
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
感谢清华大学的 Bailong Xiao 分享单细胞 Ca2+ 成像系统和温度控制操作系统，并对本项目提供的支持与协助。本研究由国家自然科学基金（32000705）、中华中医药学会青年精英科学家资助项目（CACM-(2021–QNRC2–B11)）、中央高校基本科研业务费专项资金（2020–JYB–XJSJJ–026）、（2024-JYB-KYPT-06）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 相机 | Nikon | ||
| 辣椒素 | Sigma | 211275 | |
| CL-100 温度控制器 | Warner Instruments | ||
| 环匹阿西酸（CPA） | Sigma | C1530 | |
| DG-4 光源 | Sutter Instrument Company | ||
| 二甲基亚砜（DMSO） | Amresco | 231 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| 荧光成像软件（MetaFluor，付费软件） | Molecular Devices | ||
| 荧光显微镜 | Nikon | ||
| Fura-2/AM | Invitrogen | F1201 | |
| HBSS 缓冲液 | Gibco | 14175103 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| Pluronic F-127 | Beyotime | ST501 | |
| 聚-D-赖氨酸 | Beyotime | ST508 | |
| SC-20 液体循环加热/冷却装置 | Harvard Apparatus | ||
| 白光光源 | Nikon |
参考文献
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