采用膜片钳技术记录新鲜分离基底动脉平滑肌细胞中的内向整流性K+电流

摘要

本方案描述了一种从大鼠基底动脉快速高效地分离平滑肌细胞，并利用全细胞膜片钳技术记录这些细胞中内向整流钾通道电流的方法。该方法为研究基底动脉和离子通道的科研人员提供了一种新颖的技术途径。

摘要

脑血管疾病在老年人群中十分常见，其发病率呈持续上升趋势。基底动脉是供应脑桥、小脑、脑后部区域及内耳的重要脑血管。钾（K⁺）通道活性通过调节细胞膜电位，在决定血管张力方面发挥重要作用。内向整流K⁺ (Kir)通道与其他K通道一样⁺ 通道，导致细胞膜超极化和血管舒张。本研究采用从基底动脉新分离的平滑肌细胞记录内向整流钾电流（Kir电流） 通过 全细胞膜片钳技术。100 µmol/L BaCl₂的作用₂，一种Kir通道抑制剂，以及10 µmol/L硝普钠（SNP，一种硝基类血管扩张剂）对Kir通道电流的影响进行了研究。结果表明，BaCl₂ 在基底动脉平滑肌细胞中，Kir通道电流受到抑制，而SNP则增强这些电流。本方案提供了制备新鲜分离的动脉平滑肌细胞并利用膜片钳技术记录Kir通道电流的全面指南，为希望掌握该方法的研究人员提供了宝贵的资源。

引言

脑血管疾病在老年人群中是一种常见病。随着生活水平的提高、预期寿命的延长以及人口老龄化，脑血管疾病的发病率正持续上升¹。基底动脉是由双侧椎动脉汇合而成的一条不成对血管，走行于颅内脑桥腹侧，最终分为两条大脑后动脉。该动脉为脑桥、小脑、大脑后部区域以及内耳供血。当基底动脉供血不足时，可引起发作性眩晕，常伴有恶心和呕吐。患者还可能出现耳鸣、听力下降及其他相关症状。这些症状常与颈椎病、脑动脉粥样硬化及血压异常等疾病相关。脑血管疾病在中老年人群中尤为常见，通常与上述基础疾病密切相关^2,3,4。

阻力血管在心血管功能和维持机体稳态中起着至关重要的作用。作为血管阻力的主要部位，它们通过调节血压和心输出量，确保向组织和器官输送足够的血流，以满足其代谢和生理需求⁵。基底动脉属于阻力血管，主要调节脑干的血流⁶。构成阻力血管壁的平滑肌细胞通过调控稳态收缩或血管张力，在血管阻力调节中发挥关键作用。这些细胞表达多种离子通道，包括K⁺通道、Ca²⁺通道和Cl^-通道，这些通道对血管张力的调节至关重要^5,7。

K⁺ 通道在建立动脉平滑肌细胞膜电位和调节其收缩张力方面至关重要⁸。动脉平滑肌中存在四种类型的 K⁺ 通道：电压依赖性 K⁺（Kᴠ）、Ca²⁺ 依赖性 K⁺（K_Ca）、ATP 依赖性 K⁺（K_ATP）和内向整流 K⁺（Kir）通道^9,10,11。Kir 通道可分为七个亚型，其中 Kir2.x 为经典的 Kir 通道。在这些亚型中，Kir2.x 亚家族在血管系统中最为重要。Kir 电流在负电压下表现出内向整流特性，表明 K⁺ 净流入细胞；而在正电压下，几乎没有净 K⁺ 电流通过⁵。在心血管系统中，Kir 通道对于稳定膜电位至关重要，其激活可引起细胞膜超极化并导致血管舒张^12,13,14。

已对多种动脉（包括冠状动脉、脑动脉、肾动脉和肠系膜动脉）中 freshly isolated 的平滑肌细胞开展了膜片钳实验^15,16。尽管部分方法在细胞分离过程中使用相同类型的胶原酶，但具体操作步骤存在差异。目前尚少有研究系统总结血管平滑肌细胞的分离方法。因此，本研究聚焦于从大鼠基底动脉中 fresh isolation 原代血管平滑肌细胞，并采用全细胞膜片钳技术记录这些细胞中的 Kir 通道电流，为相关领域的研究人员提供一套详尽且完整的实验方案。

方案

动物实验方案经成都中医药大学实验动物福利伦理委员会批准（记录编号：2024035）。本研究采用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重260–300 g，年龄8–10周。动物可自由获取水和食物（SPF级实验动物饲料）。本研究所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.

1. 大鼠基底动脉解剖

1. 溶液配制
   1. 按照表1所述配制溶液。
2. 通过吸入2%异氟烷对大鼠进行麻醉。使用足趾夹捏法确认深度麻醉状态。如有需要，追加麻醉剂。立即在便携式手术台上开颅并暴露脑组织。
3. 迅速将脑组织转移至含有在95% O₂ 和5% CO₂ 混合气体中饱和、4 °C的PSS溶液的培养皿中。确保溶液pH值为7.40。
4. 将脑组织腹面朝上置于培养皿中，并用针固定。在光学显微镜下定位基底动脉，使用经高压灭菌的镊子和剪刀小心去除周围组织（见图1A）。
5. 将一根长2 cm、直径为25 µm的金属丝插入分离出的基底动脉中。轻轻用金属丝摩擦血管内壁，以有效去除血管内皮。
   注意：大鼠的基底动脉位于脑干底部的基底沟内，由左、右椎动脉汇合而成²。在分离过程中，应小心操作动脉，避免过度牵拉或受压，以防造成损伤。

2. 平滑肌细胞的分离

1. 将1 mL细胞分离液、1 mL酶消化液I和1 mL酶消化液II分别置于1、2、3号试管中，于37 °C预热（见图1B）。
2. 将分离的基底动脉转移至2号试管。持续向试管中通入95% O₂和5% CO₂的混合气体，维持酶消化处理30分钟（见图1C）。
3. 将基底动脉从2号试管转移至3号试管。继续向试管中通入95% O₂和5% CO₂的混合气体，维持酶消化处理5分钟（见图1D）。
4. 从1号试管中加入1 mL 37 °C的细胞分离液至3号试管。在继续通入95% O₂和5% CO₂的同时，维持酶消化处理3分钟。吹打基底动脉组织以释放细胞（见图1E）。
5. 向3号试管中加入4 °C的分离液以终止酶反应（见图1F）。将混合物在59 × g下离心6分钟。用移液器弃去上清液，再次加入4 °C的分离液（见图1G），重复离心两次以去除残留酶。
6. 用移液器移除上清液，并将1 mL细胞悬液在4 °C保存，最多可保存6–8小时。
7. 取100 µL细胞悬液置于浴槽中（见图1H）。向浴槽中加入1 mL细胞外液，静置40分钟使细胞沉降并贴壁（见图2）。
   注意：对于处理组细胞（如BaCl₂或硝普钠处理组），在细胞贴壁期间，于室温（22–26°C）下与相应物质预孵育40分钟。

3. 使用全细胞膜片钳记录 Kir 电流

1. 微移液管的制备
   1. 打开微量移液器拉制仪（参见 材料表).
   2. 将一根玻璃管（外径：1.5 mm，内径：1.10 mm，长度：10 cm）放入拉制仪中。选择 程序 1，点击 进入以及访问 程序 1. 通过点击进行斜坡测试 斜坡 在控制面板上测量玻璃管的热值。
      注意：使用以下参数编辑程序1：加热：斜坡式（Ramp），拉力：0，速度：25，延迟：1，压力：500，模式：延迟，启用安全加热。每次更换灯丝或玻璃移液管类型时，必须进行斜坡测试。微移液管的尖端直径应为约1–2 µm，锥形部分长度约为5 mm。较小的尖端直径和较长的锥形会增加移液管电阻。
   3. 插入一根新的玻璃管并选择 程序 1. 点击 进入 制备微移液管。
2. 记录 Kir 电流
   1. 依次开启硬件设备：数模转换器、信号放大器、显微操作器、显微镜、相机和计算机。
   2. 按以下顺序启动软件：相机、信号放大器和数据采集软件。
      注意：如果显微镜未配备相机，则仅需激活仪器软件。应在硬件初始化完成后打开软件，以确保正常功能。
   3. 在数据采集软件中，选择 文件 > 设置数据文件名称 建立数据存储路径。
   4. 修改记录Kir电流的实验方案如下：
      1. 波形界面：时段 A & D：类型 = 阶跃；起始电平 = −60 mV；电平增量 = 0 mV；持续时间 = 100 ms；时间增量 = 0 ms。 B时段：类型 = 阶跃；起始电平 = −160 mV；电平增量 = 0 mV；持续时间 = 1 ms；时间增量 = 0 ms。 C时段：类型 = 斜坡；起始电平 = 40 mV；电平增量 = 20 mV；持续时间 = 500 ms；时间增量 = 0 ms。
      2. 模式/速率界面：试次延迟 = 0 s；运行次数 = 1；扫描次数 = 1；扫描持续时间 = 0.8 s。
      3. 输出界面：通道 #0；保持电位 = −60 mV。保存并命名该程序为 "Kir方案"
         注意：该实验方案设置针对特定的电流记录而定制，保存后可重复使用。确保输出接口与仪器的接线相匹配（例如，通道 #0）。
   5. 启用 膜片钳测试 功能在 工具 数据采集软件的菜单
   6. 将细胞置于显微镜相机视野的中心位置进行测量。
   7. 将参考电极尖端浸入灌流液中。用细胞内液填充步骤3.1中制备的微电极的20%，并将其固定在记录电极夹持器上。
      1. 使用注射器施加正压，将移液管尖移入浴液中，并在信号放大器软件中调节移液管偏移，使电流基线设定为 0 pA（参见 图3A).
         注意：使用 Ag/AgCl 参比电极丝。移液管电阻应为 4-6 MΩ。
   8. 轻轻按压 将移液管抵住细胞膜。观察到封接电阻（Rt）至少增加至1 MΩ（图3B）。移除正压，施加负压，以形成高阻封接，使Rt ≥ 1 GΩ（图 3C).
      1. 将钳制电压设为 −60 mV，并使用 Cp Fast 和 Cp Slow 补偿电极电容（图3D).
         注意：如果Rt仍高于1 GΩ，则继续下一步；否则，更换细胞或移液管，重复步骤3.2.6–3.2.8。
   9. 施加短暂的负压以破裂细胞膜，形成全细胞记录构型（图3E）。选择 全细胞 在信号放大器软件中，点击膜电容补偿的“自动”选项图3F），加载Kir程序，开始记录数据。对处理过的细胞重复步骤3.2.6–3.2.9。
      注意：如果串联电阻（Ra）是 >30 MΩ，选择一个新的细胞。如果 30 MΩ > Ra > 10 MΩ时，记录前需应用串联电阻补偿。本方案要求Ra < 10 MΩ
3. 分析数据
   1. 打开数据分析软件并加载记录的数据。使用光标分析电流轨迹，并导出数据用于绘制I-V曲线。
   2. 通过选择创建刺激波形信号 编辑 > 创建刺激波形信号 并确认。
   3. 通过选择导出 Kir 协议轨迹 编辑 > 转移痕迹，指定完整的轨迹区域和信号（A0 #0），并复制数据以供进一步分析。
   4. 通过选择导出具有代表性的 Kir 电流轨迹 编辑 > 转移痕迹，指定完整的轨迹区域和信号（IN 0），并复制数据以生成电流轨迹图。
      注意：为准确比较不同大小的细胞，需使用电流密度（pA/pF）对电流数据进行标准化处理。实验过程中应记录膜电容（Cm）。¹⁷.

结果

动脉平滑肌细胞的分离
该实验步骤的第一部分详细描述了从大鼠脑基底动脉中分离平滑肌细胞的过程。此过程在图1中进行了图示说明。该操作包括酶消化和细胞分离步骤，以从动脉组织中释放出平滑肌细胞。

分离出的平滑肌细胞的代表性图像
第二部分展示了分离出的平滑肌细胞的代表性示意图。图2 包含梭形平滑肌细胞的明场图像，根据其典型形态特征可确认其为平滑肌细胞。

全细胞膜片钳技术
第三部分概述了用于记录新鲜分离的平滑肌细胞中 Kir 电流的全细胞膜片钳技术的流程图。图3 详细展示了建立全细胞构型的膜片钳装置及操作步骤。

记录 Kir 电流
第四部分展...

讨论

使用 freshly isolated 细胞进行全细胞记录可追溯至20世纪80年代初¹⁸，而对啮齿类动物基底平滑肌细胞通道电流的记录在20世纪90年代已得到广泛应用¹⁹。随着技术的进步，研究人员日益关注通过这些技术所获得的研究成果。然而，对技术方法的更新与总结却逐渐被忽视。本文介绍了一种详细的方法，用于新鲜分离血管平滑肌细胞，并利用这些细胞记录 Kir 电流，旨在帮助研究人员理解标准的方法学流程。

血管平滑肌在调节动脉张力中起着至关重要的作用。已有大量关于分离血管平滑肌细胞的方法被报道^{20,21,22,23,24,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白	Sigma, USA	B2064
氯化钡	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, China	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
相机	Hamamatsu, Japan	C11440
相机软件	Image J, USA	Micro-manager 2.0.0-gammal
胶原酶 F	Sigma, USA	C7926
胶原酶 H	Sigma, USA	C8051
计算机	Lenovo, China	~
数据采集软件	Molecular Devices, USA	Clampex 10.4
数据分析软件	Axon, USA	clampfit 10.4
D-葡萄糖	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
数模转换器	Molecular Devices, USA	Axon digidata 1550B
二硫苏糖醇	Sigma, USA	D0632
绘图软件	San Diego, California, USA	GraphPad
EGTA	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A600077
玻璃管	DL Naturegene Life Sciences.USA	B150-86-10
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
MgCl2·6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
显微操作仪	sutter, USA	MP285A
微量移液器拉制仪	sutter, USA	P1000
显微镜	Olympus, Japan	IX73
Na2-ATP	Sigma, USA	A26209
Na2HPO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610404
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A600878
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
NaOH	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100173
木瓜蛋白酶	Sigma, USA	P4762
钾-D-葡萄糖酸盐	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A507810
信号放大器	Molecular Devices, USA	Axon MutiClamp 700B
信号放大器软件	Molecular Devices, USA	MultiClamp Commander software
硝普钠	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A600867
统计分析软件	San Diego, California, USA	GraphPad