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方法文章

兔模型视神经挤压伤的手术方法

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DOI：

10.3791/67415

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2025年7月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Spencer Center for Vision Research, Byers Eye Institute, Department of Ophthalmology, Stanford University, 2Department of Ophthalmology, Technical University of Munich, Hospital rechts der Isar, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Department of Comparative Medicine, Stanford University, 5Glaucoma Center of Excellence, Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University

本文内容

摘要

本文介绍了使用标准眼科手术技术在兔模型中进行视神经挫伤的详细操作步骤。

摘要

视神经 crush（ONC）是一种用于模拟和研究视神经病变机制及潜在治疗干预措施的实验技术。以往的ONC研究主要采用啮齿类动物模型，但这些模型在解剖结构和生理特性上与人类存在显著差异，可能限制其临床转化价值。本文描述了一种在兔体内建立ONC模型的手术技术，兔眼的眼球尺寸与人类更为接近。该手术技术借鉴了斜视和眼整形手术中的眼科操作方法，无需制作骨窗或进行睑裂切开术。本模型通过评估不同光照条件下瞳孔反应以及ONC术前和术后视觉诱发电位（VEPs）进行验证。结果显示，与未处理的对侧眼相比，ONC眼的瞳孔反应和VEP振幅均显著降低，表明损伤后视觉功能丧失，符合预期。该手术技术可为探索视神经损伤机制及测试潜在治疗策略提供模型，对理解与治疗眼部神经退行性疾病具有广泛意义。

引言

视神经钳夹（ONC）技术是一种实验性方法，用于建立受控的视神经损伤模型，以研究视神经病变1,2,3。通过在视神经局部造成损伤，导致轴突受损和视网膜神经节细胞退化，ONC模型可模拟多种视神经病变的病理特征，例如外伤性视神经病变和青光眼4,5,6,7。该受控模型为进一步深入研究眼科学和神经科学领域中神经损伤、退变及潜在再生的机制提供了重要平台8,9,10,11,12,13,14。

ONC 技术及其相关研究已广泛采用啮齿类动物模型，因其具有体型小、易于操作和维护成本低等优势。此外，啮齿类动物拥有丰富的基因操作工具，这对于基因治疗和分子干预至关重要12,14,15。尽管如此，啮齿类与人类之间显著的解剖学和生理学差异可能限制其研究结果的可转化性。由于眼球尺寸存在巨大差异（大鼠眼轴长度为 6.3 mm16，而人类为 22.5 mm），在啮齿类动物中开发的治疗方法可能难以直接应用于人类。兔眼的眼轴长度（15.3 mm17,18）更接近人类眼球尺寸，因此相较于啮齿类动物，兔子是开发手术技术和药代动力学研究更理想的模型。虽然已有研究将兔子用于 ONC 模型，但目前的文献对手术方法描述不足，和/或采用了睑裂切开术或骨窗技术19,20,21,22,23,24,25。兔子与人类眼球之间存在一些解剖学差异，例如存在有髓神经纤维、视网膜相对无血管化，以及缺乏胶原性的筛板结构，这些因素限制了其完全的可转化性；然而，兔子仍可作为最终向人类应用转化的过渡性模型。

尽管已有研究报道在猪4,6、山羊5,9和非人灵长类动物5,26等较大动物模型中开展视神经钳夹（ONC）技术，但这些模型的操作复杂性和/或高昂成本限制了其广泛应用。因此，兔子提供了一种经济且眼球足够大的折中选择。

针对这一需求，本研究提出了一种为兔模型优化的视神经钳夹（ONC）手术技术。通过在兔模型中应用ONC技术，我们旨在弥补当前动物模型的不足，加深对视神经损伤和神经退行性疾病的理解，并开发新的治疗策略。

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方案

本研究中使用了新西兰白兔（4.4 - 4.8 kg）。动物实验设计遵循ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用指南。斯坦福大学机构动物护理和使用委员会对这些实验进行了审查并批准实施（方案编号：APLAC-33781）。

1. ONC

  1. 按照兽医服务中心（VSC）指南对兔子（n = 4）进行麻醉，以确保整个操作过程中兔子充分镇静且无痛。简要而言，皮下注射氯胺酮（30 mg/kg）和赛拉嗪（3 mg/kg）。
    注意：通过评估多个麻醉深度参数（包括脚趾夹捏反应和下颌张力）来确认麻醉的手术平面。
  2. 在手术开始时，皮下注射缓释布托啡诺（0.15 mg/kg）以提供镇痛，并给予马罗皮坦柠檬酸盐（2 mg/kg）以促进平稳恢复。每5–15分钟监测一次动物的生命体征和麻醉深度，以确保其健康状况。
  3. 提供热源，例如电热垫或循环水毯，并根据体温调节设置。
  4. 根据需要通过面罩提供1-4%异氟烷或1-6%七氟烷以维持麻醉。
  5. 在操作前约5-15分钟，给予丙帕卡因（0.5%）、去氧肾上腺素（2.5%）和托吡卡胺（1%）滴眼液的联合用药。
    注意：眼药水可提供局部麻醉和散瞳作用27.
  6. 将兔子侧卧放置，使右眼暴露（图1）。使用标准无菌技术，将5%聚维酮碘溶液涂抹于眼部、睫毛及眼周皮肤进行消毒。
  7. 再次滴用丙帕卡因眼药水以加强局部麻醉。
  8. 为保持无菌，用保鲜膜覆盖动物标本28，于右眼处留出一个约眼睛大小的小孔开口（图1).
    1. 仅握住每张保鲜膜的顶部和底部边缘进行操作，因为它们已粘贴在桌面下方，不会影响无菌状态。
    2. 佩戴无菌手套，并确保所有经高压灭菌的手术器械在操作过程中始终处于无菌区域内。每只动物使用一套全新的器械。
  9. 在近角膜缘的上方周边角膜处放置一条部分厚度角膜牵引缝线（8-0），轻柔地将眼球下转，以更好地暴露位于上方的兔视神经图2A).
  10. 进行结膜环切术（即在角膜周围切开结膜）29 使用Westcott剪刀和0.12 mm镊子从10点方向到2点方向进行操作。
  11. 使用Wescott剪刀仔细钝性分离Tenon囊，以暴露其下方的上直肌和上斜肌。
  12. 使用肌肉钩分离上部肌肉（图2B).
  13. 使用标准斜视手术技术，以双针8-0缝线固定钩状肌肉30 (图2C）。简要步骤如下：将缝线全层穿过上方肌肉的中心位置，并使用外科结打结固定。然后，将针以半层厚度从肌肉中心沿肌肉长度方向穿至肌肉边缘。反手持针，从肌肉背面全层向前穿出。将持针器穿过线环以夹住针体。
    注意：拉紧第一根缝合针可收紧并固定肌肉的一半；然后使用第二根缝合针以镜像方式固定肌肉的另一半。
  14. 使用Wescott剪刀将肌肉从眼球上分离，注意不要剪断置于肌肉上的缝线。
  15. 用角膜缝线轻柔地向下牵拉眼球，并向上牵拉肌腱缝线以暴露眶内锥体腔隙图 2D).
  16. 轻轻钝性分离周围的眼眶组织，以充分暴露视神经。
    1. 不要切割眼眶内的任何组织，仅使用钝性分离。避免损伤涡静脉（图 2D).
    2. 必要时使用肌肉钩来定位并分离视神经（图2E).
      注意：兔的视神经位置略偏上方，周围被眶后组织（包括白色脂肪）包绕。该神经呈白色，直径约1 mm。长 posterior ciliary 动脉沿视神经乳头下方的3点和9点子午线走行，可作为定位视神经的解剖标志。31.
  17. 使用持针器夹闭视神经60秒以诱导 crush 损伤，之后将出现可见的压痕（图 2F，G。压榨部位位于视神经乳头后方约3 mm处，以避免损伤眼动脉。使用带锁止功能的持针器，以确保所有视神经压榨处理中施加的力保持一致，从而使各实验兔的视神经损伤程度具有可比性。
  18. 将上部肌肉重新复位至其在眼球上的原始位置图 2H）。将先前用于固定上直肌和上斜肌的两根针部分厚度穿过原肌肉附着点。拉紧缝线并打外科结30.
  19. 通过间断缝合将结膜缝合至角膜缘以完成操作（图 2I).
  20. 在操作结束时，皮下注射加温的晶体液（10 mL/kg）和美洛昔康（0.5 mg/kg）以提供镇痛。关闭气体麻醉以恢复动物意识，并通过肌肉注射阿替美唑（0.3 mg/kg）逆转赛拉嗪的作用。在恢复期间，皮下注射缓释布托啡诺（0.15 mg/kg）。
  21. 术后2-3天内每天皮下注射美洛昔康（0.5 mg/kg）一次，必要时可增加给药次数。在术后2-3天内提供支持性护理，包括额外的环境丰富化装置（如玩具）和饮食丰富化，必要时继续提供。
  22. 根据需要在术后给予额外的皮下补液。术后前三天每日监测动物两次，之后每周或根据需要进行监测。

2. 瞳孔反应

注意：为评估视觉功能，需在视神经挤压伤前（第 -3、-2 和 -1 天）和伤后（第 +1、+2 和 +3 天）按照下述步骤检测双眼的瞳孔对光反射反应。

  1. 使用智能手机摄像头，在弱光（中等光照）条件下拍摄左右眼的图像。
  2. 从约15厘米的距离，将笔灯直接照射右眼，拍摄眼睛图像，然后对左眼重复相同操作。
    注意：瞳孔反应应在5-10秒内趋于稳定。
  3. 使用Image J软件，从所获取的图像中计算瞳孔直径与角膜缘到角膜缘直径的比值。

3. 闪光视觉诱发电位（VEP）

注意：为了评估从视网膜经视神经至视觉皮层的视觉通路完整性，需在暗室条件下，按照下述步骤分别于视神经挤压伤前（第 -2 天）和损伤后（第 +7 天和第 +14 天）记录双眼的视觉诱发电位（VEP）波形。

  1. 根据VSC指南对兔子进行麻醉。简要而言，肌肉注射氯胺酮（15 mg/kg）、右美托咪定（0.05 mg/kg）和咪达唑仑（0.3 mg/kg）。
    注意：气体麻醉可能会减弱VEP信号，因此应尽可能避免使用。
  2. 使用丙美卡因（0.5%）、去氧肾上腺素（2.5%）和托吡卡胺（1%）的混合滴眼液。
  3. 在皮下插入三根针状电极，位置如图3A所示：内眦之间（黑色导线，参考电极）、肩胛骨之间（绿色导线，接地电极）以及枕外隆突处（红色导线，记录电极）6。
  4. 将眼睑拉钩置于左眼，并遮盖右眼以防止任何光线照射。
  5. 使用手持设备（图3B、C）记录VEP波形，同时给予闪光刺激（8.0 cd·s/m2，0.99 Hz）。
    注意：记录前应确保噪声水平< 20 µV。
  6. 至少重复此记录过程三次。
    注意：三次重复测量取平均值，并视为一个数据点。
  7. 对右眼执行相同的操作流程，确保此时左眼被遮盖以防止光线照射。
  8. 从采集到的VEP波形中确定P1潜伏期和振幅。P1潜伏期定义为初始负向波峰（N1）之后第一个正向波峰（P1）出现的时间，通常出现在约60 ms左右。P1振幅计算为P1与N1处振幅之差。

4. 轴突标记与成像

  1. 视神经钳夹损伤后一周，使用29 G胰岛素注射器将顺行轴突示踪剂霍乱毒素B亚单位（CTB；与Alexa Fluor 488偶联）以每眼50 µL（1 µg/µL CTB溶于PBS中，无菌过滤）的剂量玻璃体内注射至双眼。
  2. 视神经钳夹损伤后两周，通过静脉注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）和苯妥英钠（12.8 mg/kg）处死兔，并通过心脏听诊确认死亡。
  3. 摘除眼球，使用Westcott剪刀去除残留组织，并将眼球在4%多聚甲醛（溶于PBS）中于4 °C固定24小时。
  4. 用PBS清洗眼球4小时后，解剖固定后的视神经并进行纵向冷冻切片。
  5. 用PBS清洗切片，每次5分钟，共清洗3次。
  6. 将切片在含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；1:1,000）的PBS中孵育5分钟。
  7. 用PBS清洗切片，每次5分钟，共清洗3次。
  8. 将切片封片于封片介质中，并使用共聚焦显微镜成像。

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结果

为了评估视觉功能，通过计算瞳孔直径（黄色实线）的比值来量化瞳孔反应 图 4A）相对于白对白直径（图中黄色虚线） 图4A在中等光照和闪光照明条件下，如图所示 图4在视神经钳夹（ONC）手术前，瞳孔对光刺激表现出明显的收缩反应。然而，在ONC术后1至3天内，在相同光照条件下，瞳孔直径与术前相比几乎无变化或无明显变化。图 4E；p < 0.0001，配对t检验）。这种反应性的下降表明在ONC手术后视觉功能显著丧失。

为了进一步评估视觉功能，记录了视神经挤压伤（ONC）眼和未治疗的对侧眼的视觉诱发电位（VEP）波形（图5）。尽管P1潜伏期保持稳定且无显著差异，但ONC眼的P1波幅 显著降低（P = 0.032）。波幅的降低证实了视神经损伤后视觉...

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讨论

本研究介绍了一种在兔子中实施ONC手术的详细方案，强调采用一种侵入性更小的方法来暴露视神经。既往报道缺乏全面的描述、可视化操作指导，或依赖于更具侵入性的技术，需要植入物、外眦切开和/或骨切除19,20,21,22,23,24,25。我们的方法采用了斜视和眼整形手术中常用的标准化眼科技术，能够实现可重复且一致的视神经损伤。

该操作过程约需20-30分钟完成，且未出现术后并发症，包括角膜擦伤、角膜溃疡、结膜炎、眶隔前蜂窝织炎和眶蜂窝织炎、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞以及球后出血。手术成功的关键步骤包括仔细分离眶内脂肪和结缔组...

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披露

作者无任何利益冲突或竞争性经济利益。

致谢

本工作由国家眼科研究所资助，资助编号为 K08-EY033407 和 P30-EY026877，以及“预防失明研究”组织。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
8-0 涂层薇乔紫线缝合线 TG140-8 双针EthiconJ547G用于视神经压榨手术
Antisedan（盐酸阿替美唑 5.0 mg/mL 溶液）ZoetisNDC:54771-6293用于术中应用
Bonn 打结镊，斜头 0.2 mm，钛材质Titan MedicalTMF502用于视神经压榨手术
Castroviejo 弯头持针器，钛材质Titan MedicalTMH105用于视神经压榨手术
Castroviejo 缝合镊，1×2，0.12 mm，直头，钛材质Titan MedicalTMF411用于视神经压榨手术
Cerenia（柠檬酸马罗匹坦 10 mg/mL 溶液）ZoetisNDC:54771-8179用于术中应用
一次性不锈钢皮下针电极Natus019-476600用于视觉诱发电位检测
Euthasol（戊巴比妥钠 390 mg/mL 和苯妥英钠 50 mg/mL）VirbacNDC: 51311-050用于安乐死
Graefe 肌肉钩，钛材质Titan MedicalTME133用于视神经压榨手术
胰岛素注射器 1/2 mL，29 G，1/2"Monoject8881600350用于玻璃体内注射
Jameson 肌肉钩Titan MedicalTME122用于视神经压榨手术
McPherson 打结镊，直头 0.2 mm，钛材质Titan MedicalTMF501用于视神经压榨手术
Normosol-R（等渗平衡电解质溶液；晶体液）ICU Medical Inc.NDC:0990-7670用于术中应用
氧氟沙星滴眼液 0.3%Bausch & Lomb60505-0560-0用于术后应用
Olympus FLUOVIEW FV3000OlympusFLUOVIEW FV3000共聚焦激光扫描显微镜
盐酸去氧肾上腺素 2.5% 滴眼液Bausch & Lomb82260-102-10用于术前应用
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Invitrogen P36934封片介质
盐酸丙帕他卡因 0.5% 滴眼液Bausch & Lomb24208-730-06用于术前应用
RETeval 视觉电生理检测设备LKC Technologies, Inc.RETeval用于视觉诱发电位检测
托吡卡胺 1.0% 滴眼液Bausch & Lomb24208-585-64用于术前应用
Westcott 弯头剪刀Titan MedicalTMS401用于视神经压榨手术

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