使用 杜仲 树皮提取物配制锌基纳米材料及其伤口愈合潜力

摘要

在这里，我们提出了一种使用从 杜 仲树皮中获得的富含聚异戊二烯的水提取物合成氧化锌 （ZnO） 纳米颗粒的方案。使用划痕测定评估合成的 ZnO 纳米颗粒在人脐静脉内皮细胞 （HUVECs） 上表现出的伤口愈合潜力，这是一种简单、经济高效且有效的方法。

摘要

杜仲树皮中的水 提取物是生物 活性化合物的丰富来源，具有许多健康益处。这里的方案旨在探索使用 杜仲 树皮介导的富含聚异戊二烯的水提取物制备氧化锌 （ZnO） 纳米颗粒。同时，拟议的方案通过简化过程与伤口愈合材料的制备有关。此外，使用简单的划痕测定对人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 单层评估合成纳米颗粒 （Eu-ZnO-NPs） 的伤口愈合潜力。用 Eu-ZnO-NPs 处理 24 小时后，评估 HUVEC 细胞的细胞增殖和迁移。在研究结束时，在用不同浓度的 Eu-ZnO-NPs 处理的划痕单层中观察到细胞增殖和迁移，而在对照细胞中观察到较差的细胞迁移和增殖速率。在所选浓度中，20 μg/mL Eu-ZnO 纳米材料显示出更好的细胞迁移和增强的伤口愈合潜力。

引言

药用植物和植物衍生化合物已被证明具有许多健康益处¹。世界卫生组织 （WHO） 报告称，全球 80% 的人口依赖传统药用植物进行初级卫生保健。中国因其传统中医 （TCM） 实践而广受认可和欢迎。据报道，中草药可以治疗各种疾病并利用其生物潜力。药用植物是生物活性化合物和多种治疗作用的储存库。药用植物也被用于治疗伤口。有几种类型的方法可用于治疗慢性伤口².最近的一项调查显示，药用植物通过为愈合提供有利条件、免受感染和紧固组织再生来参与伤口愈合过程³。同时，药用植物中存在的生物活性化合物的抗菌和抗真菌特性有助于治愈伤口并加快伤口愈合效率⁴。

金属基纳米材料因其生物相容性和可生物降解性而受到关注。 杜仲， 俗称中国橡胶树，是中国的原生物种。树的叶子和树皮用于药用。最重要的是，该植物物种在中国的中西部省份种植⁵.Peng 等人⁶报道了叶子、树皮和雄蕊花是可食用的，具有治疗潜力。此外， E. ulmoides 是木脂素、苯丙烷、环烯醚萜、类黄酮、氨基酸和微量元素的最佳来源。此外，树皮还被用于各种生物医学应用，例如控制血压、降低脂肪以及促进抗骨质疏松症和降血糖活性⁷。因此，毫无疑问，已经证明 E. ulmoides 树皮提取物在中医中有着悠久的历史。早期的报道表明，天然聚合物聚异戊二烯富含 杜仲⁸ 的树皮。基于上述信息，本工作旨在使用 Eucommia ulmoides 树皮提取物制造纳米材料。锌与树皮提取物的组合是制备纳米材料的一个有吸引力的选择。总体而言，本研究的最终目标是制造一种用于伤口愈合应用的新型混合纳米材料。

方案

注意:在制备提取物之前，使用去离子水将获得的树皮材料洗涤两次，并在阴凉处干燥。将阴凉干燥的树皮储存在密封容器中。

1. 杜仲树皮提取物的制备

1. 用剪刀将从 杜 仲树上收集的树皮切成小块。
2. 用双蒸水清洗切碎的树皮材料两次。
3. 在阴凉条件下，在 37 °C 下干燥树皮片 24 小时。
   1. 根据用于研究的树皮数量调整干燥过程的持续时间。在将树皮切成小块之前，确保树皮完全干燥。避免阳光直射。
4. 将 20 g 阴凉干燥的树皮转移到装有 220 mL 无菌双蒸水的锥形瓶中，并在 130 °C 下加热 20 分钟。
   1. 反应溶液的颜色变为浅黄色。10 分钟后溶液的颜色发生变化。让溶液再加热 10 分钟。根据样品量调整双蒸水的体积。
5. 将含有聚异戊二烯的粗提取物储存在4°C以备进一步使用。线状结构的形成表明提取物中存在聚异戊二烯。

2. 栉树皮介导的 ZnO 纳米颗粒的生物合成

1. 在 500 mL 锥形瓶中，将 1 M 硝酸锌二水合物 Zn （NO₃）₂ 加入 50 mL 去离子水中。使用磁力搅拌 （60 RPM） 持续搅拌。Zn （NO₃）₂ 需要 30 分钟才能完全溶解。
2. 将 15 mL 栉 树皮提取物滴加到 20 mL 1 M 硝酸锌二水合物 （Zn （NO₃）₂） 溶液中。
3. 将覆盖的反应混合物放在磁力搅拌器上，打开搅拌器，并以 （60 RPM） 旋转 3 小时。
4. 向反应混合物中滴加 1 N 氢氧化钠 NaOH （3 mL） 溶液，将 pH 值调节至 9。加入 NaOH 直到溶液混合物变成乳白色且 pH 值不大于 9。当形成 ZnO 纳米颗粒时，溶液变成乳白色。
   1. 1 M 硝酸锌二水合物 Zn （NO₃）₂ 溶液体积的制备可根据实验需要而变化。确保使用新鲜制备的树皮提取物。如果 pH 值超过 10，将导致纳米颗粒聚集。
5. 将合成的 Eu-ZnO-NP 转移到 50 mL 离心管中，并在 4 °C 下以 100 x g 离心 5 分钟。
   注意:立即清洗可以避免杂质。
6. 将洗涤的 Eu-ZnO-NPs 收集在玻璃板中，并在 45-50 °C 下在热风烘箱中干燥 1 小时。
   注意:如果 Eu-ZnO-NPs 保存超过 30 分钟，会影响纳米颗粒的物理化学性质

3. 使用 TEM 确认尺寸

1. 在 DDH₂O 中制备 1 mg/mL 纳米颗粒，并在铜网格中加载 5 μL Eu-ZnO-NP 样品，等待其完全干燥。在加载到铜网格上之前涡旋样品。
2. 将含有 Eu-ZnO-NPs 的铜网格加载到 TEM 样品架上，并以 50 倍和 100 倍放大倍率采集图像。
   注意: 在此步骤中，必须使用镊子拾取网格。

4. 细胞毒性评估

1. 在 96 孔板的每个孔中接种 1 ×^{10 4} 个 HUVEC，并将其置于 5% CO₂ 37°C 培养箱中。
2. 将 10 μL 各种浓度的 0、10、20、30、40 和 50 μg/mL 的 Eu-ZnO-NPs 添加到 90% 汇合的细胞中，并孵育 24 小时。
3. 孵育后，在不干扰细胞的情况下去除旧培养基，向含有 90 μL 新鲜 DMEM 培养基的每个孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，并在 5% CO₂、37 °C 培养箱中孵育。
4. 使用分光光度计测量在 450 nm 处用 CCK8 溶液处理的细胞的吸光度。
   注:在 15 分钟内立即测量吸光度，以避免吸光度的变化。

5. 用于划痕测定的 HUVEC 细胞的制备

1. 在含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 笔链球菌的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基的 12 孔培养板中接种适当 （1 × 10⁵） 量的 HUVEC，并在 5% CO₂ 37°C 培养箱中孵育。
   1. 在进行划痕测定之前，使用倒置显微镜检查汇合度。
      注:为了进行划痕测定，将根据要求使用 6 孔板或 12 孔板，并且不同培养板的细胞密度会有所不同。使用 70%-80% 汇合细胞是理想的，推荐用于划痕测定。DMEM 培养基的体积可能因研究中使用的培养板而异。例如，6 孔板需要 1-1.5 mL 的培养基，而 12 孔板需要 0.5-1.0 mL 的生长培养基。
2. 使用无菌的 200 μL 移液器吸头在伤口宽度为 200 μm 的代表性伤口中轻轻划伤。
3. 确保用于在细胞单层上划痕的尖端与细胞表面接触。
   注意:每次划伤时，请使用无菌尖端。
4. 去除完全培养基并使用 1 mL 1x PBS 洗涤 HUVEC 单层以去除分离的细胞。
   注意:确保从相应的孔中完全去除分离的单层细胞。确认伤口形成区域没有发生损伤。
5. 为了评估合成的 Eu-ZnO-NPs 的伤口愈合潜力，向孔中加入 0（对照）、10 和 20 μg/mL 浓度的 Eu-ZnO 纳米颗粒与含 10% FBS 的完全培养基混合。将实验板保持在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中。
   注:添加新鲜的完全培养基时，请勿干扰细胞单层。确保单层细胞在孵育过程中不受干扰。
6. 使用倒置显微镜在 0 小时和 24 小时获取显微照片。使用注释工具测量不同时间间隔的伤口闭合情况。
   1. 使用以下公式计算伤口闭合的百分比:伤口闭合 （%） = [（0 小时时的细胞迁移（以 μm 为单位） - 24 小时时的细胞迁移（以 μm 为单位））/ 0 小时时的细胞迁移（以 μm 为单位）] x 100。

结果

本研究旨在使用 杜仲 树的树皮合成纳米颗粒。树皮材料在阴凉环境中完全干燥（图 1）。通过在 130 °C 下加热样品 20 分钟，利用树皮材料制备热水粗提物。温度和持续时间的轻微变化可能会破坏植物化合物，使它们不适合制备水性提取物。制备了 E. ulmoides 的水性粗树皮提取物并用于纳米颗粒合成（图 2）。制备的提取物可以立即使用。长时间储存的提取物可能会影响合成过程。因此，建议使用新鲜制备的提取物来制备纳米颗粒。

粗树皮提取物介导的 ZnO NPs 的成功合成通过乳白色的外观和 pH 值的变化得到证实（图 3）。pH 值与纳米颗粒的大小密切相关，pH 值超过 9 会导致团聚和大小不均匀。使用 TEM 分析确认合成纳米材料的结构，合成的纳米颗粒显示出 80-90 nm 的粒径，如图 4 所示。应逐滴添加 NaOH 以防止反应混合物突然变化。金属基纳米制剂适用、价格低廉且毒性最小。然而，金属基纳米材料以其生物学功能而闻名。

通过CCK-8法测定Eu-ZnO-NPs对HUVECs细胞的细胞毒性，并暴露于不同浓度的Eu-ZnO-NPs中24 h。结果表明，在较高浓度 50 μg/mL 时，Eu-ZnO-NPs 对 HUVECs 细胞的细胞毒性没有明显变化（图 5）。加载适量的细胞，并使用无菌 200 μL 移液器吸头制作均匀大小的伤口。细胞体积超过限制可能会导致 pH 值变化和增殖速率减慢。治疗组治疗 24 h 后观察到细胞迁移和伤口闭合，而对照组未观察到类似变化。伤口愈合活性的结果显示，合成的 Eu-ZnO-NPs 在 HUVECs 细胞系上显示出伤口愈合特性。浓度为 20 μg/mL 的 Eu-ZnO 纳米材料可促进更快的细胞迁移并增强伤口愈合特性。最重要的是，合成的 Eu-ZnO 纳米颗粒显示出浓度依赖性作用模式。此外，处理 24 小时后，在划痕的单层中观察到细胞增殖和迁移，而在对照细胞中观察到较差的细胞迁移和增殖速率（图 6）。对照组观察到伤口闭合百分比为 16%，其次是 24 小时后 10 μg/mL 的 51% 和 20 μg/mL 处理组的 81.5%（图 7）。

图 1: 杜仲 树皮块的收集。 用于制备水性热水提取物的杜 仲 树皮图片。提取前，应彻底清洗树皮以去除杂质并完全阴凉干燥。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2: 杜仲 树皮提取物的制备: 用于合成纳米颗粒的杜 仲 树皮提取物的图片。用 20 g 树皮块制备 200 mL 的杜仲 树皮提取物。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:杜 仲 树皮介导的 ZnO 纳米颗粒的合成。 该图像显示了 Eu-ZnO 纳米颗粒的形成，乳白色的溶液代表 Eu-ZnO 纳米颗粒的形成。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:透射电子显微镜分析: 图像显示了杜仲 树皮介 导的 ZnO 纳米颗粒的不同放大倍率 （A） 100 nm 放大倍率和 （B） 50 nm 放大倍率。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:CCK-8 细胞活力测定。 条形图表示用 0-50 μg/mL 的不同浓度处理后细胞的活力，而未经处理的细胞用作阴性对照。数据表示均值和标准差。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6:用于伤口闭合评估的划痕测定。 用合成的 EU-ZnO NPs （10 μg/mL 和 20 μg/mL） 和不含 EU-ZnO NPs （对照组） 处理细胞并孵育 24 h。在用 EU-ZnO NPs 处理的细胞中观察到细胞增殖和迁移。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 7:伤口闭合百分比。 条形图表示 0 h 和 24 h 时 HUVEC 单层上有和没有 EU-ZnO NP 处理的伤口闭合百分比。数据表示均值和标准差。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

E. ulmoides 的树皮、种子和叶子被认为具有许多健康益处。我们的结果表明，EU-ZnO 纳米颗粒的合成是使用一种简单且具有成本效益的方法实现的。水提取物用于合成纳米颗粒。在高温下加热树皮材料可能会导致某些植物成分降解并降低提取效率。水性草药提取物中存在的植物成分可以还原金属离子形成纳米颗粒。硝酸锌二水合物因其生物相容性和高度稳定的特性而用于制备 ZnO 纳米颗粒⁹。使用导致最低到高毒性的金属元素来合成或设计纳米材料是有风险的，不能用于生物医学声明。这种合成可以在一天 （24 h） 内进行。然而，无毒金属和生物相容性材料被认为是安全的，并用于评估伤口愈合效率。合成纳米颗粒团聚的主要原因是植物化学键。纳米颗粒的团聚是由于范德华相互作用的吸引力和表面之间的吸引力^10,11。纳米颗粒的团聚会影响物理和光学特性。纳米颗粒的大小和形状可以使用煅烧和退火来改变¹²。纳米材料在去离子水中重悬和超声处理有助于避免纳米颗粒的团聚。水提取物中生物活性化合物或官能团的存在可能涉及还原过程。纳米颗粒产量仅取决于用于合成过程的反应混合物的体积。纳米颗粒的大规模合成有几个局限性，包括团聚和粒径不均匀。

与我们的研究结果类似，Aydin Acar 等人¹³ 报道说， 金盏花 提取物介导的 ZnO 纳米颗粒在 L929 细胞上表现出伤口愈合特性，伤口闭合率为 69.1%。此外， 疣状猪屁股喩喃 叶介导的 ZnO 纳米颗粒在 HeLA 细胞系上显示出 5 μg/mL 浓度的伤口愈合潜力，伤口闭合率为 40.45%¹⁴。Zhang 等人¹⁵报道，使用 Euphorbia fischeriana 合成的 ZnO 纳米颗粒在 10 和 15 μg/mL 浓度下显示出显着的伤口愈合特性。这些研究证明，合成的纳米制剂可以用作伤口愈合剂。这些研究的研究结果表明，合成的化合物可以修复伤口并有助于治疗组的再上皮化。

止血和细胞迁移被认为是伤口愈合的重要过程。在 HUVEC 单层上产生的划痕是使用移液器吸头模拟人工伤口制成的。此外，创建相同宽度的伤口非常棘手和复杂。另一方面，这是一种更便宜的方法。在该测定中，观察到与对照相比，设计的纳米颗粒在 10-20 μg/mL 浓度下在 HUVEC 上显示出优异的伤口愈合特性。此外，合成的 Eu-ZnO-NPs 具有修复细胞单层上产生的伤口而不会引起任何毒性作用的效力。这些 体外 实验可用于使用动物模型确定合成的基于聚合物的纳米材料的有效性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 孔板	NEST	703011	用于细胞培养和测定
离心	SCILOGEX	SC1406	用于从胶体混合物中分离纳米颗粒
离心管 – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	离心合成溶液
离心管 – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	储存纳米颗粒
CO2 培养箱	Thermo scientific	3010	培养 HUVEC 细胞
去噪水	小米	不适用	用于制备提取物
DMEM 培养基	Cytiva	SH30243.01	用于细胞培养工作
漏斗	Thermo Scientific	42600060	过滤过程中保持滤纸
玻璃烧杯	硼硅酸盐	1102-50	用于制备水提取物
热风烘箱	Genetimes	不适用	用于干燥纳米颗粒并以粉末形式收集
磁力搅拌器	KYLIN-BELL	GL-5250-A	用于纳米粒子合成
显微镜	Nikon Eclipse	Ts2	用于拍摄显微照片
培养皿	NEST	753001	用于收集纳米颗粒
移液管 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	取/添加特定体积的溶液/萃取
吸头 1 mL	SAINING	3014200-T	取/添加特定体积的溶液/萃取
PTFE 磁力混合	搅拌棒 LAN RAN	不适用	用于纳米材料合成工艺
氢氧化钠	Sigma Alrich	71690	用于在合成过程中调节 pH
值 不锈钢剪刀	熟食器	6034	用于切碎树皮材料
T25 组织培养瓶	NEST	707001	用于维持细胞
称量天平	拉德瓦格	AS220R2	用于称量化学品
Whatman 滤纸 No.1	Newstar	GB/T1914-2017	用于过滤合成提取物
硝酸锌	Sigma Alrich	13778-30-8	用作纳米粒子的前驱体S 合成