在此，我们介绍一种利用富含聚异戊二烯的水相提取物合成氧化锌（ZnO）纳米颗粒的实验方案 杜仲 树皮。采用划痕实验评估了合成的氧化锌纳米颗粒对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的伤口愈合潜力，该方法是一种简单、经济且高效的检测手段。
方法文章
使用杜仲（Eucommia ulmoides）树皮提取物制备锌基纳米材料及其伤口愈合潜力
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
Eucommia ulmoides 树皮的水提物是多种具有广泛健康益处的生物活性化合物的丰富来源。本方案旨在探讨利用富含聚异戊二烯的Eucommia ulmoides树皮水提物制备氧化锌（ZnO）纳米颗粒的方法。同时，该方案通过简化操作流程，关联了伤口愈合材料的制备过程。此外，采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）单层划痕实验，评估了所合成的纳米颗粒（Eu-ZnO-NPs）的伤口愈合潜力。经Eu-ZnO-NPs处理24小时后，检测了HUVEC细胞的增殖与迁移能力。研究结束时，观察到经不同浓度Eu-ZnO-NPs处理的划痕单层细胞中细胞增殖和迁移明显增强，而对照组细胞的迁移和增殖能力较差。在所选浓度中，20 µg/mL的Eu-ZnO纳米材料表现出更佳的细胞迁移效果和更强的伤口愈合潜力。
引言
药用植物及其来源的化合物已被证明具有多种健康益处1。世界卫生组织（WHO）报告指出，全球80%的人口依赖传统药用植物进行初级医疗保健。中国以其传统中医药（TCM）实践而广为人知并享有盛誉。据报道，中草药可用于治疗多种疾病，并因其生物学潜力而被广泛应用。药用植物是生物活性化合物的储存库，具有多种治疗作用。药用植物也被用于伤口治疗。目前存在多种治疗慢性伤口的方法2。最近的一项研究表明，药用植物可通过提供有利于愈合的环境、防止感染以及促进组织再生，参与伤口愈合过程3。同时，药用植物中所含生物活性化合物的抗菌和抗真菌特性有助于伤口治愈，并提高伤口愈合效率4。
基于金属的纳米材料因其生物相容性和可生物降解特性而受到广泛关注。Eucommia ulmoides（通常称为杜仲）是中国特有的植物物种，其叶片和树皮被用于传统医药实践。尤为重要的是，该植物在中国中西部省份已有广泛种植5。Peng 等人6报道，杜仲的叶、皮和雄花均可食用，并具有潜在的治疗价值。此外，E. ulmoides 是木脂素、苯丙素、环烯醚萜、黄酮类化合物、氨基酸及微量元素的优良来源。进一步研究表明，其树皮已被用于多种生物医学用途，如调节血压、降低脂肪、促进抗骨质疏松及降血糖活性7。因此，毫无疑问，E. ulmoides 树皮提取物在传统中医药中具有悠久的应用历史。早期研究指出，天然聚合物聚异戊二烯在Eucommia ulmoides树皮中含量丰富8。基于上述信息，本研究旨在利用Eucommia ulmoides树皮提取物制备纳米材料。将锌与树皮提取物结合是制备纳米材料的一种理想选择。总体而言，本研究的最终目标是开发一种用于伤口愈合的新型杂化纳米材料。
方案
注意：在制备提取物之前，将获得的树皮材料用去离子水清洗两次，并在阴凉处干燥。阴干后的树皮储存在密闭容器中。
1. 准备 杜仲 树皮提取物
- 使用剪刀将采集的杜仲（Eucommia ulmoides）树皮切成小片。
- 用重蒸水将切碎的树皮材料清洗两次。
- 在37 °C、避光条件下干燥树皮碎片24小时。
- 根据研究中所用树皮的量调整干燥时间。确保树皮完全干燥后再切碎成小片。避免阳光直射。
- 将20 g避光干燥的树皮转移至含有220 mL无菌重蒸水的锥形瓶中，在130 °C加热20分钟。
- 反应溶液的颜色变为浅黄色。溶液颜色变化在加热10分钟后出现，继续加热10分钟。根据样品量调整重蒸水的体积。
- 将含有聚异戊二烯的粗提物于4 °C保存以供后续使用。提取物中形成丝状结构表明存在聚异戊二烯。
2. 生物合成 E. ulmoides 树皮介导的ZnO纳米颗粒
- 在500 mL锥形瓶中，将1 M硝酸锌二水合物Zn(NO3)2加入50 mL去离子水中，使用磁力搅拌器持续搅拌（60 RPM）。Zn(NO3)2完全溶解约需30分钟。
- 将15 mL杜仲（E. ulmoides）树皮提取物逐滴加入20 mL 1 M硝酸锌二水合物（Zn(NO3)2）溶液中。
- 将盖好的反应混合物置于磁力搅拌器上，开启搅拌器，以60 RPM转速搅拌3小时。
- 将1 N氢氧化钠NaOH溶液（3 mL）逐滴加入反应混合物中，调节pH至9。持续加入NaOH，直至溶液变为乳白色且pH不超过9。当氧化锌纳米颗粒形成时，溶液呈现乳白色。
- 1 M硝酸锌二水合物Zn(NO3)2溶液的配制体积可根据实验需求调整。务必使用新鲜制备的树皮提取物。若pH超过10，将导致纳米颗粒聚集。
- 将合成的Eu-ZnO-NPs转移至50 mL离心管中，在4 °C条件下以100 × g离心5分钟。
注意：立即洗涤可避免杂质残留。 - 将洗涤后的Eu-ZnO-NPs收集于玻璃板上，置于热风烘箱中在45–50 °C下干燥1小时。
注意：若Eu-ZnO-NPs放置超过30分钟，可能影响纳米颗粒的理化性质
3. 使用透射电子显微镜确认尺寸
- 将纳米颗粒在双蒸水（DDH₂O）中配制成 1 mg/mL 的溶液2将Eu-ZnO-NP样品在铜网上加样5 µL，并等待其完全干燥。加样前需将样品涡旋混匀。
- 将载有Eu-ZnO-NPs的铜网置于透射电镜样品台上，分别在50倍和100倍放大倍数下采集图像。
注意：此步骤中必须使用镊子夹取载网。
4. 细胞毒性评估
- 在96孔板的每个孔中接种1 × 104个HUVEC细胞，并将其置于含5% CO2、37 °C的培养箱中培养。
- 向融合度达90%的细胞中加入10 µL不同浓度（0、10、20、30、40和50 µg/mL）的Eu-ZnO-NPs，继续培养24小时。
- 培养结束后，小心移除旧的培养基而不扰动细胞，在每孔中加入10 µL CCK-8溶液和90 µL新鲜DMEM培养基，然后置于含5% CO2、37 °C的培养箱中继续孵育。
- 使用分光光度计在450 nm波长下测定经CCK-8溶液处理的细胞的吸光度。
注意：应在15分钟内立即测定吸光度，以避免吸光度发生变化。
5. 划痕实验用 HUVEC 细胞的制备
- 在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中，于12孔培养板中接种适量（1 × 105）的HUVECs细胞，并在5% CO2、37 °C的培养箱中孵育。
- 进行划痕实验前，使用倒置显微镜检查细胞融合度。
注意：根据实验需求，可选用6孔板或12孔板进行划痕实验，不同培养板所需的细胞密度有所不同。建议使用70%-80%融合度的细胞进行划痕实验。DMEM培养基的体积根据所用培养板的不同而有所调整。例如，6孔板每孔需加入1-1.5 mL培养基，12孔板每孔需加入0.5-1.0 mL生长培养基。
- 进行划痕实验前，使用倒置显微镜检查细胞融合度。
- 使用无菌的200 µL移液枪头，在细胞单层上轻轻划出一道宽度为200 µm的划痕。
- 确保用于划痕的枪头与细胞表面充分接触。
注意：每次划痕操作均应使用新的无菌枪头。 - 吸除完全培养基，并用1 mL的1×PBS洗涤HUVECs单层，以去除脱落的细胞。
注意：确保彻底清除脱落的细胞，同时确认划痕区域未受到额外损伤。 - 为评估合成的Eu-ZnO-NPs对伤口愈合能力的影响，向各孔中分别加入含0（对照组）、10和20 µg/mL浓度的Eu-ZnO纳米颗粒的完全培养基（含10% FBS）。将实验用培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中继续培养。
注意：添加新鲜完全培养基时避免扰动细胞单层，确保孵育过程中细胞单层保持稳定。 - 在0 h和24 h时点使用倒置显微镜拍摄显微图像，并利用标注工具测量不同时间点的伤口闭合情况。
- 使用以下公式计算伤口闭合百分比：伤口闭合率（%）= [（0 h时细胞迁移距离（µm）－24 h时细胞迁移距离（µm））/ 0 h时细胞迁移距离（µm）] × 100。
结果
本研究旨在利用杜仲（Eucommia ulmoides）树皮合成纳米颗粒。将树皮材料置于阴凉环境中彻底干燥（图1）。通过在130 °C下加热样品20分钟，利用树皮材料制备热水水相粗提物。温度或时间的轻微变化均可能破坏植物化学成分，从而影响水提物的制备。制备并使用了杜仲（E. ulmoides）的水相粗提物进行纳米颗粒的合成（图2）。所制备的提取物可立即使用。若提取物储存时间过长，可能会影响合成过程。因此，建议使用新鲜制备的提取物来制备纳米颗粒。
通过出现乳白色以及pH值的变化，证实了由粗树皮提取物介导的ZnO纳米颗粒（NPs）的成功合成（图3）。pH值与纳米颗粒的尺寸密切相关，当pH值超过9时，会导致颗粒团聚且尺寸不均。通过透射电子显微镜（TEM）分析确认了所合成纳米材料的结构，结果显示合成的纳米颗粒粒径为80–90 nm，如图4所示。应逐滴加入NaOH，以防止反应混合物发生突然的pH变化。基于金属的纳米制剂具有适用性强、成本低和毒性最小的优点。然而，基于金属的纳米材料以其多种生物学功能而著称。
通过CCK-8法检测Eu-ZnO-NPs对HUVECs细胞的细胞毒性，将细胞暴露于不同浓度的Eu-ZnO-NPs中24 h。结果显示，在50 µg/mL的较高浓度下，Eu-ZnO-NPs对HUVECs细胞的细胞毒性未表现出明显变化（图5）。实验中接种了适量的细胞，并使用无菌200 µL移液枪头制造出大小一致的划痕。细胞密度过高可能导致pH值改变以及增殖速率减慢。处理组在给药24 h后观察到细胞迁移和划痕闭合现象，而对照组未见类似变化。划痕愈合实验结果表明，所合成的Eu-ZnO-NPs对HUVECs细胞系具有促进伤口愈合的特性。其中，20 µg/mL的Eu-ZnO纳米材料可促进更快的细胞迁移并增强伤口愈合能力。最重要的是，所合成的Eu-ZnO纳米颗粒表现出浓度依赖性的作用模式。此外，在处理24 h后，划痕单层细胞中观察到明显的细胞增殖与迁移，而对照组细胞的迁移和增殖能力较差（图6）。24 h后，对照组的划痕闭合率约为16%，10 µg/mL处理组为51%，20 µg/mL处理组则达到81.5%（图7）。
图1：Eucommia ulmoides 树皮样品的采集。用于制备水提物的Eucommia ulmoides树皮照片。提取前，树皮应彻底清洗以去除杂质，并在阴凉处完全干燥。请点击此处查看该图的放大版本。
图2制备 杜仲 树皮提取物 图片 杜仲 用于合成纳米颗粒的树皮提取物。该 杜仲 使用20克树皮碎片制备了200 mL的树皮提取物。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：Eucommia ulmoides 树皮介导合成ZnO纳米颗粒。 图像显示了Eu-ZnO纳米颗粒的形成，呈乳白色溶液表明Eu-ZnO纳米颗粒已成功生成。请点击此处查看该图的放大版本。
图4透射电子显微镜分析： 图像显示了不同放大倍数下的视野 杜仲 树皮介导的ZnO纳米颗粒（A) 100 nm 放大倍数和 (B50 nm 放大倍数。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图5：CCK-8细胞活力检测。柱状图表示细胞经0-50 µg/mL不同浓度处理后的活力，未处理的细胞作为阴性对照。数据表示均值及标准差。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：划痕实验用于评估伤口闭合情况。细胞经合成的EU-ZnO NPs（10 µg/mL和20 µg/mL）处理，并设置未添加EU-ZnO NPs的对照组，孵育24小时。在经EU-ZnO NPs处理的细胞中观察到细胞增殖和迁移现象。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：伤口闭合百分比。 柱状图显示了在0小时和24小时时，经EU-ZnO NP处理与未处理的HUVEC单层细胞上的伤口闭合百分比。数据表示均值和标准差。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
E. ulmoides 的树皮、种子和叶片被认为具有多种健康益处。我们的结果表明，采用一种简单且成本效益高的方法成功合成了 EU-ZnO 纳米颗粒。该纳米颗粒的合成使用了水提物。将树皮材料在高温下加热可能导致某些植物化学成分降解，并降低提取效率。水提物中存在的植物化学成分可将金属离子还原，从而形成纳米颗粒。硝酸锌二水合物因其良好的生物相容性和高度稳定性，被用于制备 ZnO 纳米颗粒9。使用从最低到高毒性的金属元素来合成或设计纳米材料存在风险，不能用于生物医学用途的声明。该合成过程可在一天内（24 小时）完成。然而，无毒金属和生物相容性材料被认为是安全的，可用于评估伤口愈合效率。所合成纳米颗粒发生团聚的主要原因是植物化学键的作用。纳米颗粒的团聚是由于范德华相互作用的吸引力以及颗粒表面之间的吸引力所致10,11。纳米颗粒的团聚可能影响其物理和光学性质。通过煅烧和退火处理可调节纳米颗粒的尺寸和形貌12。将纳米材料重新悬浮于去离子水中并进行超声处理，有助于避免纳米颗粒的团聚。水提物中存在的生物活性化合物或功能基团可能参与了还原过程。纳米颗粒的产率完全取决于合成过程中所用反应混合物的体积。大规模合成纳米颗粒存在若干限制，包括团聚现象和颗粒尺寸不均一等问题。
与我们的研究结果类似，Aydin Acar 等人13报道，由金盏花（Calendula officinalis）花提取物介导合成的氧化锌纳米颗粒在 L929 细胞上表现出伤口愈合特性，伤口闭合率达到 69.1%。此外，由疣苞决明（Crotalaria verrucosa）叶片介导合成的氧化锌纳米颗粒在 5 µg/mL 浓度下对 HeLa 细胞系显示出伤口愈合潜力，伤口闭合率为 40.45%14。Zhang 等人15报道，利用大戟（Euphorbia fischeriana）合成的氧化锌纳米颗粒在 10 和 15 µg/mL 浓度下表现出显著的伤口愈合特性。这些研究已证实，所合成的纳米制剂可作为伤口愈合剂使用。这些研究结果表明，在治疗组中，所合成的化合物能够修复伤口并促进再上皮化过程。
止血和细胞迁移被认为是伤口愈合过程中的重要环节。通过移液器吸头在HUVECs单层细胞上制造划痕，以模拟人工伤口。然而，制造宽度一致的伤口具有较高的技术难度且操作复杂。另一方面，该方法成本较低。在本实验中观察到，与对照组相比，所设计的纳米颗粒在10–20 µg/mL浓度下对HUVECs表现出优异的促伤口愈合性能。此外，合成的Eu-ZnO-NPs具备修复细胞单层上所造成伤口的潜力，且未引起任何毒性效应。这些in vitro实验结果可为后续利用动物模型评估合成的聚合物基纳米材料的有效性提供依据。
披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
作者谨此衷心感谢中国长沙中南大学细胞生物学系提供的仪器设备支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12 孔板 | NEST | 703011 | 用于细胞培养和检测 |
| 离心机 | SCILOGEX | SC1406 | 用于从胶体混合物中分离纳米颗粒 |
| 离心管 – 15 mL | BIOFIL | CFT-312150 | 用于离心合成溶液 |
| 离心管 – 5 mL | Biosharp | BS-50-CM-S | 用于储存纳米颗粒 |
| CO2 培养箱 | Thermo scientific | 3010 | 用于培养 HUVEC 细胞 |
| 去离子水 | Millipore | 不适用 | 用于提取物的制备 |
| DMEM 培养基 | Cytiva | SH30243.01 | 用于细胞培养操作 |
| 漏斗 | Thermo scientific | 42600060 | 在过滤过程中用于固定滤纸 |
| 玻璃烧杯 | 硼硅酸盐 | 1102-50 | 用于制备水提物 |
| 鼓风干燥箱 | Genetimes | 不适用 | 用于干燥纳米颗粒并以粉末形式收集 |
| 磁力搅拌器 | KYLIN-BELL | GL-5250-A | 用于纳米颗粒的合成 |
| 显微镜 | Nikon Eclipse | Ts2 | 用于拍摄显微照片 |
| 培养皿 | NEST | 753001 | 用于收集纳米颗粒 |
| 1 mL 移液器 | Lab Science | YEA17AD0055580 | 用于吸取/添加特定体积的溶液/提取物 |
| 1 mL 移液器吸头 | SAINING | 3014200-T | 用于吸取/添加特定体积的溶液/提取物 |
| PTFE 磁力搅拌子 | LAN RAN | 不适用 | 用于纳米材料的合成过程 |
| 氢氧化钠 | Sigma Alrich | 71690 | 用于在合成过程中调节 pH |
| 不锈钢剪刀 | Deli | 6034 | 用于切割树皮材料 |
| T25 细胞培养瓶 | NEST | 707001 | 用于维持细胞生长 |
| 电子天平 | Radwag | AS220R2 | 用于称量化学试剂 |
| Whatman 滤纸 No.1 | Newstar | GB/T1914-2017 | 用于过滤提取物以进行合成 |
| 硝酸锌 | Sigma Alrich | 13778-30-8 | 作为纳米颗粒合成的前驱体’ |
参考文献
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重印与许可
