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方法文章

从传统中药中提取与表征黄酮类化合物芦丁 槐米

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DOI：

10.3791/67417

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2025年10月31日

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1School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

传统中医药（TCM）蕴含丰富的天然治疗手段，在满足全球多样化的健康需求方面发挥着重要作用。本研究对Flos sophorae immaturus的主要活性成分芦丁的提取、分离及其理化性质进行了系统的实验探究。

摘要

传统中医（TCM）长期以来作为天然治疗方案的重要资源库，在满足全球多样化的医疗需求方面发挥着关键作用。在众多用于传统中医的草药中，Sophora flavescens 因其广泛的药用特性而著称。其应用历史可追溯数百年，至今仍在现代医学中备受重视，尤其在治疗心血管疾病方面具有显著的治疗价值。芦丁是一种广泛分布于植物界的生物活性黄酮类化合物，在 Flos sophorae immaturus 中含量最高。研究表明，芦丁可降低毛细血管的异常通透性和脆性，并对心脑血管系统具有保护作用。本研究提供了一套从 Flos sophorae immaturus 中提取、分离及表征芦丁理化性质的详细实验方案。此外，还介绍并描述了采用碱提酸沉法从中草药中提取黄酮类化合物的实验流程。

引言

Flos sophorae immaturus（FSI）是槐树（Sophora japonica L.）的干燥花蕾，在传统中医（TCM）中已有数百年的应用历史。其主要活性成分包括芦丁、异槲皮苷、Sophorae Flos 以及其他黄酮类和皂苷类化合物。这些成分共同赋予其多种药理作用，如清热解毒、凉血止血以及降血压。在临床实践中，FSI 主要因其保护毛细血管通透性1、维持心血管系统功能2、凉血、止血及调节肝火3的作用而受到重视。其治疗功效主要归因于高含量的芦丁（槲皮素-3-芸香糖苷），这是一种生物活性黄酮类化合物，可占其干重的 20%–30%4。

芦丁是一种广泛分布于植物中的黄酮类化合物。其化学名称为槲皮素-3-O-芸香糖苷（C27H30O16）（图1）。在室温下，芦丁呈淡黄色至黄绿色结晶性粉末。其熔点随晶型和纯度不同而变化，通常在125 °C至195 °C之间。芦丁具有明显的极性特征：微溶于冷水，易溶于乙醇和甲醇等极性有机溶剂，几乎不溶于乙醚和氯仿等非极性溶剂。此外，其溶解度受pH影响，在碱性条件下因酚羟基解离形成钠盐或钾盐而显著增加。这些物理性质与其分子结构中的多羟基和糖苷基团密切相关5，直接影响其在医药、食品及其他工业中的提取工艺和应用6。芦丁在植物中普遍存在，但在FSI中含量最高，具有多种药理活性，包括稳定毛细血管7、抗炎、抗氧化8、抗菌9以及代谢调节作用10。

尽管芦丁具有临床应用潜力11，但其水溶性差和稳定性低为提取和制剂带来了挑战5。为克服这些局限性，碱提酸沉法（AEAP）已成为一种有效的替代方法，该方法利用芦丁酚羟基的pH依赖性行为实现提取。

根据芦丁的物理性质，碱提酸沉法（AEAP）已成为从槐米（FSI）中分离芦丁的标准技术，该方法利用芦丁在碱性溶液中的溶解性及其在酸性条件下结晶析出的特性12。AEAP通过调控酚羟基的pH依赖性电离状态，提高提取产率并实现高纯度芦丁的分离。在碱性条件（pH >10）下，酚羟基发生去质子化，形成亲水性的-O-离子，从而使芦丁完全溶出植物组织，同时减少氧化降解。当pH降低至2–3时，该电离过程被逆转，目标酚类化合物选择性沉淀析出，而极性杂质共沉淀较少。作为一种具有pH依赖性溶解度的多酚类物质，芦丁在碱性溶液（如氢氧化钠）中易溶，而在酸性条件下因羟基质子化而沉淀析出。AEAP方法成本低、可放大且环境友好，符合绿色化学原则，避免了有毒溶剂的使用13。这也反映了天然产物化学领域日益倾向于采用基于pH调控的分离技术这一总体趋势14。类似的方法也用于姜黄素（来自姜黄）和小檗碱（来自Coptis chinensis）的提取，均利用特定pH值下溶解度的变化实现选择性分离。AEAP特别适用于从富含黄酮类化合物的原料（如FSI）中高效制备芦丁，仅需常规实验设备（如pH计、离心机）。对于芦丁含量较低或存在复杂干扰成分的植物基质，未来可考虑采用酶解预处理以进一步提高提取效率。

综上所述，AEAP 是一种便捷的芦丁提取方法，在提取效率、安全性和可扩展性之间实现了平衡。该方法在中医药现代化中的作用凸显了其连接传统实践与现代药品标准的潜力。

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方案

芦丁是一种含有多个酚羟基的黄酮类化合物，可溶于热的碱性溶液，经酸化后沉淀析出。可采用碱提酸沉法进行提取。本研究中使用的试剂和仪器列于材料表中。

1. 实验准备

  1. 准备以下材料：槐米（20 g）、硼砂（0.8 g）、若干烧杯、石灰粉（1.5 g）、浓盐酸、温度计和pH试纸。参见图2以查看该图像的放大版本。

2. 芦丁的提取

注意：使用 0.8 g 硼砂与 200 mL 水的配比。使用 1.5 g 生石灰粉末与 10 mL 水配制石灰乳。快速而准确地调节 pH 值。根据需要补充损失的水。

  1. 碱提法提取
    注意：使用6 cm圆形滤纸进行过滤。
    1. 在500 mL烧杯中加入250 mL水和0.8 g硼砂，加热至沸腾，然后加入20 g Flos sophorae immaturus，继续煮沸2-3 min。
    2. 煮沸后，在搅拌下用石灰乳调节pH至8-9，继续加热20 min。趁热用纱布过滤，得到黄棕色滤液。
  2. 酸沉法提取
    1. 用浓盐酸将提取液调节至pH 2-3，静置。若溶液由澄清的黄棕色变为浑浊，并在容器底部逐渐形成橙黄色絮状沉淀，则表明芦丁已有效析出。
    2. 静置6 h后，对沉淀进行常压抽滤，收集沉淀并干燥，得到粗品芦丁。
      注意：根据所用布氏漏斗尺寸（直径150 mm）裁剪滤膜。
    3. 在常压抽滤过程中用水洗涤沉淀至中性。

3. 芦丁的提纯

  1. 粗略称量后，按1:200的溶解度比例使用热水对芦丁进行重结晶。将水溶液煮沸30分钟，并趁热过滤。确保芦丁溶液的最终体积为210 mL。
  2. 滤除残渣。让滤液静置不动，然后再次过滤，并在60–70 °C的烘箱中真空干燥，得到精制芦丁（图3）。
    注意：根据所用布氏漏斗的尺寸（直径150 mm）裁剪滤膜。

4. 芦丁的理化鉴定

  1. 盐酸-镁粉反应——黄酮类母核的鉴定
    1. 取1-2 mL样品溶于甲醇中，加入50 mg镁粉。
    2. 加入数滴浓盐酸，轻轻振荡。溶液应变为红色（图4）。
  2. Molisch反应——糖类化合物的鉴定
    1. 加入10% α-萘酚乙醇溶液，振荡混匀。将试管倾斜，沿管壁缓慢滴加浓硫酸。
    2. 观察两相界面处是否形成棕色环（图5）。
  3. 锆-柠檬酸显色反应
    1. 向样品的乙醇溶液中加入1-2 mL 10% α-萘酚溶液，充分振荡。沿试管壁缓慢加入10滴浓H2SO4，期间不振荡。
    2. 加入2%柠檬酸甲醇溶液，溶液颜色应变浅（图6）。
  4. 薄层色谱鉴别
    1. 同时使用精制芦丁和芦丁标准品。
    2. 以氯仿:甲醇:甲酸（15:5:1）为展开剂，1% AlCl3乙醇溶液为显色剂，在365 nm紫外灯下观察荧光。

5. 芦丁的薄层色谱检测

注意：采用薄层色谱法（TLC）检测芦丁的纯度。固定相为硅胶板。

  1. 将提纯的芦丁样品和芦丁标准品（甲醇中浓度为1 mg/mL）点样于薄层板上。使用乙酸乙酯:甲酸:水（8:1:1, v/v/v）作为流动相展开薄层板。
  2. 展开后，将薄层板在254 nm紫外光下观察显色。
  3. 计算样品斑点的比移值（Rf），并与标准品进行比较。
    注意：在该条件下，若仅出现一个与标准品Rf值相同（约为0.35–0.50）的斑点，则表明样品纯度较高；若出现额外斑点，则提示存在杂质。

6. 采用高效液相色谱法测定芦丁纯度

注意：芦丁的纯度采用高效液相色谱法（HPLC）进行定量分析。分析条件如下：色谱柱-（250 mm × 4.6 mm，5 µm）；流动相-乙腈（A）和0.2%乙酸水溶液（B）。线性梯度洗脱程序：0–15 分钟，20%–30% A；15–30 分钟，30%–60% A。流速-1 mL/min。进样量-10 µL。检测波长-355 nm。柱温-40 °C。

  1. 准确称取0.1 g芦丁样品粉末，转移至10 mL离心管中，加入5.0 mL 60%乙醇溶液，充分振荡混匀。
  2. 将恒温水浴或柱温箱设置为30 °C，对样品进行超声处理30分钟。
  3. 在室温下以55,900 × g 离心10分钟，取上清液作为HPLC分析用待测溶液。

7. 采用液相色谱-质谱法测定芦丁

注意：分离得到的化合物通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）进行鉴定。液相色谱条件与高效液相色谱（HPLC）方法一致。质谱分析采用电喷雾电离（ESI）负离子模式，毛细管电压为 3.5 kV。去溶剂化温度：350 °C；质谱扫描范围：m/z 100–1000。

  1. 称取10 mg纯化的芦丁样品，转移至2 mL微量离心管中。用移液器加入0.6 mL氘代DMSO，直至样品完全溶解。采用相同步骤制备芦丁标准溶液。
  2. 采用质子核磁共振（1H NMR）波谱法分析处理后的样品和标准品。
  3. 使用兼容软件处理谱图数据15。
  4. 将谱图数据与文献或数据库参考值（如NIST或PubChem）进行比对以验证结果。

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结果

在芦丁的理化鉴定实验中，加入镁粉和少量浓盐酸后振荡，溶液变为红色，表明分子结构中存在黄酮母核。在莫利施反应中，两液界面处形成紫色环，结果呈阳性，表明分子结构中含有糖基。样品溶液加入甲醇中的2%氯化氧化试剂后变为亮黄色，提示存在含3-OH或5-OH基团的黄酮结构。随后加入甲醇中的2%柠檬酸溶液，溶液颜色变浅，表明仅存在5-OH基团。

在比较芦丁样品与芦丁标准品的薄层色谱实验中，标准品显示出特定的斑点位置和特征性颜色16色谱图比较显示，样品中斑点的数量和位置与标准品高度一致，表明所提取的芦丁纯度较高 通过 碱提酸沉法17.

薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）以及液相色谱-质谱/核磁共振（LC-MS/NMR）的联用建立了一套针对芦丁的综合性分析体系，涵盖了从初步筛选到精确定性分析的全过程。TLC可快速评估样品纯度，HPLC则用于定量确认高纯度，而LC-MS和NMR通过分子量、碎片离子模式及精细结构特征的多维度分...

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讨论

芦丁的提取主要基于碱提酸沉法（AEAP）6，该方法具有设备要求简单、操作方便、效率高和成本低的优点。该技术常辅以微波辅助提取（MAE）7和超声波辅助提取（UAE）8，可减少试剂消耗、缩短提取时间并提高总收率。

研究表明，pH值显著影响固体提取率以及沉淀物中槲皮素的含量。因此，精确控制碱液浓度和提取时间对于最大化芦丁产率至关重要。过量的碱会溶解不需要的化合物，从而影响提取物的纯度18。同样，沉淀过程中所用酸的种类和浓度对结果也起着关键作用；适当的酸度可确保芦丁完全沉淀，而过度酸化则可能导致其分解19。重结晶过程中使用沸水是基于芦丁在热水与冷水中的溶解度差异，从而通过选择性结晶实现进一步纯化。

尽管AEAP法具有高效且经济的优点，但它对环境污染物较为敏感，需要反复清洗并延长处理时间以保持产品质量...

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披露

本文作者特此声明，在开展本研究及撰写本文过程中，已披露所有可能产生的利益冲突。我们确认，不存在任何可能影响本研究结果或结论解释的财务、个人或专业关系。具体而言，我们与任何可能从本文报告的研究发现中获益的制药公司、研究机构或其他实体均无关联。最后，我们申明，本研究的发现和结论完全基于本文所呈现的数据和分析，未受到任何外部因素的影响。我们始终致力于在所有研究活动中坚持最高标准的学术诚信和伦理规范。

致谢

我们谨向北京中医药大学药物化学实验室致以诚挚的谢意，感谢他们为本研究提供了实验平台。他们的支持与资源对开展科研工作和实验具有不可估量的价值。我们深切感谢他们对科学卓越的执着追求，以及致力于培养青年研究人员的坚定承诺。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-萘酚MACKLINC16245764
乙酸MACKLINC12662811
乙腈MACKLINC16129374
氯化铝MACKLINC16485922
柠檬酸MACKLINC16429480
DMSOFUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD20230306
乙醇FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD20250102
乙酸乙酯FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD20240318
Flos sophorae immaturus北京同仁堂10092026329782
甲酸FUCHEN (Tianjin) Chemical Reagent Co., LTD20150402
‌MestReNovaMestrelab Research/
甲醇 innochemC16365684
硅胶 60F254STEEMA20210222
XcaliburThermo Fisher Scientific/
八水合氯氧化锆MACKLINC15350627

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