需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

原发性干燥综合征合并肺腺癌：探讨潜在共同致病机制及实验验证

1.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67421

⸱

2024年9月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Oncology Department, Wangjing Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3The Second Department of Healthcare, China-Japan Friendship Hospital, 4Rheumatology Department, Shangqiu Hospital of Traditional Chinese Medicine

本文内容

摘要

本文描述了通过生物信息学分析和实验验证探究原发性干燥综合征与肺腺癌潜在共同致病机制的操作步骤及注意事项。

摘要

本研究旨在通过生物信息学分析及实验验证，探讨原发性干燥综合征（pSS）与肺腺癌（LUAD）之间潜在的共同致病机制。从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）和Genecard数据库中获取与pSS和LUAD相关的基因，并筛选出pSS与LUAD共有的差异表达基因（DEGs），即pSS-LUAD-DEGs。通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）富集分析，阐明pSS-LUAD-DEGs所涉及的重要生物学功能。通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络识别核心靶点，并进一步通过受试者工作特征（ROC）曲线分析评估枢纽基因的诊断准确性。在本研究中，NOD/Ltj小鼠作为pSS动物模型，接受细颗粒物2.5（PM2.5）刺激以诱导炎症反应。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质印迹法（western blotting）进行相关分子生物学实验验证。KEGG与GO富集分析结果表明，炎症在连接pSS与LUAD中发挥关键作用。IL6、CCNA2、JAK2、IL1B、ASPM、CCNB2、NUSAP1和CEP55被确定为pSS-LUAD的关键靶点。BALB/c小鼠和NOD/Ltj小鼠在连续21天接受PM2.5刺激后，肺组织中炎症因子IL-6和IL-1β的表达增强，激活JAK2/STAT3信号通路，并上调肿瘤相关基因CCNA2、CCNB2和CEP55的表达水平，其中NOD/Ltj小鼠的变化较BALB/c小鼠更为显著。该实验方案表明，肺部炎症微环境诱导的癌变可能是pSS患者肺腺癌高发的关键原因。此外，阻断相关机制可能有助于预防pSS患者中LUAD的发生。

引言

原发性干燥综合征（pSS）是一种自身免疫性疾病，其特征是外分泌腺的淋巴细胞浸润，导致干眼（xerophthalmia）和口干（xerostomia）等临床症状1,2。pSS通常还伴有腺体外受累表现，包括高球蛋白血症3、间质性肺病4、肾小管性酸中毒5、神经损伤6和血小板减少症7，这些是主要的不良预后因素。近年来，一系列研究表明，pSS通常伴随癌症发病率升高，包括血液系统恶性肿瘤和实体瘤8,9,10。肺癌是pSS相关癌症中最常见的类型之一，尤其是肺腺癌（LUAD）11。

综上所述，进一步研究表明，原发性干燥综合征（pSS）与肺腺癌（LUAD）之间可能存在某些共同的潜在发病机制。据我们所知，目前尚无专门研究阐明这两种疾病之间的共同机制。近年来，生物信息学分析为我们揭示跨物种间潜在共病机制提供了新的可能性12,13,14。为了进一步揭示其潜在机制，本研究采用生物信息学分析方法，对pSS与LUAD之间的共同靶点及信号通路进行分析，并随后构建动物模型以进行实验验证。阐明这些机制可能为临床上对pSS患者肺腺癌的预防提供证据支持。

本研究利用 GEO 和 Genecard 数据库检索与 pSS 和 LUAD 相关的基因。随后筛选出与 pSS 和 LUAD 相关的差异表达基因（pSS-LUAD-DEGs）。我们进行了 KEGG 和 GO 富集分析，以阐明 pSS-LUAD-DEGs 的重要生物学功能。通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以识别核心靶点，并进一步通过 ROC 曲线分析评估枢纽基因的诊断准确性。采用 NOD/Ltj 小鼠作为 pSS 动物模型，以细颗粒物 2.5（PM2.5）刺激诱导炎症反应。通过 qPCR、ELISA 和蛋白质印迹实验对研究结果进行验证。总体而言，本研究结果表明，由肺部炎症微环境诱导的癌变可能是 pSS 患者中 LUAD 高发病率的关键原因。同时也提示，通过阻断相关机制可能预防 pSS 患者中 LUAD 的发生。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

实验动物饲养于中日友好医院的动物实验中心，饲养条件符合中国国家标准《实验动物 环境及设施要求》（GB14925-2010）规定的动物饲养环境。所有动物护理程序和实验均遵循ARRIVE指南，并基于3R原则（减少、替代、优化），遵守中国国家动物福利法规的相关规定。BALB/c小鼠购自SPF（北京）生物技术有限公司，NOD/Ltj小鼠购自华阜康（北京）生物技术有限公司。

1. 生物信息学分析

  1. 数据集的制备
    1. 打开基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）15，并使用 原发性干燥综合征 和 肺腺癌 作为关键词搜索基因表达谱。然后点击 GEO DataSets 数据库中的结果并选择 Homo sapiens 在 主要生物体选择并下载感兴趣的数据库集及其相应的平台信息。
    2. 打开 Genecard 数据库（https://www.genecards.org/）16，并使用 p原发性干燥综合征 和 肺腺癌 作为关键词获取pSS和LUAD的基因。下载疾病基因的电子表格。
  2. pSS与LUAD之间共有差异表达基因的鉴定
    1. 下载并打开 R 软件（https://cran.r-project.org/）​17. 在R软件中安装GEOquery R包、stringr R包、ggplot2 R包、reshape2 R包和limma R包。 
    2. 使用 R 软件在不同的 GEO 数据集（GSE84844、GSE51092、GSE32863 和 GSE75037）中识别并可视化差异表达基因（DEGs），随后比较和分析这些数据集中基因的表达情况。筛选标准为调整后 P 值小于 0.05 且 |log2 fold change| > 1 的基因。 < 0.05 和倍数变化（流式细胞术) > 1.2 或 < 0.83 作为差异表达基因（DEGs）。
    3. 从Genecard数据库中筛选与pSS和LUAD相关且表达水平大于或等于20的基因。
    4. 合并来自 GEO 数据库和 Genecard 数据库的与 pSS 相关的差异表达基因（DEGs）以及与 LUAD 相关的差异表达基因（DEGs）。
    5. 在 R 中安装并加载 VennDiagram 包，以获取并可视化与 pSS 和 LUAD 相关的差异表达基因（pSS-LUAD-DEGs）。
  3. 京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析
    1. 进入 Metascape（https://metascape.org/）18. 点击 选择文件 并上传 pSS-LUAD-DEGs 的 .xlsx 格式文件。选择 H. sapiens 在 输入为物种。同样，选择 H. sapiens 在 物种分析.
    2. 点击 定制分析. 点击 富集 并选择 KEGG 通路. 点击 富集分析，然后单击 分析报告页面 当富集分析完成后。
    3. 点击 全部内容打包为一个压缩文件 下载结果。访问 _ FINAL_GO.csv 下载文件 富集_GO 文件夹以查看结果。
    4. 使用 ggplot2 包在 R 中执行 KEGG 可视化程序。
  4. 基因本体（GO）富集分析
    1. 在 R 中安装并加载 clusterProfiler 和 enrichplot 软件包。
    2. 将pSS-LUAD-DEGs的文本格式列表导入R。
    3. 运行 clusterProfiler 和 enrichplot 软件包进行 GO 富集分析及结果可视化。将分析中的统计学显著性定义为校正后 P 值小于 0.05 < 0.05.
  5. 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建与模块分析
    1. 进入相互作用基因检索数据库（STRING）（http://string-db.org/）19. 点击 浏览 并上传 pSS-LUAD-DEGs 文件。选择 智人 在 生物体，然后点击 搜索.
    2. 点击 继续结果可用后，点击 设置. 在……之下 基本设置 > 最低必需相互作用评分，选择 高置信度（0.700）蜱虫 隐藏断开连接的节点 在 网络 在 高级设置，然后点击 更新.
    3. 点击 输出 在标题栏中下载以 TSV 格式保存的 PPI 相互作用关系文本。
    4. 下载并启动 Cytoscape 3.7.1 软件（https://cytoscape.org/）20. 点击  文件 > 导入 > 从文件导入网络 导入TSV格式文件以构建蛋白质相互作用网络。
    5. 使用 网络分析仪 用于分析网络中的拓扑参数。通过左侧控制面板中的样式栏优化节点大小和颜色。
    6. 在菜单栏中，选择 工具 > 分析网络. 在 表格 面板，单击 学位 按度值降序排列各组分，选取度值最高的前20个基因为枢纽基因。
    7. 在 R 中安装并加载 igraph 和 ggplot2 软件包，以根据度值可视化枢纽基因。
  6. 枢纽基因的鉴定与验证
    1. 在 R 中安装并加载 pROC 软件包。
    2. 将枢纽基因的文本格式列表导入 R。
    3. 绘制枢纽基因的受试者工作特征（ROC）曲线，并计算ROC曲线下面积（AUC）值。
      注意：请参阅 补充编码文件 1 用于筛选差异表达基因的 R 代码。

2. 实验验证

注意：有关本实验方案中所用材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。

  1. 动物准备
    1. 将12只9周龄雌性BALB/c小鼠和12只9周龄雌性NOD/Ltj小鼠进行适应性饲养1周。
    2. 使用随机数字表将12只九周龄雌性BALB/c小鼠均匀分配至空白对照组和PM2.5组。同样，将12只九周龄雌性NOD/Ltj小鼠均匀分为pSS组和pSS-PM2.5组。
  2. 细颗粒物2.5（PM2.5）悬浮液的制备
    注意：PM2.5 可在小鼠模型中诱导炎症相关肺腺癌的发生与发展21BALB/c小鼠和NOD/Ltj小鼠通过PM2.5诱导产生炎症相关改变。根据Piao等描述的方法进行。22，PM2.5悬浮液的浓度配制为1 mg/mL。
    1. 称取PM2.5石英纤维膜，将其剪成2 cm × 2 cm的小片，浸入盛有适量去离子水的烧杯中。
    2. 将烧杯密封后，置于水浴超声仪中，在37 °C下超声处理30分钟。重复此过程3次，直至颗粒完全溶解。
    3. 将烧杯中的液体通过16层无菌医用纱布过滤，然后挤出纱布中残留的液体。
    4. 将滤液置于平底容器中，在-20 °C冰箱中冷冻成冰块。随后使用冷冻干燥仪（−52 °C，0.1 mbar，48 h）对滤液冰块进行干燥，并收集所得粉末状颗粒。
    5. 将粉末颗粒充分溶解于生理盐水中，配制浓度为1 mg/mL的PM2.5悬浮液。将PM2.5悬浮液倒入玻璃瓶中，置于高压灭菌器中，采用高温高压条件（121°C、15 psi，维持15分钟）进行灭菌。
    6. 进行超声波震荡处理（200 W，震荡10秒，暂停10秒，重复3个循环）。处理后置于4 °C冰箱中保存，以备后续使用。
  3. PM2.5小鼠模型的建立
    注意：PM2.5组和pSS-PM2.5组每3天通过气管滴注给予PM2.5悬液一次，共持续28天，每次剂量为0.1 mL；空白对照组和pSS组每3天通过气管滴注给予生理盐水一次，共持续28天，每次剂量为0.1 mL。
    1. 向小鼠注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合溶液。通过夹趾无反应及全身肌肉完全松弛确认小鼠达到手术麻醉深度。在整个操作过程中持续监测反射、呼吸及整体反应，确保麻醉深度充分并维持至所有步骤完成。
    2. 将小鼠置于小动物固定器上，腹部朝上，头部抬高，尾部降低呈45°角。用细线绕过小鼠上切牙并向上牵拉，将线固定在动物固定装置的螺钉上，确保充分暴露小鼠口腔腔隙。
    3. 打开冷光源灯，将光线照射到小鼠颈部皮肤上。用镊子拉出小鼠舌头，充分暴露声门。观察小鼠口腔内反复开合的光点，该光点即为小鼠气道开口的位置。
    4. 将18 G静脉留置针插入小鼠气管，抽出针芯，将棉线置于静脉留置针外端，观察棉线随小鼠胸廓运动而移动，以确认操作成功。
    5. 先用1 mL注射器抽取0.2 mL空气，然后抽取0.1 mL PM2.5悬浮液，再抽取0.2 mL空气。通过18 G静脉留置针将混合物注入气管。
    6. 拔出18 G静脉留置针。将动物固定器直立并顺时针和逆时针旋转各30次，使PM2.5悬浮液在小鼠肺内均匀分布。然后伸直小鼠颈部，将其侧卧放置，以防窒息。
  4. 样本采集
    注意：在第29天采集样本th 实验当天用于后续分子生物学分析。
    1. 检查安乐死系统的连接，打开控制器电源。打开二氧化碳（CO₂）气瓶阀门。2气瓶阀门
      注意：在将动物放入安乐死装置前，切勿预先填充试剂。
    2. 将小鼠放入舱室并通入 CO2 每分钟通气量为腔室体积的30%–70%。将小鼠暴露于CO2 5分钟，确保其不动、无呼吸且瞳孔散大。关闭CO₂2 关闭气瓶阀门，继续观察5分钟以确认死亡。
    3. 将安乐死的小鼠仰卧置于干净的解剖板上。暴露气管、心脏和肺。
    4. 使用剪刀和镊子去除覆盖胸腹部及颈部区域的皮肤和肌肉。用剪刀和镊子沿胸腔两侧肋骨边缘进行剪切，以暴露含有心脏和肺的胸腔。随后剪断锁骨，以形成足够大的开口，便于充分检查左肺和右肺的各个肺叶。
    5. 切除从胸骨和肋骨延伸至下颌的颈部肌肉。将剪刀插入肋骨前缘下方，沿两侧剪开，以去除覆盖气管的骨性部分。
    6. 用镊子夹住靠近下颌的气管，将剪刀置于镊子上方，进行完全的横向切口。
    7. 用镊子轻轻提起气管，用剪刀剪断腹侧的组织连接，直至将整个胸部组织从体内移除。
    8. 将肺组织平放在工作台上，用生理盐水冲洗表面残留物，滤纸吸干后分装至冻存管中，于 -80 °C 保存。
  5. 定量实时聚合酶链式反应（qPCR）
    1. 使用含有液氮的研钵将肺组织研磨成粉末。
    2. 使用精密天平称取20 mg研磨组织，加入750 µL Buffer RL至离心管中，用涡旋振荡器充分混匀，室温（RT）静置3 min。随后在14,000 x g 室温下孵育5分钟，收集上清液。
    3. 将基因组DNA（gDNA）过滤小柱放入2 mL收集管中。将上清液转移至gDNA过滤小柱中，于14,000 x g离心 g 室温下持续2分钟。
    4. 弃去gDNA过滤小柱。向滤液中加入等体积的70%乙醇，用移液器上下吹打5次混匀。
    5. 将RNA小柱放入2 mL收集管中。将750 µL混合液转移至RNA小柱中，于12,000 x g离心 g 室温下孵育1分钟。
    6. 弃去滤液，将RNA小柱重新放回2 mL收集管中。向RNA小柱中加入500 µL RW1缓冲液，于12,000 x g 室温下孵育1分钟。
    7. 弃去滤液，将RNA小柱重新放回2 mL收集管中。向RNA小柱中加入500 µL Buffer RW2。在12,000 x g 室温下孵育1分钟。重复此步骤一次。
    8. 弃去滤液，将RNA小柱重新放回2 mL收集管中。在12,000 x g 室温下持续 2 分钟。
    9. 将RNA小柱转移至1.5 mL离心管中，向柱膜中心加入100 µL无RNase的水，在室温下孵育2 min。随后在12,000 x g 室温孵育1分钟。弃去RNA小柱，将RNA溶液于-80 °C保存。
    10. 取2 µL RNA溶液，按照仪器说明书使用NanoDrop分光光度计测定其浓度和质量。
      注意：本研究选用RNA的260/280和260/230比值进行质量控制。
    11. 在微量离心管中依次加入以下组分以配制 RNA 溶液：1 µg 总 RNA、4 µL MgCl₂2 （25 mM）、2 µL 反转录 10x 缓冲液、2 µL dNTP 混合物（10 mM）、0.5 µL 重组核糖核酸酶抑制剂、15 单位反转录酶、0.5 µg 寡聚(dT)15 引物，并用无核酸酶水定容至20 µL。轻轻混匀管内液体，使所有液体汇集于管底。
      注意：必须配制混合溶液，以确保 cDNA 合成和 RNA 定量结果更加一致。
    12. 将20 µL RNA溶液在42 °C孵育15分钟进行逆转录生成cDNA，随后在95 °C变性5分钟，冷却至4 °C，然后于-20 °C保存。
    13. 将 6.4 µL 去离子水、10 µL SYBR Green 实时 PCR 预混液、2 µL 所得 cDNA 溶液、0.8 µL 正向引物（10 µM）和 0.8 µL 反向引物（10 µM）混合并充分混匀表1) 以配制反应体系。
    14. 在PCR仪器上运行反应，以获取目的基因和参考基因的循环阈值（CT）值。
      1. 每个PCR循环开始时，先在95 °C下初始变性60 s。
      2. 在PCR循环中，95 °C变性15秒，60 °C退火15秒，72 °C延伸45秒，并在延伸步骤中收集数据。共进行40个PCR循环。
      3. PCR循环结束后，使用PCR仪器自动进行熔解曲线分析。
        注意：如果熔解曲线显示双峰或不规则峰形，则表明实验可能存在异常。
    15. 使用2−ΔΔCt法确定每个目标基因的相对表达水平-ΔΔCT 方法，随后进行进一步的统计分析。使用以下公式列表进行第2部分-ΔΔCT 方法：
      ΔCT（检测组）= CT（靶基因，检测组） - CT（参照基因，检测组）
      ΔCT（校准样本）= CT（目标基因，校准样本） - CT（参照基因，校准样本）
      ΔΔCT = ΔCT（检测样本） - ΔCT（校准样本）
      2-ΔΔCT 基因表达的倍数变化

基因名称序列 (5′ 至 3′)
Mouse CCNA2 forwardCCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTG
Mouse CCNA2 reverseTTGTCCCGTGACTGTGTAGAG
Mouse ASPM forwardCTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
Mouse ASPM reverseCCAGGCTTGAATCTTGCAG
Mouse CCNB2 forwardTTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
Mouse CCNB2 reverseCTGTTCAACATCAACCTCCC
Mouse NUSAP1 forwardCTCCCTCAAGTACAGTGACC
Mouse NUSAP1 reverseTTTAACAACTTGGTTGCCCTC
Mouse CEP55 forwardCCGCCAGAATATGCAGCATCAAC
Mouse CEP55 reverseAGTGGGAATGGCTGCTCTGTGA

表1：定量实时PCR的引物序列。

  1. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
    注意：根据ELISA试剂盒的说明书，将ELISA试剂盒平衡至室温，配制洗涤缓冲液，并稀释标准品。预先将90 µL浓缩的生物素化抗体与8910 µL生物素化抗体稀释液混合，配制成生物素化抗体工作液（1:100）。同样，将90 µL浓缩的酶结合物与8910 µL酶结合物稀释液混合，预先配制成酶结合物工作液（1:100）。
    1. 使用含液氮的研钵将肺组织研磨成粉末。
    2. 使用精密天平称取50 mg肺组织，加入1 mL PBS至研磨管中，在冰上充分研磨。
    3. 将混合物在4 °C、3000 x g 条件下离心5 min，收集上清液作为待测样本。
    4. 将不同浓度的样本/标准品各100 µL加入ELISA板的相应孔中，用自粘封板膜覆盖反应孔，在37 °C培养箱中孵育90 min。
    5. 使用自动洗板机清洗ELISA板4次，每次注入350 µL洗涤缓冲液，注液与吸液之间间隔30 s。
    6. 每孔加入100 µL生物素化抗体工作液，用自粘封板膜密封孔板，在37 °C培养箱中孵育60 min。随后，按照前述步骤清洗ELISA板4次。
    7. 每孔加入100 µL酶结合物工作液，用自粘封板膜密封孔板，在37 °C培养箱中孵育30 min。随后，按照前述步骤清洗ELISA板4次。
    8. 每孔加入100 µL显色剂，避光处理，在37 °C培养箱中孵育10–20 min。然后每孔加入100 µL终止液，充分混匀，并立即在450 nm处测定吸光度（OD450）值。
      注意：使用八通道移液器加入生物素化抗体工作液、酶结合物工作液和终止液，可快速完成加样，避免潜在操作误差。
    9. 使用CurveExpert软件（http:// curveexpert.webhop.net/）生成标准曲线，计算各样本孔中目标物质的浓度。
  2. 蛋白质印迹（Western blotting）
    1. 按100:1:1的比例混合RIPA裂解缓冲液、苯甲基磺酰氟（PMSF）和磷酸酶抑制剂，配制放射免疫沉淀分析（RIPA）溶液，并置于冰上。
    2. 使用含液氮的研钵将肺组织研磨成粉末。
    3. 使用精密天平准确称取20 mg肺组织，加入250 µL RIPA混合溶液中。
    4. 将混合物在冰上孵育20 min，然后在4 °C、12,000 x g 条件下离心15 min，收集上清液作为样本。
    5. 按50:1的比例混合BCA试剂盒中的试剂A和试剂B，配制BCA工作液。
      1. 稀释标准品，配制浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL的稀释标准品溶液。将各标准品溶液和样本各20 µL分别加入96孔板的不同孔中，在37 °C孵育30 min。
      2. 使用酶标仪在490 nm处测定吸光度。根据标准品溶液的浓度和吸光度拟合标准曲线，并计算样本浓度23。使用RIPA混合溶液将样本浓度调整至相同水平。
    6. 在离心管中按4:1的比例将蛋白上清液与5倍上样缓冲液混合。在金属浴中煮沸5 min，然后在4 °C、12,000 x g 条件下离心15 min，收集上清液。
    7. 采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行蛋白质分离，并通过电转移将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h。
    8. 将PVDF膜在4 °C下与一抗（1:1000稀释）孵育12 h，随后用TBST洗涤3次，每次10 min，再在室温下与二抗（1:5000稀释）孵育2 h。
    9. 使用全自动化学发光免疫分析系统检测目标条带，并利用内置软件进行定量分析。
  3. 统计学分析
    1. 使用适当的软件进行统计学分析。
    2. 实验数据以均值±标准差表示。
    3. 采用单因素方差分析（ANOVA）确定显著性差异。
    4. 认为P < 0.05具有统计学意义。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

从GSE84884（pSS）的23348个基因中鉴定出共计3290个差异表达基因（DEGs），其中包括2659个上调基因和631个下调基因（图1A）。对于GSE51092（pSS），从11409个基因中鉴定出共计3290个差异表达基因，其中包括667个上调基因和587个下调基因（图1B）。GeneCards数据库获得102个与卵巢pSS相关的差异表达基因，筛选标准的相关性评分≥20。将来自GEO和GeneCards的pSS相关差异表达基因进行合并并去重后，共获得453个差异表达基因（pSS-DEGs）。从GSE32863（LUAD）的25440个基因中鉴定出共计7154个差异表达基因，其中包括3934个上调基因和3220个下调基因（图1C）。在GSE75037（LUAD）中，从25440个基因中鉴定出共计11235个差异表达基因，其中包括6125个上调基因和5110个下调基因（图1D）。GeneCar...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

尽管原发性干燥综合征（pSS）主要以外分泌腺的浸润性病变为特征，但腺体外损害同样不容忽视24。肺脏是pSS的靶器官之一，肺部受累是pSS常见的腺体外表现，通常表现为支气管黏膜和肺间质的淋巴细胞浸润25。研究表明，至少20%的pSS患者会出现间质性肺疾病（ILD）26,27。ILD是肺癌的重要危险因素，这在一定程度上解释了pSS患者肺癌发病率升高的现象28。同时，pSS-ILD患者的肿瘤标志物显著升高，进一步强调了pSS与肺部恶性肿瘤之间的关联29,30。为了探讨pSS与肺腺癌（LUAD）之间关联的潜在机制，本研究首先基于pSS和LUAD共同相关的差异表达基因（DEGs）进行了生物信息学分析，随后建立了与这两种疾病相关的动物模型以进行实验验证。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由国家高水平医院临床科研基金（2023-NHLHCRF-BQ-01）和中日友好医院青年项目（No.2020-1-QN-8）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
三色预染蛋白标记物EpizymeWJ103Western Blot
抗体稀释缓冲液EpizymePS119Western Blot
BCA 蛋白定量试剂盒EpizymeZJ101Western Blot
Cytoscape 3.7.1 软件美国国立普通医学科学研究所（NIGMS），美国国立卫生研究院（NIH）Version 3.7.1.用于生物网络分析与可视化的开源软件
ECL 发光液EpizymeSQ203Western Blot
电泳缓冲液EpizymePS105SWestern Blot
GraphPad Prism 10.0GraphPadVersion 10.0数据分析
HRP 标记山羊抗兔 IgG（H+L）（AS014）abclonalAS014Western Blot
JAK2 抗体Cell Signaling Technology3230TWestern Blot
小鼠 IL-1β ELISA 试剂盒北京 4A 生物技术有限公司CME0015ELISA
小鼠 IL-6 ELISA 试剂盒北京 4A 生物技术有限公司CME0006ELISA
磷酸酶抑制剂混合物（100×）EpizymeGRF102Western Blot
磷酸化-JAK2（Tyr1007/1008）抗体Cell Signaling Technology3776SWestern Blot
磷酸化-STAT3（Tyr705）抗体Cell Signaling Technology9145SWestern Blot
蛋白酶抑制剂混合物（100×）EpizymeGRF101Western Blot
无蛋白快速封闭缓冲液（5×）EpizymePS108Western Blot
PVDF 膜MilliporeIPVH00010Western Blot
R 软件R 统计计算基金会不适用用于数据分析、可视化和机器学习应用的统计分析软件与编程语言
放射免疫沉淀分析试剂EpizymePC101Western Blot
反转录系统PromegaA3500PCR
SDS-PAGEEpizymeLK303Western Blot
SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5×）EpizymeLT103Western Blot
STAT3 抗体Cell Signaling Technology9139SWestern Blot
SYBR Green 实时荧光定量 PCR 预混液TOYOBOQPK-201PCR
TBST（10×）EpizymePS103Western Blot
Western Blot 转膜缓冲液（10×）EpizymePS109Western Blot
β-肌动蛋白抗体abclonalAC026Western Blot

参考文献

  1. Thorlacius, G. E., Bjork, A., Wahren-Herlenius, M. Genetics and epigenetics of primary sjogren syndrome: Implications for future therapies. Nat Rev Rheumatol. 19 (5), 288-306 (2023).
  2. Bjordal, O., Norheim, K. B., Rodahl, E., Jonsson, R., Omdal, R. Primary Sjogren's syndrome and the eye. Surv Ophthalmol. 65 (2), 119-132 (2020).
  3. Zhong, H., et al. Hyperglobulinemia predicts increased risk of mortality in primary Sjogren's syndrome: Based on a Chinese multicentre registry. Mod Rheumatol. 34 (1), 137-143 (2023).
  4. Lin, W., et al. Interstitial lung disease in primary Sjogren's syndrome. BMC Pulm Med. 22 (1), 73(2022).
  5. Aiyegbusi, O., et al. Renal disease in primary Sjogren's syndrome. Rheumatol Ther. 8 (1), 63-80 (2021).
  6. Liampas, A., et al. Primary sjogren syndrome-related peripheral neuropathy: A systematic review and meta-analysis. Eur J Neurol. 30 (1), 255-265 (2023).
  7. Wu, J., et al. Clinical and laboratory features of primary Sjogren's syndrome complicated with mild to severe thrombocytopenia. Ann Transl Med. 10 (6), 300(2022).
  8. Zhong, H., et al. Primary Sjogren's syndrome is associated with increased risk of malignancies besides lymphoma: A systematic review and meta-analysis. Autoimmun Rev. 21 (5), 103084(2022).
  9. Goulabchand, R., et al. Cancer incidence in primary Sjogren's syndrome: Data from the French hospitalization database. Autoimmun Rev. 20 (12), 102987(2021).
  10. Witkowski Durand Viel, P., et al. Chronological interplay, clinical features, and treatments among patients with cancer and primary Sjogren's syndrome. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4309-4322 (2023).
  11. Xu, Y., et al. The prevalence and clinical characteristics of primary Sjogren's syndrome patients with lung cancer: An analysis of ten cases in China and literature review. Thorac Cancer. 6 (4), 475-479 (2015).
  12. Shi, L., Du, X., Li, J., Zhang, G. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link between psoriasis and cardiovascular disease. Clin Cosmet Investig Dermatol. 16, 2283-2295 (2023).
  13. Xu, R., Ma, L. L., Cui, S., Chen, L., Xu, H. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link between heart failure and sarcopenia. Arq Bras Cardiol. 120 (10), e20220874(2023).
  14. Lv, Y., et al. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link of long COVID and myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome. Front Immunol. 13, 952987(2022).
  15. Barrett, T., et al. Ncbi geo: Archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 41 (database issue), D991-D995 (2013).
  16. Stelzer, G., et al. The GeneCards suite: From gene data mining to disease genome sequence analyses. Curr Protoc Bioinformatics. 54, 1.30.1-1.30.33 (2016).
  17. Liu, S., et al. Three differential expression analysis methods for RNA sequencing: limma, EdgeR, DESeq2. J Vis Exp. 175, e62528(2021).
  18. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nat Commun. 10 (1), 1523(2019).
  19. Szklarczyk, D., et al. The string database in 2023: Protein-protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D638-D646 (2023).
  20. Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  21. Hill, W., et al. Lung adenocarcinoma promotion by air pollutants. Nature. 616 (7955), 159-167 (2023).
  22. Piao, C. H., et al. PM2.5 exposure regulates th1/th2/th17 cytokine production through NF-κβ signaling in combined allergic rhinitis and asthma syndrome. Int Immunopharmacol. 119, 110254(2023).
  23. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer. J Vis Exp. 33, e1610(2009).
  24. Luo, J., et al. Distinct clinical phenotypes of primary Sjogren's syndrome differ by onset age: A retrospective study of 742 cases and review of the literature. Clin Exp Rheumatol. 40 (12), 2373-2380 (2022).
  25. Luppi, F., et al. Lung complications of Sjogren syndrome. Eur Respir Rev. 29 (157), (2020).
  26. Berardicurti, O., et al. Interstitial lung disease and pulmonary damage in primary Sjogren's syndrome: A systematic review and meta-analysis. J Clin Med. 12 (7), 2586(2023).
  27. Roca, F., et al. Interstitial lung disease in primary Sjogren's syndrome. Autoimmun Rev. 16 (1), 48-54 (2017).
  28. Fisher, D. A., et al. Diagnosis and treatment of lung cancer in the setting of interstitial lung disease. Radiol Clin North Am. 60 (6), 993-1002 (2022).
  29. Okudela, K., et al. Implications of thyroid transcription factor-1 gene methylation in carcinogenesis of interstitial pneumonia-related non-terminal respiratory unit lung adenocarcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 15 (3), 120-130 (2022).
  30. Sekine, A., et al. Disease activity of lung cancer at the time of acute exacerbation of interstitial lung disease during cytotoxic chemotherapy. Thorac Cancer. 13 (17), 2443-2449 (2022).
  31. Glaviano, A., et al. PI3K/AKT/mTOR signaling transduction pathway and targeted therapies in cancer. Mol Cancer. 22 (1), 138(2023).
  32. Ediriweera, M. K., Tennekoon, K. H., Samarakoon, S. R. Role of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in ovarian cancer: Biological and therapeutic significance. Semin Cancer Biol. 59, 147-160 (2019).
  33. Hoxhaj, G., Manning, B. D. The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 20 (2), 74-88 (2020).
  34. Liu, R., et al. PI3K/AKT pathway as a key link modulates the multidrug resistance of cancers. Cell Death Dis. 11 (9), 797(2020).
  35. Manogaran, P., Beeraka, N. M., Paulraj, R. S., Sathiyachandran, P., Thammaiappa, M. Impediment of cancer by dietary plant-derived alkaloids through oxidative stress: Implications of PI3K/AKT pathway in apoptosis, autophagy, and ferroptosis. Curr Top Med Chem. 23 (10), 860-877 (2023).
  36. Acosta-Martinez, M., Cabail, M. Z. The PI3K/AKT pathway in meta-inflammation. Int J Mol Sci. 23 (23), 15330(2022).
  37. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5233462(2021).
  38. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κβ and PI3K/AKT pathways. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 6634837(2021).
  39. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  40. Yao, C., Narumiya, S. Prostaglandin-cytokine crosstalk in chronic inflammation. Br J Pharmacol. 176 (3), 337-354 (2019).
  41. Liu, P., et al. NOD-like receptor signaling in inflammation-associated cancers: From functions to targeted therapies. Phytomedicine. 64, 152925(2019).
  42. Damasceno, L. E. A., et al. PKM2 promotes Th17 cell differentiation and autoimmune inflammation by fine-tuning stat3 activation. J Exp Med. 217 (10), e20190613(2020).
  43. Banerjee, S., Biehl, A., Gadina, M., Hasni, S., Schwartz, D. M. JAK-STAT signaling as a target for inflammatory and autoimmune diseases: Current and future prospects. Drugs. 77 (5), 521-546 (2017).
  44. Jiramongkol, Y., Lam, E. W. FOXO transcription factor family in cancer and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 39 (3), 681-709 (2020).
  45. Tong, X., et al. Targeting cell death pathways for cancer therapy: Recent developments in necroptosis, pyroptosis, ferroptosis, and cuproptosis research. J Hematol Oncol. 15 (1), 174(2022).
  46. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: From mechanisms to detection. Mol Oncol. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  47. Felten, R., et al. Interleukin 6 receptor inhibition in primary Sjogren syndrome: A multicentre double-blind randomised placebo-controlled trial. Ann Rheum Dis. 80 (3), 329-338 (2021).
  48. Bardsen, K., et al. Interleukin-1-related activity and hypocretin-1 in cerebrospinal fluid contribute to fatigue in primary Sjogren's syndrome. J Neuroinflammation. 16 (1), 102(2019).
  49. Barrera, M. J., et al. Tofacitinib counteracts il-6 overexpression induced by deficient autophagy: Implications in Sjogren's syndrome. Rheumatology (Oxford). 60 (4), 1951-1962 (2021).
  50. Liu, H., Zhou, Q., Xu, X., Du, Y., Wu, J. ASPM and TROAP gene expression as potential malignant tumor markers. Ann Transl Med. 10 (10), 586(2022).
  51. Qian, X., et al. CCNB2 overexpression is a poor prognostic biomarker in Chinese NSCLC patients. Biomed Pharmacother. 74, 222-227 (2015).
  52. Mo, M. L., et al. Use of serum circulating CCNB2 in cancer surveillance. Int J Biol Markers. 25 (4), 236-242 (2010).
  53. Li, L., et al. NuSAP is degraded by APC/C-Cdh1 and its overexpression results in mitotic arrest dependent of its microtubules' affinity. Cell Signal. 19 (10), 2046-2055 (2007).
  54. Fabbro, M., et al. Cdk1/Erk2- and Plk1-dependent phosphorylation of a centrosome protein, cep55, is required for its recruitment to midbody and cytokinesis. Dev Cell. 9 (4), 477-488 (2005).
  55. Jeffery, J., Sinha, D., Srihari, S., Kalimutho, M., Khanna, K. K. Beyond cytokinesis: The emerging roles of CEP55 in tumorigenesis. Oncogene. 35 (6), 683-690 (2016).
  56. Feng, Z., et al. Overexpression of abnormal spindle-like microcephaly-associated (ASPM) increases tumor aggressiveness and predicts poor outcome in patients with lung adenocarcinoma. Transl Cancer Res. 10 (2), 983-997 (2021).
  57. Zheng, H., et al. Comprehensive pan-cancer analysis reveals NuSAP1 is a novel predictive biomarker for prognosis and immunotherapy response. Int J Biol Sci. 19 (14), 4689-4708 (2023).
  58. Verstappen, G. M., Pringle, S., Bootsma, H., Kroese, F. G. M. Epithelial-immune cell interplay in primary sjogren syndrome salivary gland pathogenesis. Nat Rev Rheumatol. 17 (6), 333-348 (2021).
  59. El Rayes, T., et al. Lung inflammation promotes metastasis through neutrophil protease-mediated degradation of Tsp-1. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (52), 16000-16005 (2015).
  60. Zhao, L., et al. PM2.5 and serum metabolome and insulin resistance, potential mediation by the gut microbiome: A population-based panel study of older adults in china. Environ Health Perspect. 130 (2), 27007(2022).
  61. Li, J., et al. PM2.5 exposure perturbs lung microbiome and its metabolic profile in mice. Sci Total Environ. 721, 137432(2020).
  62. Liao, J. H., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of artemisinin in treating primary sjogren's syndrome. BMC Immunol. 25 (1), 16(2024).
  63. Hu, Q., et al. JAK/STAT pathway: Extracellular signals, diseases, immunity, and therapeutic regimens. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1110765(2023).
  64. Xue, C., et al. Evolving cognition of the JAK-STAT signaling pathway: Autoimmune disorders and cancer. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 204(2023).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

差异表达基因KEGG 富集GO 富集蛋白质-蛋白质相互作用JAK2 STAT3 通路炎症性细胞因子动物模型
原发性干燥综合征合并肺腺癌：探讨潜在共同致病机制及实验验证
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。