原发性干燥综合征合并肺腺癌：探讨潜在共同致病机制及实验验证

摘要

本文描述了通过生物信息学分析和实验验证探究原发性干燥综合征与肺腺癌潜在共同致病机制的操作步骤及注意事项。

摘要

本研究旨在通过生物信息学分析及实验验证，探讨原发性干燥综合征（pSS）与肺腺癌（LUAD）之间潜在的共同致病机制。从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）和Genecard数据库中获取与pSS和LUAD相关的基因，并筛选出pSS与LUAD共有的差异表达基因（DEGs），即pSS-LUAD-DEGs。通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）富集分析，阐明pSS-LUAD-DEGs所涉及的重要生物学功能。通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络识别核心靶点，并进一步通过受试者工作特征（ROC）曲线分析评估枢纽基因的诊断准确性。在本研究中，NOD/Ltj小鼠作为pSS动物模型，接受细颗粒物2.5（PM2.5）刺激以诱导炎症反应。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质印迹法（western blotting）进行相关分子生物学实验验证。KEGG与GO富集分析结果表明，炎症在连接pSS与LUAD中发挥关键作用。IL6、CCNA2、JAK2、IL1B、ASPM、CCNB2、NUSAP1和CEP55被确定为pSS-LUAD的关键靶点。BALB/c小鼠和NOD/Ltj小鼠在连续21天接受PM2.5刺激后，肺组织中炎症因子IL-6和IL-1β的表达增强，激活JAK2/STAT3信号通路，并上调肿瘤相关基因CCNA2、CCNB2和CEP55的表达水平，其中NOD/Ltj小鼠的变化较BALB/c小鼠更为显著。该实验方案表明，肺部炎症微环境诱导的癌变可能是pSS患者肺腺癌高发的关键原因。此外，阻断相关机制可能有助于预防pSS患者中LUAD的发生。

引言

原发性干燥综合征（pSS）是一种自身免疫性疾病，其特征是外分泌腺的淋巴细胞浸润，导致干眼（xerophthalmia）和口干（xerostomia）等临床症状^1,2。pSS通常还伴有腺体外受累表现，包括高球蛋白血症³、间质性肺病⁴、肾小管性酸中毒⁵、神经损伤⁶和血小板减少症⁷，这些是主要的不良预后因素。近年来，一系列研究表明，pSS通常伴随癌症发病率升高，包括血液系统恶性肿瘤和实体瘤^8,9,10。肺癌是pSS相关癌症中最常见的类型之一，尤其是肺腺癌（LUAD）¹¹。

综上所述，进一步研究表明，原发性干燥综合征（pSS）与肺腺癌（LUAD）之间可能存在某些共同的潜在发病机制。据我们所知，目前尚无专门研究阐明这两种疾病之间的共同机制。近年来，生物信息学分析为我们揭示跨物种间潜在共病机制提供了新的可....

方案

实验动物饲养于中日友好医院的动物实验中心，饲养条件符合中国国家标准《实验动物 环境及设施要求》（GB14925-2010）规定的动物饲养环境。所有动物护理程序和实验均遵循ARRIVE指南，并基于3R原则（减少、替代、优化），遵守中国国家动物福利法规的相关规定。BALB/c小鼠购自SPF（北京）生物技术有限公司，NOD/Ltj小鼠购自华阜康（北京）生物技术有限公司。

1. 生物信息学分析

1. 数据集的制备
   1. 打开基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）¹⁵，并使用 原发性干燥综合征 和 肺腺癌 作为关键词搜索基因表达谱。然后点击 GEO DataSets 数据库中的结果并选择 Homo sapiens 在 主要生物体选择并下载感兴趣的数据库集及其相应的平台信息。
   2. 打开 Genecard 数据库（https://www.genecards.org/）¹⁶，并使用 p原发性干燥综合征 和

结果

从GSE84884（pSS）的23348个基因中鉴定出共计3290个差异表达基因（DEGs），其中包括2659个上调基因和631个下调基因（图1A）。对于GSE51092（pSS），从11409个基因中鉴定出共计3290个差异表达基因，其中包括667个上调基因和587个下调基因（图1B）。GeneCards数据库获得102个与卵巢pSS相关的差异表达基因，筛选标准的相关性评分≥20。将来自GEO和GeneCards的pSS相关差异表达基因进行合并并去重后，共获得453个差异表达基因（pSS-DEGs）。从GSE32863（LUAD）的25440个基因中鉴定出共计7154个差异表达基因，其中包括3934个上调基因和3220个下调基因（图1C）。在GSE75037（LUAD）中，从25440个基因中鉴定出共计11235个差异表达基因，其中包括6125个上调基因和5110个下调基因（图1D）。GeneCar.......

讨论

尽管原发性干燥综合征（pSS）主要以外分泌腺的浸润性病变为特征，但腺体外损害同样不容忽视²⁴。肺脏是pSS的靶器官之一，肺部受累是pSS常见的腺体外表现，通常表现为支气管黏膜和肺间质的淋巴细胞浸润²⁵。研究表明，至少20%的pSS患者会出现间质性肺疾病（ILD）^26,27。ILD是肺癌的重要危险因素，这在一定程度上解释了pSS患者肺癌发病率升高的现象²⁸。同时，pSS-ILD患者的肿瘤标志物显著升高，进一步强调了pSS与肺部恶性肿瘤之间的关联^29,30。为了探讨pSS与肺腺癌（LUAD）之间关联的潜在机制，本研究首先基于pSS和LUAD共同相关的差异表达基因（DEGs）进行了生物信息学分析，随后建立了与这两种疾病相关的动物模型以进行实验验证。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三色预染蛋白标记物	Epizyme	WJ103	Western Blot
抗体稀释缓冲液	Epizyme	PS119	Western Blot
BCA 蛋白定量试剂盒	Epizyme	ZJ101	Western Blot
Cytoscape 3.7.1 软件	美国国立普通医学科学研究所（NIGMS），美国国立卫生研究院（NIH）	Version 3.7.1.	用于生物网络分析与可视化的开源软件
ECL 发光液	Epizyme	SQ203	Western Blot
电泳缓冲液	Epizyme	PS105S	Western Blot
GraphPad Prism 10.0	GraphPad	Version 10.0	数据分析
HRP 标记山羊抗兔 IgG（H+L）（AS014）	abclonal	AS014	Western Blot
JAK2 抗体	Cell Signaling Technology	3230T	Western Blot
小鼠 IL-1β ELISA 试剂盒	北京 4A 生物技术有限公司	CME0015	ELISA
小鼠 IL-6 ELISA 试剂盒	北京 4A 生物技术有限公司	CME0006	ELISA
磷酸酶抑制剂混合物（100×）	Epizyme	GRF102	Western Blot
磷酸化-JAK2（Tyr1007/1008）抗体	Cell Signaling Technology	3776S	Western Blot
磷酸化-STAT3（Tyr705）抗体	Cell Signaling Technology	9145S	Western Blot
蛋白酶抑制剂混合物（100×）	Epizyme	GRF101	Western Blot
无蛋白快速封闭缓冲液（5×）	Epizyme	PS108	Western Blot
PVDF 膜	Millipore	IPVH00010	Western Blot
R 软件	R 统计计算基金会	不适用	用于数据分析、可视化和机器学习应用的统计分析软件与编程语言
放射免疫沉淀分析试剂	Epizyme	PC101	Western Blot
反转录系统	Promega	A3500	PCR
SDS-PAGE	Epizyme	LK303	Western Blot
SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5×）	Epizyme	LT103	Western Blot
STAT3 抗体	Cell Signaling Technology	9139S	Western Blot
SYBR Green 实时荧光定量 PCR 预混液	TOYOBO	QPK-201	PCR
TBST（10×）	Epizyme	PS103	Western Blot
Western Blot 转膜缓冲液（10×）	Epizyme	PS109	Western Blot
β-肌动蛋白抗体	abclonal	AC026	Western Blot