本文提出了一种利用光镊制造杂合类球体的实验方案。该方法能够精确控制类球体形成过程的早期阶段，这是其他方法所无法实现的。
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摘要
摘要
二维（2D）细胞培养仍然是临床前癌症研究中最常用的模型之一。然而，三维（3D） 体外 模型似乎用于评估 体内 更准确地模拟环境，包括更贴近实际的结构形态、微环境以及对药物的反应。
光镊技术 使用一个或多个聚焦激光束，以非侵入方式操控纳米和微米尺度结构的位置、运动、相互作用及动态行为。光镊（OT）在细胞生物学中已有广泛应用，但其在癌症研究中的潜力仍被低估。本文推荐一种利用光镊进行淋巴瘤-基质细胞球体形成的非侵入性实验方案。该方法不仅可构建杂合细胞球体 从头合成 但还能控制附着细胞的数量以及黏附形成的时间，为组织工程提供了重要的信息来源。此外，光镊技术（OT）能够研究杂合类球体形成的早期阶段，这是常规的群体性技术所无法实现的。尤为重要的是，该模型可用于研究抗癌药物诱导的黏附微小变化。本方案可轻松应用于其他细胞类型。
引言
三维（3D）细胞模型因其在多种功能和结构特性上更接近肿瘤组织，正在加速癌症研究。这些特性包括细胞外基质的产生、细胞间的相互作用、营养物质和氧气梯度的维持，以及对治疗的类似响应1,2,3,4最近，为了更好地反映 体内 条件，已开发出涉及多种细胞类型的高级异质性3D模型5,6,7.
B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）是一类起源于B淋巴细胞的异质性恶性肿瘤，而B淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分8。B-NHL具有多样的临床表现和组织学特征，涵盖一系列疾病谱，从病程迁延的惰性类型到快速进展的侵袭性亚型均有涉及9,10。B-NHL及其他血液系统恶性肿瘤的发病机制常与肿瘤微环境的影响相关11,
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方案
1. 基于琼脂糖凝胶的微模具制备
注意：处理所有细胞培养物时，必须采用正确的无菌技术。本方案中使用的所有试剂均列于材料表中。如图1A所示，为单次实验制备三块含间充质干细胞（MSCs）的凝胶。
图1：间充质基质细胞（MSC）球体的制备。（A）琼脂糖微模具制备步骤示意图。（B）间充质基质细胞（MSCs）的接种及间充质球体的培养。
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结果
我们之前的研究结果表明，间充质基质细胞与淋巴瘤细胞共培养时，会形成均一的基质核心，癌细胞可均匀地附着于其上18。在本研究中，我们利用自行构建的光镊成功构建了由间充质基质细胞和淋巴瘤细胞组成的人源杂合类球体。图2B展示了光学显微镜下典型的类球体图像，这是光镊系统的重要组成部分。而图2C则显示了使用抗CD20抗体对杂合类球体进行的免疫组织化学染色结果37。CD20是B细胞常见的标志物，在大多数B细胞上均有表达。在构建杂合类球体所用的淋巴瘤细胞中，所有细胞均表达CD20抗原并呈棕褐色染色，而基质细胞则为CD20阴性。
构建杂合类球体的第一步是使用上述详细方案制备间充质基质细胞类球体。将HS-5细胞系的间充质基质细胞接种于琼脂糖微模具中，在37 °C标准条件下培养72小时后，形成形状较为均一的球形类球体，如图3A和
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讨论
本研究利用光镊技术实时构建了间充质基质细胞为核心、淋巴瘤细胞为外壳的杂合类球体。包括捕获系统在内的新型激光技术如今已有商业化产品，并日益普及。然而迄今为止，大多数光镊装置仍为实验室自行搭建，因此在仪器校准、操作流程和实验几何构型方面，不同实验室之间可能存在差异38,39本方案介绍了搭建商用及定制化光镊系统所需的基本信息，以实现实时构建杂合类球体。尽管光镊系统具备先进研究实验室在专业人员操作下开展实验所需的灵活性，但鉴于该方法展现出的巨大潜力——即能够 "触碰" 以非侵入方式观察活细胞，我们希望该技术能在癌症研究领域得到广泛应用。特别是光镊技术能够揭示杂合类球体形成的早期阶段，而这是传统整体三维技术无法实现的40根据本方案在实时条件下构建的杂合类球体反映了淋巴瘤细胞与基质细胞在水凝胶培养中发生的自聚集现象，正如我们先前所述。18附着细胞的数量以及细胞间接触的位置均可被精确调控，且这种图案化的三维结构无需任何外部稳.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者衷心感谢 Nicholas Czarnik，他细致的编辑工作显著提高了本研究的清晰度。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ-型培养皿，35 mm，高玻璃底 | IBIDI | 81158 | |
| 12-256 型微模具 3D 培养皿 | Microtissues Inc., RI, USA | 12-256TR | |
| 3 µm 聚苯乙烯微球 | Polysciences | 17134-15 | |
| 抗 CD20 抗体（克隆 L26） | Dako | IS604 | |
| 全自动细胞计数仪，EVE | NanoEntek | EVE/ EVE-MC | |
| 自动染色机 Link 48 | Dako | D09634 | |
| 相机 | Olympus | U-TV0.63XC | |
| CelCulture CO2 培养箱 | Esco Technologies, Inc. | CCL | |
| 细胞计数板，EVE | NanoEntek | NE-EVS | |
| 细胞系 HS-5 | ATCC | CRL-3611 | |
| 细胞系 Ri-1 | DSMZ | ACC 585 | |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX43 | |
| ImageJ 程序 | 美国国立卫生研究院，MD，USA | ||
| 倒置显微镜 | Olympus | IX73 | |
| 活/死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140122 | |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 11875093 | |
| 氯化钠溶液 | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.9% 氯化钠溶液，无菌 | ITW ReITW Reagents, S.R.L.agents, S.R.L. | A1671 | |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Gibco | 15250061 | |
| TrypLE Express 酶（1X），无酚红 | Gibco | 12604013 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | Gibco | 25300096 | |
| UltraPure 琼脂糖 | Invitrogen | 16500500 | |
| 光镊系统 | |||
| 二向色镜 | Thorlabs | DMSP805R | |
| 数字相机 | Mikrotron GmbH | MC1362 | |
| 振镜式 XY 扫描系统 | Thorlabs | GVS002 | |
| 倒置显微镜 | Olympus | IX71 | |
| 透镜 1 | Thorlabs | AC254-050-B-ML | |
| 透镜 2 | Thorlabs | AC508-200-B-ML | |
| Nd:YAG 1064 nm 激光器 | Laser Quantum | Ventus |
参考文献
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744(2020).
- Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression a....
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