本方案概述了一种全面的质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术 [CyTOF]）分析方法，用于评估肝细胞癌（HCC）中的全身性及局部免疫应答。该方法旨在揭示HCC的免疫图谱，深入理解肿瘤微环境及其相关的免疫机制。
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摘要
摘要
肝细胞癌（HCC）是全球最常见且致死率最高的肝癌类型之一。尽管治疗手段不断进步，但由于遗传、环境和免疫因素之间复杂的相互作用推动了疾病进展，HCC患者的预后仍然较差。了解HCC的免疫图谱对于开发有效的治疗策略至关重要，尤其是在免疫治疗领域，该领域在改善患者预后方面具有巨大潜力。本研究采用质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术 [CyTOF]）技术，研究HCC患者体内的全身性及局部免疫应答。通过分析外周血和肿瘤样本，旨在鉴定与HCC进展相关的独特免疫细胞亚群及其功能状态。研究结果全面揭示了HCC中的免疫微环境特征，突出了潜在的生物标志物和治疗靶点。该方法为深入理解HCC背后的免疫机制提供了宝贵见解，并为开发更有效的免疫疗法奠定了基础。
引言
肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，由于其高发病率和高死亡率，已成为一个重要的全球健康问题1。根据世界卫生组织的数据，HCC在全球范围内是第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因2。该疾病在乙型和丙型肝炎慢性感染率较高的地区尤为普遍，例如东亚和撒哈拉以南非洲3。主要危险因素包括病毒性肝炎、肝硬化和代谢综合征4。HCC需要长期治疗，给患者带来巨大的身体和经济负担，因此迫切需要有效的预防措施、早期检测手段以及创新的治疗策略5。
免疫系统在肝细胞癌（HCC）的发生发展中起着关键作用。肝脏是一个具有高度免疫活性的器官，富含多种免疫细胞，包括肝脏定居的巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞和T细胞，这些细胞对于监测和清除异常细胞至关重要6。然而，HCC可通过表达免疫抑制分子、募集免疫抑制性细胞以及改变肿瘤微环境来逃避免疫监视7,8。这种免疫逃逸不仅促进肿瘤的生长和转移，还影响机体对免疫治疗的反应9,
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方案
血液和肝细胞癌样本采集、外周血单个核细胞（PBMCs）分离、单细胞解离及染色的步骤如下所述。实验所用试剂和材料均列于材料表中。所有实验均经浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准，确保肿瘤样本的采集不影响病理诊断。所有受试者均签署了书面知情同意书。
1. 外周血单个核细胞的分离
- 从肝细胞癌（HCC）患者的静脉中抽取血样，并使用含有抗凝剂的采血管以防止血液凝固。血样来自4名年龄在50-60岁之间的患者（2名男性和2名女性），平均年龄为55岁。对每位患者采集10-20 mL外周血，以确保有足够的体积用于后续外周血单个核细胞（PBMCs）的分离，同时尽量减少患者的不适。
- 吸取特定体积的血液（例如6 mL），并加入等体积的外周血淋巴细胞分离液（Ficol-paque 或 Lymphoprep）至15 mL离心管中。
注意：总体积最好不超过12 mL，以留出足够空间进行充分混匀并防止溢出；15 mL离心管的最大推荐体积为14 mL。 - 将离心管倾斜约45°，沿管壁缓慢加入血液，使血液轻柔地覆盖在淋巴细胞分离液上方，避免两层液体混合。
注意：可使用移液管沿管壁缓慢加样。 - 将离心管放入离心机，设置加速度为8，减速度为3，在450 × g、4 °C条件下离心30分钟。离心后，试管中自上而下形成四层：血浆层、PBMCs层（白色膜层）、....
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结果
为了阐明与肝细胞癌（HCC）相关的免疫学特征，本研究对免疫细胞群体进行了全面分析。研究人员收集了4名肝细胞癌患者的配对外周血单个核细胞（PBMCs）及HCC组织样本，并利用两组针对PBMCs和HCC组织样本的抗体组合，通过质谱流式细胞技术在单细胞蛋白质组水平上对免疫细胞群体进行了分析。
质控后，共有 45,326 个细胞被纳入质谱流式细胞分析。采用 PhenoGraph 聚类算法结合 t-SNE 方法生成二维图谱，并将细胞划分为不同的表型。主要免疫细胞亚群根据谱系标志物进行鉴定，包括 CD3（T 细胞）、CD4（CD4+ T 细胞）、CD8（CD8+ T 细胞）、CD56（NK 细胞）、CD19（B 细胞）和 CD14（单核细胞）27,28。免疫细胞簇通过质谱流式细胞技术进行表征。
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讨论
本研究利用质谱流式细胞技术，对肝细胞癌（HCC）的全身性及局部免疫应答进行深入分析。在此背景下应用质谱流式技术，能够在单细胞水平同时检测多种标志物，提供详细的免疫表型特征，这对于理解HCC复杂的免疫微环境至关重要。质谱流式技术通过实现高维度的单细胞分析，彻底改变了免疫学研究。该技术采用与抗体偶联的稀有金属同位素标签，可在一次实验中同时测量超过40个参数。这一能力在HCC研究中尤为有利，因为HCC的肿瘤微环境（TME）具有高度的细胞异质性以及复杂的免疫相互作用18,29。
与传统流式细胞术相比，质谱流式细胞术的一个显著优势在于其增强的多重检测能力。传统流式细胞术在使用荧光标记物时受限于光谱重叠问题，而质谱流式细胞术采用金属同位素作为标记，避免了这一限制。因此，可在无需复杂补偿算法的情况下，同时检测更多种类的标记物30。这一能力在肝细胞癌（HCC）研究中至关重要，因为全面分析多种免疫细胞群体及其状态，对于理解肿瘤与免疫系统.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作得到中国国家重点研发计划（项目编号 2019YFA0803000，授予 J.S.）、浙江省杰出青年科学基金（项目编号 R22H1610037，授予 J.S.）、国家自然科学基金（项目编号 82173078，授予 J.S.）以及浙江省自然科学基金（项目编号 2022C03037，授予 J.S.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1×PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 10×PBS | HyClone | SH30256.01 | |
| 100 mm×20 mm 经组织培养处理的培养皿 | Corning | 430167 | |
| 1000 µL 移液器吸头 | Rainin | 30389218 | |
| 15 mL 离心管 | NEST | 601052 | |
| 200 µL 移液器吸头 | Rainin | 30389241 | |
| 40 µm 尼龙细胞筛/70 µm 尼龙细胞筛 | Falcon | 352340 | |
| 50 mL 离心管 | NEST | 602052 | |
| 70 μm 注射器滤器 | Sangon Biotech | F613462-9001 | |
| 抗人 CCR2 抗体（克隆：K036C2） | BioLegend | 357224 | |
| 抗人 CCR3 抗体（克隆：5E8） | BioLegend | 310724 | |
| 抗人 CCR7 抗体（克隆：G043H7） | BioLegend | 353240 | |
| 抗人 CD103 抗体（克隆：Ber-ACT8） | BioLegend | 350202 | |
| 抗人 CD115 抗体（克隆：9-4D2-1E4） | BioLegend | 347314 | |
| 抗人 CD117 抗体（克隆：104D2） | BioLegend | 313201 | |
| 抗人 CD11b 抗体（克隆：1CRF44） | BD | 562721 | |
| 抗人 CD11c 抗体（克隆：B-ly6） | BD | 563026 | |
| 抗人 CD123 抗体（克隆：6H6） | BioLegend | 306002 | |
| 抗人 CD127 抗体（克隆：A019D5） | BioLegend | 351337 | |
| 抗人 CD13 抗体（克隆：WM19） | BioLegend | 301701 | |
| 抗人 CD138 抗体（克隆：MI15） | BioLegend | 356535 | |
| 抗人 CD14 抗体（克隆：HCD14） | BioLegend | 325604 | |
| 抗人 CD141 抗体（克隆：M80） | BioLegend | 344102 | |
| 抗人 CD15 抗体（克隆：QA19A61） | BioLegend | 376302 | |
| 抗人 CD16 抗体（克隆：B7311） | BD | 561313 | |
| 抗人 CD161 抗体（克隆：HP-3G10） | BioLegend | 339902 | |
| 抗人 CD163 抗体（克隆：GHI/61） | BioLegend | 333603 | |
| 抗人 CD169 抗体（克隆：7-239） | BioLegend | 346002 | |
| 抗人 CD19 抗体（克隆：HIB19） | BioLegend | 302226 | |
| 抗人 CD1c 抗体（克隆：L161） | BioLegend | 331501 | |
| 抗人 CD20 抗体（克隆：2H7） | BioLegend | 302301 | |
| 抗人 CD206 抗体（克隆：15-2） | BioLegend | 321151 | |
| 抗人 CD24 抗体（克隆：ML5） | BioLegend | 311129 | |
| 抗人 CD25 抗体（克隆：BC96） | BioLegend | 302624 | |
| 抗人 CD3 抗体（克隆：UCHT1） | BD | 555916 | |
| 抗人 CD31 抗体（克隆：W18200D） | BioLegend | 375902 | |
| 抗人 CD32 抗体（克隆：FUN-2） | BioLegend | 303232 | |
| 抗人 CD326 抗体（克隆：CO17-1A） | BioLegend | 369812 | |
| 抗人 CD33 抗体（克隆：WM53） | BioLegend | 303402 | |
| 抗人 CD4 抗体（克隆：L200） | BD | 563094 | |
| 抗人 CD45 抗体（克隆：HI30） | BD | 563716 | |
| 抗人 CD45RO 抗体（克隆：UCHL1） | BioLegend | 304220 | |
| 抗人 CD56 抗体（克隆：5.1H11） | BioLegend | 362510 | |
| 抗人 CD64 抗体（克隆：S18012C） | BioLegend | 399502 | |
| 抗人 CD66b 抗体（克隆：6/40c） | BioLegend | 392917 | |
| 抗人 CD68 抗体（克隆：Y1/82A） | BioLegend | 333808 | |
| 抗人 CD69 抗体（克隆：FN50） | BioLegend | 310902 | |
| 抗人 CD7 抗体（克隆：4H9/CD7） | BioLegend | 395602 | |
| 抗人 CD8 抗体（克隆：RPA-T8） | BD | 557750 | |
| 抗人 CD80 抗体（克隆：W17149D） | BioLegend | 375402 | |
| 抗人 CD86 抗体（克隆：BU63） | BioLegend | 374202 | |
| 抗人 FOXP3 抗体（克隆：206D） | BioLegend | 320101 | |
| 抗人 HLA_ABC 抗体（克隆：W6/32） | BioLegend | 311426 | |
| 抗人 HLA-DR 抗体（克隆：L243） | BioLegend | 307650 | |
| 抗人 IgD 抗体（克隆：IA6-2） | BioLegend | 348211 | |
| 抗人 Ki67 抗体（克隆：Ki-67） | BioLegend | 350501 | |
| 抗人 PD_L2 抗体（克隆：MH22B2） | BD | 567783 | |
| 抗人 PD1 抗体（克隆：EH12.2H7） | BioLegend | 329951 | |
| 抗人 PDL1 抗体（克隆：MIH2） | BioLegend | 393602 | |
| 抗人 TCR-γδ 抗体（克隆：B1） | BD | 740415 | |
| 细胞冻存液 | Thermo Fisher | A2644601 | |
| Cell-ID 铂试剂 | Standard BioTools | 201064 | |
| Cell-ID 铱嵌入剂 | Standard BioTools | 201192A | |
| IV 型胶原酶 | Gibco | 17104019 | |
| 恒温振荡器 | FAITHFUL | FS-50B | |
| CyTOF 系统 | Fluidigm Corporation | Helios | |
| Cytosplore | Cytosplore Consortium | 2.3.1 | |
| Dispase II | Gibco | 17105041 | |
| DNase I | Merck | DN25 | |
| Eppendorf 离心机 | Eppendorf | 5702 | |
| EQ 四元素校准微球 | Standard BioTools | 201078 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Ficoll-Paque | Cytiva | 17-1440-02 | |
| Finnpipette | Thermo Scientific | 4700870 | |
| 固定缓冲液 | Thermo Scientific | FB001 | |
| FlowJo | BD Life Sciences | 10.1 | |
| 甲醛溶液 | Thermo Scientific | 28906 | |
| 颗粒酶 B 抗体，抗人/小鼠（克隆：QA16A02） | BioLegend | 396413 | |
| 肝素抗凝管 | BD | 367874 | |
| 人 BD Fc 封闭液 2.5 mg/mL | BD | 564220 | |
| MACS 组织保存液 | Miltenyi | 130-100-008 | |
| Maxpar 固定与破膜缓冲液 | Standard BioTools | 201067 | |
| Maxpar 金属偶联抗体 | Standard BioTools | Various | |
| Maxpar PBS | Standard BioTools | 201058 | |
| Maxpar 水 | Standard BioTools | 201069 | |
| Maxpar 细胞染色缓冲液 | Standard BioTools | 201068 | |
| 金属偶联抗人 α-SMA 抗体（克隆：1A4） | Miltenyi Biotec | 130-098-145 | |
| Percoll | Merck | P4937-500ML | |
| 破膜缓冲液 | Thermo Scientific | 00833356 | |
| 红细胞裂解液 | BD | 555899 | |
| 冷冻离心机 | Eppendorf | 5910ri | |
| RPMI 1640 培养基 | GE HealthCare | SH30027.0 | |
| 手术刀 | APPLYGEN | TB6298-1 | |
| 无菌巴斯德移液管 | ZDAN | ZD-H03 | |
| 组织消化液 | Yeasen Biotech | 41423ES30 | |
| 调谐液 | Standard BioTools | 201072 | |
| 涡旋混合器 | Thermo Scientific | 88882012 |
参考文献
- Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
- Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-2....
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