利用iChip技术分离土壤微生物

摘要

iChip 技术利用了一种廉价且简单的方法 原位 一种可提高从土壤中发现新型微生物效率的分离装置。新型微生物可用于土壤微生物组研究、天然产物发现等多种应用。

摘要

iChip分离技术使用一种 原位 一种可提高此前不可培养微生物可培养性的分离装置。微生物是新型化学物质及潜在生物活性分子的重要来源。然而，利用传统实验室方法仅能培养约1%的环境微生物。随着抗菌药物耐药性的上升，寻找用于对抗感染和疾病的新药成为当务之急，而发现新微生物是获取新分子的关键途径之一。通过将土壤微生物菌落接种于96孔板的孔中，以半透膜密封后置于土壤表面进行培养，可使微生物接触到土壤中的水分和生长因子，从而在实验室条件下实现新型微生物的分离。经过iChip装置一段时间的驯化后，这些微生物有望被转接至常规培养基上进行继代培养，并用于后续研究。该装置在生物活性分子发现和土壤微生物组研究中具有重要价值，此前已成功应用于上述两个领域。

引言

环境细菌是天然产物（NPs）的重要来源¹。这些代谢物对微生物的生存并非必需，而是通过抑制周围其他微生物的生长，帮助自身定植而产生²。在进化过程中，天然产物的化学结构和生物活性被不断优化，使其成为高效的抗菌剂。达托霉素（daptomycin）就是一个典型例子，该抗生素于2003年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准³。近年来，微生物耐药性的发生频率和严重程度不断上升，像达托霉素这样的新型药物已成为治疗对传统抗生素产生耐药性的感染的最后手段⁴。开发新的抗生素及其他药物对于维持常见感染和疾病的可治疗性至关重要。

尽管天然产物（NPs）通常是优良的药物先导化合物，但在20世纪50至60年代抗生素的黄金时代之后，制药行业转向了合成方法进行药物发现⁵。到20世纪70年代，相同的微生物和抗菌代谢产物被反复地重新分离，而新颖药物候选物的发现却越来越少^1,6。土壤微生物组具有丰富的微生物多样性，但在常规实验室条件下仅能分离出其中一小部分微生物。通过基因组学检测到的绝大多数土壤微生物在使用传统培养方法进行培养时无法被观察到，这一现象因而被称为"巨大平板计数异常"⁷。这些不可培养的微生物被称为微生物暗物质，因为已知其存在，但在获得纯培养物之前无法在体外对其进行研究。这些不可培养的微生物很可能能够产生大量药物候选物，在微生物耐药性日益严重的时代具有重要意义。

iChip 技术是一种可用于提高从环境中回收新型微生物效率的方法^8,9。该技术有助于在培养过程中模拟细菌的自然环境，从而提高那些在常规实验室条件下无法存活的微生物的可培养性¹⁰。已有多种改良型 iChip 被开发并用于从多种不同来源分离微生物，例如土壤、沉积物、海洋环境以及动物肠道^{11,12,13,14,15,16}。该技术最具影响力的应用案例或许来自 NovoBiotic 制药公司，该公司发现了一种新型细菌 Eleftheria terrae¹⁷。该微生物能够产生一种属于新类别的抗生素——Teixobactin，可抑制多种与人类健康相关且具有耐药性的细菌，且尚未检测到耐药性的产生^5,18。这一发现意义重大，因为 Teixobactin 是数十年来首次发现的新型抗生素，表明该技术为新型药物发现以及克服“巨大平板计数异常”现象提供了极具前景的途径¹⁹。本文介绍了一种基于 Berdy 等人先前研究的改良型 iChip，其设计已优化以提高操作便捷性并防止污染⁹。

方案

1. 培养基的配制与灭菌

1. 配制并灭菌琥珀酸盐最低盐培养基（SMS），其成分为：0.1 g 土豆淀粉、1 g 酪蛋白氨基酸、0.125 g 酪蛋白消化物，以及 1 L 水中含 15 g 细菌学或工业级琼脂。
2. 使用 20 分钟、121 °C 的液体循环程序对培养基和 100 mL 分子生物学级水进行高压灭菌。
   注意：确保所有将与琼脂-细胞混合物接触的其他物品均为无菌购买，包括移液器吸头和离心管；否则，也需对其进行高压灭菌。

2. 改良型iChip构建

1. 使用5 mm琼脂打孔工具切掉四个96孔板的孔底。
2. 将0.05 µm聚碳酸酯膜切割成7.6 cm × 11 cm的矩形，或与96孔板底部尺寸相同的形状。
3. 使用硅酮密封剂将0.05 µm聚碳酸酯膜粘附在96孔板底部，确保密封剂封闭各孔，但不完全覆盖孔的开口。室温下静置至少24小时，或按照密封剂说明书要求进行干燥。
   注意：密封剂必须防水、无毒，且为100%硅酮。大多数水族箱密封剂均可适用。

3. 细胞悬液的制备

1. 标记四个15 mL离心管为A-D，四个50 mL离心管为E-H，并向每个离心管中加入4.5 mL无菌水。
2. 称取1 g土壤加入一个50 mL离心管中，加入10 mL无菌水，涡旋振荡10分钟。
3. 静置土壤悬液10分钟，使其沉淀。
4. 用移液器吸取含有细胞的上清液0.5 mL，从土壤悬液中加入到A管中，并充分混匀。
5. 将A管中的细胞悬液0.5 mL加入B管，并充分混匀；将B管中的0.5 mL溶液转移至C管，并充分混匀；依此类推，对所有剩余的离心管重复该操作，完成八个离心管中的10倍梯度稀释系列。
6. 从H管中移除0.5 mL溶液，使所有管中液体体积相等。
   注意：这些浓度适用于本地土壤。首次进行该实验时，建议进行更宽范围的稀释，以确定合适的样品浓度。

4. 改良的iChip接种

1. 将iChips完全浸入95%乙醇中至少15分钟。
2. 从乙醇中取出培养板，放置于无菌纸巾上。在让乙醇自然挥发的同时，打开超净台内的紫外灭菌灯照射15分钟，以进一步灭菌。
3. 用移液器向培养板的第一列加入360 µL无菌SMS培养基，作为对照孔。
4. 向E管中的细胞悬液加入45 mL冷却至50 °C的SMS培养基，充分混匀，使细胞悬液与琼脂混合均匀。
5. 从步骤4.4得到的琼脂-细胞混合物中，用移液器向96孔板其余各孔每孔加入360 µL。
   注意：建议使用多通道移液器，因为琼脂凝固较快。混合后的琼脂-细胞混合物不建议再次加热，以免杀死微生物。
6. 待培养基凝固后，用PCR板盖密封培养板顶部。
7. 对F至H管重复步骤3.3至3.6，共填充四块iChips，每块iChips中的浓度呈十倍梯度差异。
   注意：如需保持培养基熔融状态，可在操作间隙将培养基松盖后放入微波炉加热30秒，或置于60 °C水浴中保温。

5. 孵育

1. 将平板放入一个含有约一英寸步骤3.2中所用土壤的盒子中，膜面朝下，并盖上盖子。
2. 将平板置于密闭容器中，在25 °C避光条件下培养。
   注意：一周后检查改良iChips的内容物，以确保在设置过程中未发生污染。若平板所有孔中均出现单一或少数几种微生物的过度生长，则表明存在污染。
3. 6周后，检查iChips。选择生长孔数少于25%的平板用于菌落分离。

6. 菌落分离

1. 用无菌水将修饰后的 iChips 清洗 3 次，以去除所有土壤颗粒。
2. 用 95% 乙醇擦拭培养皿的顶部和侧面，避免接触带有半透膜的一侧。
3. 使用无菌刀片，沿含有菌落的一个孔周围的培养皿盖切割。
4. 使用无菌划线工具刺穿菌落，并采用四区划线法将其划线接种至 100 × 15 mm 的 SMS 琼脂平板上。
5. 对 iChips 中其他每个孔内生长的菌落重复上述操作。
   注意：对于微小菌落，只要未在孔周围移除培养皿盖，可将平板重新放回土壤中继续培养，直至菌落足够大以便转接培养。
6. 将 SMS 平板在 25 °C 条件下培养，并监测菌落生长情况。
7. 检查菌落，确保已分离得到纯培养物。

7. 微生物的鉴定

1. 对分离株的基因组进行测序²⁰。
2. 使用 JSpeciesWS 或其他基于基因组的鉴定平台评估基因组，以确定各分离株与 GenomesDB 中已知微生物的相似程度。
3. 将低于物种鉴定公认阈值的分离株归类为潜在新种。

结果

该实验方案的可视化概述见图1。一次成功的改良iChip实验应至少获得一个培养板，其少于25%的微孔中出现菌落生长，且对照组微孔中无任何生长现象。具有此数量生长微孔的培养板通常可确保单个菌落被分离至独立微孔中。此外，由系列稀释液所制备的各连续培养板中，菌落数量或含菌落的微孔数量应呈现十倍递减趋势。代表性实验结果见图2，其中7号和8号培养板为成功的iChip，因其生长微孔比例低于25%，且含菌落微孔的百分比随培养板序号增加而逐级下降，如表1所示。若某次实验中所有培养板的每个微孔均含一个以上菌落，或所有微孔均无菌落生长，则视为阴性结果。

图1：使用改良型iChip培养土壤微生物的示意图。（A,B）平板的制备（步骤2）。（C）接种液的准备（步骤3）。（D,E）iChip的组装（步骤4）。（F）iChip的培养（步骤5）。（G-I）将分离菌株转移至常规培养基（步骤6）。请点击此处查看该图的放大版本。

Ichip	琼脂悬浮液中土壤的浓度	有菌落的孔	菌落形成单位
E	5.0 x 10-6 g/mL	全部	过多无法计数
F	5.0 x 10-7 g/mL	全部	过多无法计数
G	5.0 x 10-8 g/mL	22	22
H	5.0 x 10-9 g/mL	6	6

表1：一次成功的iChip实验的代表性数据，其中含有菌落的孔数随着连续稀释度的增加而减少。

图 2：两个成功改良的 iChip 的典型实验结果。 这些 iChip 来自同一项实验，其中（A）由细胞-琼脂混合物 G 制备的平板含有 22 个菌落，而（B）由细胞-琼脂混合物 H 制备的平板含有 6 个菌落，这与两种混合物之间 10 倍的稀释差异一致。请点击此处查看该图的放大版本。

可以通过肉眼或显微镜观察菌落，如图3A-G所示。菌落可能生长在琼脂表面，如图3B所示，也可能嵌入琼脂内部，例如图3F中的菌落。在改良型iChip成功培养的情况下，有时同一孔中可能存在两个菌落，如图3G所示。在某些情况下，若菌落之间距离足够远，则可用针分别穿刺并进行转接培养；然而，图3G中的菌落很难被轻易分离为纯培养的微生物。将菌落从iChip转移至常规SMS培养基上的示例见图4。

图3：iChip中培养6周后菌落生长的代表性显微图像。（A-F）观察到单个菌落，应从中进行分离传代培养；而（G）中两个菌落彼此靠近生长，难以获得无菌纯培养物。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：从改良iChip中分离的细菌在SMS琼脂平板上生长的代表性结果。 请点击此处查看该图的放大版本。

将改良型iChip中的菌落分离至常规琼脂平板的能力也决定了实验的成功与否。并非所有在改良型iChip中生长的菌落都能在转移至常规平板后存活。在iChip中，菌落暴露于生长因子和土壤营养物质中，从而提高了其可培养性。对于某些微生物而言，短暂的驯化期不足以使其在常规条件下可培养。菌落从iChip转移到平板的回收率因实验而异，但应有部分菌落能够在平板上生长，因为该方法同样可以培养那些易于培养的微生物。例如，图2中的改良型iChip共含有28个菌落，经继代培养后在琼脂平板上生长的菌落数量为16个，而12个未能存活下来。一旦在全尺寸琼脂平板上完成培养，即可对分离菌株进行鉴定并用于后续研究，如图4所示。

一次成功的改良型 iChip 实验应能分离出在物种水平上不同于已知微生物的微生物。通过将分离得到的 DNA 与已知微生物的基因组进行比对，可确定每个分离株与已知微生物的相似程度。每个分离株与其最近缘微生物的四核苷酸 Z 值（tetra Z scores）用于描述其相似百分比。图5 显示，在分离出的12种细菌中，有4种为新物种或更高级分类单元，2种可能为新菌株，6种为已知微生物。获得多种新颖物种或菌株的结果与此前发表的 iChip 实验一致，表明这种改良的 iChip 构建方式并未影响新颖物种回收率的提升¹¹。

图5：从iChip实验中获得的分离物的分类学分类水平。 相似性百分比基于四联Z分数（tetra Z scores）确定，该分数用于描述分离物与已知细菌的相似程度，其中>99.9% 的相似性表示物种匹配，98.9%–99.9% 的相似性表示可能为新物种，<98.9% 的相似性表示为新物种或更高等级的分类单元。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

近年来，基因组挖掘和沉默生物合成途径研究等多种方法促进了新型生物活性化合物的发现^21,22。然而，通过这些方法发现的天然产物（NPs）通常与已知化合物具有较高的结构相似性。获取此前未培养的微生物将有助于释放更丰富的化学多样性，获得具有新颖作用机制的天然产物，从而更有效地应对微生物耐药性问题。iChip分离技术已被证明可提高新型微生物的可培养性，可用于构建微生物库，以促进新型天然产物的发现。

iChip 的最初概念构想发表于 2002 年，其结构由单个金属环组成，内含混有细胞的琼脂混合物，以半透膜密封后原位培养²³随后在2010年进行了改进，加入了一个带有多个小孔的微型芯片¹¹，随后在2017年发表于《自然-实验指南》的一项重要研究中，介绍了利用常见实验材料构建的一种低成本iChip⁹对本出版物中的《自然》实验方案进行了多项修改，以提高其实用性和操作便捷性。原《自然》实验方案涉及将半透膜粘合到两侧 与使用单侧粘合板盖的方法相比，芯片的两侧均存在此类问题。在iChip加载后使用硅胶粘附膜时可能会出现问题。据我们所知，所有无毒的硅酮胶在固化过程中都会释放乙酸，这可能影响细胞活力²⁴本视频中所述方案通过使用PCR板盖密封已加样完毕的微孔板，显著减少了接种后的操作步骤，进一步确保了无菌性并缩短了准备时间。根据本实验鉴定出的多个新分离株可知，仅使用单层半透膜确实会抑制因采用双半透膜结构iChip而报道的新型微生物发现率的提升。然而，要量化这一影响，还需开展样本量更大的后续实验。

另一种方法改进是仅从改良的 iChips 中进行传代培养，这些 iChips 的孔中生长的菌落少于 25%。如果某块平板的大部分孔中均有菌落生长，则很可能存在一些孔中含有多种微生物，即使这些情况不易被观察到。在方法开发过程中发现，从含有一个以上菌落的孔中进行传代培养时，几乎无法获得无菌培养物。获得非无菌培养物会在后续的生物活性检测和菌种鉴定中带来严重问题。因此，为简便起见，建议仅对菌落生长局限于部分孔中的改良 iChips 进行传代培养。

使用iChip方法时可能出现的最重要问题是小室或整个iChip被其他微生物污染。若在对照小室中出现菌落生长，或在多个小室或改良iChip的某一区域中出现同一种微生物生长，则表明存在污染。污染来源可能是制备过程中材料灭菌不充分，或无菌操作技术不当。在此情况下，应确保所用所有材料均按照方法所述经过高压灭菌或乙醇灭菌，并确保除琼脂-细胞混合物外，任何非无菌物品均不与改良iChip接触。若在多个改良iChip小室的底部或顶部观察到单一微生物的过度生长，则极有可能是由于小室与膜之间密封不完全所致。此时，应确保所用粘合剂为100%硅胶材质（在乙醇中不会降解），并在构建过程中确保半透膜与PCR板盖在每个小室周围完全密封。

本方案中使用的稀释系列对于大多数土壤类型而言，在储存时间少于一周的情况下应已提供足够的稀释范围，因其涵盖了高达一千倍的稀释梯度。然而，不同土壤类型之间的微生物数量可能存在显著差异。如果对照孔中无任何生长，但在所有四个改良iChips的每个孔中均观察到多个菌落生长，则说明所用的细胞浓度仍然过高，应调整稀释系列，以在用于接种改良iChips的细胞-培养基混合物中达到更低的细胞浓度。类似地，如果在这些平板中均未观察到任何生长，则应提高细胞-培养基混合物中的浓度。另外，也有可能是所用培养基的温度过高，导致微生物无法存活；在此情况下，应在培养基尚未凝固的前提下，尽可能使其冷却后再加入稀释的细胞悬液。

该技术是克服“大平板计数异常”问题的重要进展。然而，由于传统培养技术的局限性，该方法仍存在不足，这一点可从大量微生物在从改良的iChip转移至传统琼脂平板后无法存活的情况中得到印证。先前的研究报道表明，通过在iChip中进行多轮继代培养和孵育，可进一步提高微生物的可培养性。在iChip的琼脂中延长驯化时间并暴露于土壤生长因子，能够增加菌落在单独使用琼脂培养基上生长的可能性。然而，已有研究尚未证实该方法比单次iChip孵育更能提高获得新型微生物的概率^25,26。

目前，人们正在探索和改进多种其他策略，以提高新型微生物的可培养性。例如，有研究提出将整个iChip装置完全由半透性材料制成，以促进相邻小孔中微生物的共培养²⁷。尽管如此，本文所述构建方法的一个优势在于其成本低廉，制造一块装置的成本约为12美元（每块96孔板4美元，每张膜8美元，每张PCR盖2美元）。此外，其结构简单，按照本文描述使用时操作简便，并为多种定制化应用提供了广泛的可能性。尽管本实验方案采用的是选择性培养细菌的培养基，但从理论上讲，通过更换所用培养基，例如使用抑制细菌生长的培养基来靶向真菌，或使用低营养琼脂培养产孢微生物，该实验体系可被调整以针对特定的微生物类群。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1-20 µL 移液器吸头	VWR	76322-158	每包 768 个
0.2 mL PCR 管	ThermoFisher Scientific	AB0337	每箱 1000 个
0.5-5 mL 单通道移液器	VWR	CA11020-004
1 L 玻璃瓶	Millipore Sigma	CLS13951L	必须可高压灭菌。
100 x 15 mm 培养皿	VWR	25384-342	每箱 500 个
100% 硅胶密封剂	Marineland	31003
1000 µL 多通道移液器吸头	ThermoFisher Scientific	9401113	每箱 960 个
100-1000 µL 移液器吸头	VWR	76322-164	每包 768 个
100-1000 µL 单通道移液器	VWR	76169-240
100-1200 µL 多通道移液器	ThermoFisher Scientific	46300800	必须具备 360 µL 的体积容量。
1-10 µL 单通道移液器	VWR	76169-232
1-5 mL 移液器吸头	VWR	CA11020-008	每包 500 个
15 mL 无菌离心管	VWR	CA21008-918	每箱 500 个
16S rRNA-F 引物（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）– 10 mM	Integrated DNA Technologies	51-01-19-06	10 µg
16S rRNA-R 引物（ACGGCTACCTTGTTACGACTT）– 10 mM	Integrated DNA Technologies	51-01-19-07	10 µg
4 mm 打孔器	VWR	470121-860
50 mL 无菌离心管	VWR	CA21008-940	每箱 500 个
95% 乙醇	Thermo Fisher Scientific	A412-500	500 mL
96 孔板	VWR	10062-900	每箱 100 块
高压灭菌器	Cole-Parmer	UZ-01850-34	8 L，115 VAC
细菌学琼脂	ThermoFisher Scientific	443570010	1 kg
收纳盒	Thomas Scientific	1216H91	每包 5 个
酪蛋白氨基酸	ThermoFisher Scientific	223120	500 g
酪蛋白水解物	ThermoFisher Scientific	211610	500 g
电泳级琼脂糖	Thermo Fisher Scientific	J66501.30	250 g
iBright FL1500 成像系统	ThermoFisher Scientific	A44115
层流罩	CleanTech	1000-6-A
MinION 纳米孔测序仪	Oxford Nanopore Technologies	MinIon Mk1C
NanoDrop One/One 微量紫外-可见分光光度计	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W
无核酸酶水	Thermo Fisher Scientific	AM9937	10 x 50 mL
Nucleobond HMW DNA 试剂盒	Takara	740160.2
纸巾	VWR	89402-824
Phusion Green Hot Start II 高保真 PCR 预混液	Thermo Fisher Scientific	F566L	500 次反应
马铃薯淀粉	ThermoFisher Scientific	419690025	2.5 kg
QIAGEN CLC Genomics Workbench 软件或类似软件	Qiagen
Rapid Barcoding 24 试剂盒	Oxford Nanopore Technologies	SQK-RBK114.24
SimpliAmp 梯度 PCR 仪	Applied Biosystems	A24811
带针头的无菌接种环	VVWR	76534-512	每箱 1000 个
无菌手术刀片	VWR	76457-444
SYBR Safe 或类似染料	ThermoFisher Scientific	S33101
UltraPure 琼脂糖	ThermoFisher Scientific	16500-500
涡旋振荡器	VWR	76549-928	必须可容纳 15 mL 和 50 mL 离心管
VWR 立体变焦三目显微镜	VWR	89404-476
Whatman Nuclepore 径迹蚀刻膜	Millipore Sigma	WHA113502	长 × 宽 8 英寸 × 10 英寸，孔径 0.03 μm