本文介绍了一种建立糖尿病心肌病小鼠模型的方案，以及一种用于小鼠电针治疗的小鼠电针固定装置，该装置可在治疗过程中更温和地固定小鼠。
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方法文章
糖尿病心肌病小鼠模型电针预处理用小鼠电针固定装置的制作
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摘要
摘要
糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病的一种并发症，可进展为心力衰竭，目前主要依赖药物治疗。电针作为中医外治法的一种，是治疗糖尿病心肌病的有效手段。小鼠电针固定装置可简便、温和地固定小鼠，便于在电针治疗过程中暴露其腹部和四肢的穴位。本文详细描述了该小鼠电针固定装置的制作方法，包括全部步骤和注意事项，并采用综合措施建立糖尿病心肌病小鼠模型，全面记录血糖等血液生化指标的变化。实验共设3组：对照组、模型组和预处理组，每组10只小鼠。预处理组采用标本配穴电针进行干预，每两天一次，共7次。电针治疗后，预处理组小鼠血糖水平下降，糖尿病相关症状减轻。
引言
糖尿病性心肌病（DCM）是糖尿病的一种常见并发症，其特征是心脏结构以及心室舒张和收缩功能发生特定病变的改变，可进一步发展为心力衰竭。它是糖尿病患者死亡的主要原因之一1,2，近年来其发病率不断上升，已引起广泛关注3。研究发现，该疾病的发病机制主要包括胰岛素抵抗、炎症反应、脂质代谢异常、氧化应激以及线粒体损伤4,5。
目前，糖尿病心肌病的临床治疗主要依赖口服药物来控制血糖并缓解心脏病症状，但存在一定局限性，例如药物不良反应、对肾功能的影响以及长期用药依赖性6。针灸作为中医外治法之一，对糖尿病心肌病患者的血糖、血脂及炎症反应具有良好的调节作用，临床疗效显著7。针灸对胃肠功能和肾功能无不良影响，且长期治疗不会产生依赖性。标本穴位理论是传统针灸理论中选穴与用穴的重要方法之一8。该理论将能够改善疾病症状的穴位定义为“标”穴，而能够调节与疾病相关的机体基本功能、治疗疾病根本原因的穴位称为“本”穴。同时针刺“标”穴与“本”穴，可达到治疗疾病、增强机体抗病能力、防止病情加重和复发的目的9。它能够预防疾病的进一步恶化和复发。现代研究已证实，依据标本穴位理论进行针灸治疗对糖尿病及其多种并发症均有效，包括糖尿病性心脏病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病足等10,11。一种符合标本穴位理论的选穴方案是：选取PC6（内关），其可调节心脏功能、改善炎症反应，作为“标”穴12；选取ST36（足三里），其可改善血糖水平、缓解胰岛素抵抗、降低氧化应激，作为“本”穴13。
动物模型是研究糖尿病心肌病的重要工具，因为已有实验证实，大鼠或小鼠模型能够很好地模拟糖尿病心肌病引起的心脏结构异常和功能改变，并可提供进行糖尿病心肌病生化检测指标所需的样本14,15。采用高糖高脂饲料联合链脲佐菌素（Streptozotocin）溶液诱导小鼠，可在4–5周内成功建立糖尿病模型，有效缩短建模时间，提高成模率，且对饲养环境无特殊要求16,17。糖尿病心肌病是一类由持续高血糖导致心肌结构与功能损伤而引起的心肌病。随着病程延长，糖尿病模型在长期高血糖状态下可自然发展为糖尿病性心脏病模型18,19,20。针灸预处理是指在糖尿病形成后、明显心肌损伤出现前对小鼠进行的干预处理。然而，经过反复实验刺激后，小鼠常出现活动增多、难以固定的情况，刺激性的实验操作技术可能导致小鼠受伤，或引发躁狂、抑郁等行为变化21。因此，需要一种合适的固定小鼠的方法。常用的小鼠固定方法包括麻醉法和绑缚法22。尽管麻醉法能更好地暴露穴位，但可能影响神经传导，最终干扰实验结果。绑缚法是一种物理固定方式，不会产生与麻醉相同的生理效应，但被束缚的小鼠易产生应激反应，难以配合操作22,23。此外，针具也难以准确到达目标位置。本文介绍一种小鼠电针固定装置，可在电针治疗过程中确保小鼠不移动，同时充分暴露穴位，从而实现方便、安全、非暴力且无后遗症的电针治疗。
本文详细描述了小鼠电针固定装置的制备以及糖尿病心肌病小鼠模型的建立。我们采用标本配穴电针预处理治疗糖尿病心肌病，演示了在小鼠固定装置上如何实现操作，并通过检测糖脂代谢相关指标，评估标本配穴电针预处理对糖尿病心肌病的治疗效果。
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方案
所有动物实验均遵循动物伦理的3R原则，并已通过湖北中医药大学动物实验伦理委员会审查批准（伦理批件号：HUCMS00309300）。本实验所用30只SPF级小鼠购自湖北省疾病预防控制中心（质量合格证号：42010200009690）。
1. 电针固定装置的制备
- 组装电针固定装置时，准备一根透明亚克力中空塑料管和一台电针治疗仪作为主体（图1A）。在塑料管中保留管体，并在两端开口处准备用于封闭的端盖。在中空管两端中心位置开槽，并使用可手动旋转的螺丝将端盖固定在两端的槽内。
- 在中空管的中部，制作三个长约2 cm、宽约1 cm的椭圆形孔，彼此相邻分布。两侧的孔用于拉出小鼠前肢以固定，以便对前肢进行电针治疗；中间的孔可用于暴露小鼠胸腹部区域的穴位，以便对胸腹部区域进行电针治疗。
- 在中空管的一端，于中心槽两侧对称位置各开一个椭圆形孔，可用于拉出小鼠后肢，以便对后肢进行电针治疗（图1B）。
- 检查中空塑料管的完整性，并安装端盖。通过螺丝在槽内滑动，调节管体内部端盖的位置，确保可调整固定长度以适应不同体型小鼠的长度。
- 打开电针治疗仪，确认设备正常运行。每个按钮可通过按压一次进行调节（图1C）。
- 将电针治疗仪放置在中空塑料管旁，用于对小鼠实施电针治疗。该电针治疗仪由电针治疗主机和多对导电夹组成；每对导电夹可提供两个电极输出。
- 使用导电夹夹持针柄进行通电时，应使用一个夹子固定针具。
- 电针治疗主机共有11个按钮。上方5个按钮从左至右分别用于设置电针的频率、时间、连续波、疏密波和断续波；下方6个按钮用于设置电针的电流强度。每个按钮下方均设有卡槽，可用于固定导电夹；导电夹的数量可根据实验中小鼠数量增减，最多可连接6对。
2. 建立糖尿病心肌病小鼠模型
- 采用随机数字表法将30只小鼠分为3组：对照组、模型组和预处理组，每组10只小鼠。对模型组和预处理组共20只小鼠进行糖尿病心肌病模型的建立。对预处理组小鼠实施表本穴位电针治疗。
注：该模型构建周期较长，显著的心肌病通常在16周后出现。本实验的治疗时间为第36天至第70天（第6周至第10周），选择在糖尿病建立后、显著心肌损伤发生前进行干预。在第6周结束时取小鼠心脏发现已出现明显糖尿病心肌病，因此该时间点的干预属于预处理范畴。 - 对照组小鼠给予普通饲料喂养16周；模型组和预处理组小鼠给予高脂高糖饲料喂养16周，以诱导接近糖尿病状态的代谢表型。高脂高糖饲料成分为：67.0%标准饲料、10.0%猪油、2.5%胆固醇、20.0%蔗糖和0.5%胆盐。
- 通过腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin）溶液建立小鼠糖尿病心肌病模型。
- 在第29天配制150 mg/kg的链脲佐菌素溶液。将链脲佐菌素溶解于由柠檬酸与三钠柠檬酸盐配制的缓冲液中（pH = 4.4）。
- 第29天禁食不禁水12小时，随后对每只小鼠进行一次腹腔注射150 mg/kg链脲佐菌素溶液（也可采用连续5天每日腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素溶液的方式）。
- 用右手抓住小鼠尾巴，将其从笼中取出。将小鼠置于笼面，轻拉其尾巴使其固定。用左手固定小鼠并翻转使其腹部朝上，暴露腹腔区域。
- 用右手持已抽取适量链脲佐菌素溶液的1 mL注射器，对小鼠进行腹腔注射。注射后密切观察动物状态，并根据需要补充葡萄糖。
- 实施表本穴位针刺治疗。
- 根据表本穴位理论13选取双侧PC6和ST36穴位。对预处理组小鼠于第36天开始治疗，隔日一次，共治疗18次，总疗程为5周（从第36天至第70天；图2）。
- 表穴：选取双侧PC6作为表穴；PC6位于前肢内侧，尺骨与桡骨缝合线之间，距腕关节约3 mm处。本穴：选取双侧ST36作为本穴；ST36位于膝关节后外侧，腓骨小头下方约2 mm处。
- 抓握小鼠，捏住其尾巴，将其置于笼面。将亚克力空心塑料管口保持与水平面成30°角，管中心小孔朝下，管口对准小鼠头部。
- 引导小鼠头部进入管口。通过小鼠自主运动并辅以轻微推动，缓慢将其头部旋入管内。轻拍小鼠臀部，使其自主完全爬入管中。
- 调整封闭卡扣，将小鼠尾巴从凹槽中拉出，拧紧螺母，并利用上下两端的卡扣限制小鼠活动。此时小鼠在管体内无法自由移动。
- 使用镊子从两侧四个小孔中轻轻拉出小鼠四肢，待四肢完全伸出后，将其轻柔固定于管体外侧。此时小鼠四肢位置固定，不再发生位移。
- 用右手拇指和食指持一次性不锈钢针针柄（0.3 mm × 13 mm），左手固定亚克力管及其中的小鼠。
- 用右手无名指触诊定位PC6和ST36穴位，随后用无菌针尖轻刺小鼠皮肤。迅速以约3 mm深度斜刺进针，随即移开右手。
- 根据表本穴位理论13选取双侧PC6和ST36穴位。对预处理组小鼠于第36天开始治疗，隔日一次，共治疗18次，总疗程为5周（从第36天至第70天；图2）。
- 实施电针预处理
- 开启电针治疗仪，调节为断续波，频率1 Hz。每只小鼠进行15分钟电针治疗。
- 使用电针治疗仪配套的带电夹子夹住针柄，每个夹子连接一个针柄。
- 调节带夹子按钮的电流至1 mA（图3）。
- 持续15分钟，期间观察小鼠在电针预处理过程中的状态。
- 治疗结束后，松开夹子并拔出针具。调整封闭卡扣，将小鼠从电针固定装置中释放。
- 全面检查小鼠全身状况，观察是否存在损伤或其他异常。
- 在链脲佐菌素溶液注射后第7天开始，隔日进行一次针刺治疗，使用小鼠电针固定装置，在第36天至第70天期间共完成18次治疗。
- 在第112天（第16周结束时）终止实验。
- 通过腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉，并通过脚趾夹捏反应确认麻醉效果。使用超声心动图检测小鼠心脏功能。
- 记录左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）。
- 采用颈椎脱臼法处死小鼠。取出心脏，用生理盐水冲洗后浸入4%多聚甲醛中固定。
- 通过腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉，并通过脚趾夹捏反应确认麻醉效果。使用超声心动图检测小鼠心脏功能。
3. 苏木精-伊红（HE）染色
- 按照标准操作流程对心脏组织进行脱水、包埋、切片、脱蜡及苏木精-伊红（HE）染色。
- 在光学显微镜下观察小鼠心脏组织的病理学变化。
4. 小鼠观察
- 在第27天、第36天和第49天使用血糖仪测量血糖水平。
- 观察小鼠进食情况，每天定量记录其饮水量和排尿量，并记录体重变化。
5. 统计学分析
- 收集血糖数据，并使用单因素方差分析（ANOVA）确定统计学显著性。以 p < 0.05 为标准判定具有统计学显著性。
- 由对实验条件设盲的研究助手对数据进行量化。数据以均值 ± 标准差表示。
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结果
我们按照上述步骤建立了糖尿病心肌病小鼠模型。从苏木精-伊红染色图片（图4）中可以观察到，对照组小鼠的心肌组织结构完整，心肌细胞排列规则，无明显病变。模型组小鼠心肌细胞排列紊乱，部分心肌细胞出现损伤和崩解（黑色箭头），间质中可见明显的炎性细胞浸润（黄色箭头），提示模型组小鼠存在心肌损伤。预处理组小鼠的心肌组织结构清晰，心肌细胞排列轻度紊乱，少量心肌细胞出现损伤和崩解（黑色箭头），未见其他明显病变。相比之下，对照组小鼠心肌组织无明显病变，模型组心肌组织损伤更为严重，而预处理组心肌组织损伤程度显著低于模型组。这表明预处理干预可减轻心肌损伤。
超声心动图的心功能指标（图5）显示，与对照组相比，模型组小鼠的左心室舒张末期容积和左心室收缩末期容积显著增加，而左心室射血分数和左心室短轴缩短率则显著降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。提示模型组小鼠心肌收缩与舒张功能下降，心脏形态与结构异常24,...
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讨论
在本研究中，通过腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin）溶液，获得血糖水平升高并表现出糖尿病症状的小鼠，这是一种有效且公认的糖尿病动物模型构建方法27。根据标本穴理论，选取PC6作为标穴，ST36作为本穴28。这些穴位均位于小鼠四肢，因此可使用能够暴露腹部并固定四肢的亚克力管，便于对这些穴位进行针刺。将小鼠放入管体并固定后，针刺完成即开启电针仪进行电针治疗。可以观察到，接受电针治疗的局部肌肉出现轻微抖动，此现象属于正常反应，无不良反应。
针灸作为中医的重要治疗手段，可通过调节糖脂代谢和改善炎症反应来治疗糖尿病心肌病29,30。电针是针灸治疗中一种常用且可量化实施的方法，广泛应用于糖尿病心肌病的临床治疗31。电针以间断波的形式向针刺部位传递电信号，持续刺激穴位，从而增强针灸的治疗效果。本研究选取内关穴（PC6）作为标...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究受以下项目资助：湖北省自然科学基金联合项目（2022CFD024）；国家自然科学基金（No. 81704142）；湖北中医药大学2023年“双一流”建设重点专项科研项目（2023ZZXT005）；湖北省中医药管理局重点项目（ZY2025D001），用于研究标本配穴电针预处理对心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）大鼠心肌细胞铁死亡的调控机制；武汉市科技局知识创新项目（No. 2023020201010172）；湖北省时珍人才工程项目（鄂卫函〔2024〕256号）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙烯酸中空塑料 | Henan Zhike | ZK-GDQ | |
| 针灸针 | Hwato | 0.3 mm x 13 mm | |
| C57BL/6 小鼠 | 湖北省疾病预防控制中心 | ||
| 一水柠檬酸 | Sigma | C1909 | |
| 电针治疗仪 | Hwato | SDZ-V | |
| 电子天平 | Henan Zhike | ZK-DST | |
| 血糖仪 | LifeScan | OneTouch VerioVue | |
| 血糖试纸 | LifeScan | OneTouch Verio | |
| 链脲佐菌素 | Sigma | S0130 | |
| 二水合柠檬酸三钠 | Sigma | W302600 | |
| 镊子 | Labshark | 130302001 |
参考文献
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