通过免疫染色对小鼠视网膜血管周细胞进行 3D 可视化

摘要

眼眶后注射荧光番茄凝集素后，用血小板衍生生长因子受体β免疫荧光染色检查视网膜脉管系统中的周细胞。标记的视网膜进一步用组织透明化方法处理并安装整个，以便在共聚焦显微镜下可视化视网膜脉管系统周围周细胞的三维视图。

摘要

视网膜周细胞对于视网膜的血管发育和稳定性至关重要，在维持视网膜脉管系统的完整性方面起着关键作用。为了提供周细胞形态学特征的详细视图，本研究描述了一种结合荧光剂眼眶后注射、免疫荧光染色和组织透明化处理的新方法。首先，将荧光番茄凝集素注射到活小鼠的眶后窦中，以标记视网膜脉管系统。5 分钟后，处死小鼠，小心地从视网膜杯中取出其完整的视网膜，并用血小板衍生的生长因子受体β进行免疫荧光染色以显示周细胞。此外，用组织透明化试剂处理染色的视网膜，并将其整个安装在显微镜载玻片上。通过这些方法，在透明视网膜中清楚地观察到视网膜脉管系统和周细胞。在共聚焦显微镜下，我们获得了更多拍摄高分辨率图像的机会，以便在三维视图中进一步重建和分析沿视网膜血管树的周细胞的形态特征。在方法上，该协议提供了一种有效的方法来可视化视网膜脉管系统内的周细胞，为它们在生理和病理条件下的作用提供了有价值的见解。

引言

视网膜周细胞沿着血管内皮细胞的腔侧嵌入基底膜内，显示出包裹在视网膜血管周围的短程突起的网状图案¹。周细胞和视网膜脉管系统之间的这种亲密接触有助于维持视网膜环境稳态²。尽管许多研究提供了视网膜脉管系统中周细胞的形态学证据，但我们对视网膜周细胞形态特征的大部分理解来自常规的组织学技术³。

根据这些研究，我们设计了这项研究，通过将传统的组织学技术与现代前沿科学方法相结合，有效地展示了视网膜微血管系统中周细胞的更多形态学细节。该方法整合了三种关键技术：在活小鼠中眶后注射荧光番茄凝集素、血小板衍生生长因子受体β免疫荧光染色 （PDGFR-β） 和基于溶剂的组织透明化策略。荧光番茄凝集素的眶后注射已被证明在体内和体外环境中观察小鼠视网膜脉管系统有效且可靠 ^4,5。PDGFR-β 可作为周细胞免疫荧光染色的常用生物标志物⁶.为了捕获较厚和完整视网膜内周细胞的高分辨率图像，组织透明化策略提高了组织学透明度 ^2,7,8。

虽然这些技术中的每一种都已单独应用于视网膜研究，但它们在研究小鼠视网膜脉管系统中周细胞的组合兼容性仍不确定。由于小鼠视网膜的平均厚度约为 180-220 μm⁹，因此未经透明化处理，在这种厚组织中进行抗体标记和共聚焦成像通常会导致高背景信号，使观察周细胞和血管之间的空间关系变得复杂¹⁰。通过此处描述的方法，我们的目标是提供一种简单的方法，在共聚焦显微镜下以三维 （3D） 视图可视化视网膜脉管系统内的周细胞。这种来自视网膜脉管系统中周细胞的增强细胞信息可以提高我们对视网膜环境稳态的理解，并强调血管保护的潜在策略，从而增强视网膜血管疾病的功能结果。

方案

在本研究中，使用了 3 只年轻成年雄性 C57BL/6 小鼠 （8-10 周龄，体重 20-25 g）。它们被安置在 12 小时的光照/黑暗循环中，控制温度和湿度，并允许自由获取食物和水。本研究经中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准（批准号：2023-03-14-04），并按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》（美国国家科学院出版社，华盛顿特区，1996 年）进行。

1. 体内眶 后注射荧光番茄凝集素

1. 腹膜内注射 50 mg/kg 戊巴比妥以麻醉小鼠。通过评估对脚趾捏刺激没有反应来评估麻醉深度。
2. 将鼠标放在右侧卧位中，头部朝左。
3. 用两根手指轻轻按压眶周区域，露出小鼠的左眼，以便最轻松地注射到动物的左眶后窦^{中 11}。
4. 使用配备 1G 针头的 27 mL 注射器轻轻刺入小鼠的眼眶静脉窦约 2-3 mm，针头上的斜面以 45° 角向前。
5. 将 0.1 mL （1 mg/mL） 荧光番茄凝集素注射到小鼠的眼眶静脉窦中。

2. 眼睛灌注和眼球剜除术

1. 眼眶后注射后 5 分钟，腹膜内注射三溴乙醇溶液 （250 mg/kg） 以深度麻醉小鼠。随后，通过放血和心脏灌注对动物实施安乐死。呼吸停止后，用手术剪刀打开胸腔¹².
2. 一旦呼吸停止，用手术剪刀打开胸腔。提前对手术器械进行消毒，并在通风橱中作。使用 24G 针头，通过左心室心尖将其插入左心室 2 毫米。以 3 mL/min 的速率灌注加入 20 mL 0.9% 生理盐水，然后在 0.1 M 磷酸盐缓冲液 （PB，pH 7.4） 中加入 20 mL 4% 甲醛。
3. 将牺牲的鼠标侧放，用剪刀去除覆盖眼睛的皮肤。用剪刀和镊子摘除眼睛。
4. 切开视神经和周围组织，然后取出眼睛并转移到 12 孔板中，在 0.1 M PB 中的 4% 甲醛中后固定 2 小时。
5. 在 4 °C 下，在 0.1 M PB （pH 7.4） 中的 25% 蔗糖中冷冻保护组织，直到其沉到溶液底部。
   注意：由于眼组织在蔗糖溶液中脱水良好，因此视网膜可以更容易和完全地分离，从而促进随后的全面研究。

3. 视网膜解剖

1. 使用塑料巴斯德移液器将眼睛转移到含有 0.1 M PB （pH 7.4） 的培养皿中。
2. 用锋利的剪刀刺穿角膜边缘，剪开角膜和虹膜周围，然后丢弃。
3. 使用镊子去除晶状体和玻璃体液。然后，用细镊子将杯状视网膜从眼睛中心拉开。在干净的培养皿中用 0.1 M PB （pH 7.4） 冲洗视网膜。

4. 视网膜的免疫荧光染色和组织透明化

1. 小心地去除杯状视网膜，并将其在 2% Triton X-100 溶液中加入 0.1 M PB （pH 7.4） 在 4 °C 下孵育过夜。
2. 将视网膜转移到封闭溶液（0.1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0.2%叠氮化钠 + 10%正常驴血清）中，并在摇床上以 72 rpm 的速度在 4 °C 下旋转过夜。
3. 将视网膜转移到微量离心管中含有山羊抗 PDGFR-β （10 μg/mL） 一抗的溶液中，溶于稀释缓冲液（0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100 + 0.2% 叠氮化钠 + 1% 正常驴血清）中，并在摇床上在 4 °C 下旋转 2 天。
4. 在室温下用洗涤缓冲液（0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100）洗涤视网膜 2 次，然后将它们在摇床上于 4 °C 的洗涤缓冲液中过夜。
5. 第二天，将视网膜转移到微量离心管中，加入含有 1 mg/mL 驴抗山羊 488 二抗和 0.2 ng/mL 荧光核 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的混合溶液中，并在振荡器上以 72 rpm 的速度在 4 °C 下旋转 5 小时。
6. 在室温下，在含有洗涤缓冲液的 6 孔板中洗涤视网膜 1 小时，2 次。将视网膜保存在摇床上的洗涤缓冲液中，在 4 °C 下过夜。 按照步骤 5 进行成像和分析，以获得组织清除前的视图。
7. 将视网膜转移到组织透明化试剂中，并在振荡器上以 60 rpm 的速度在 37 °C 下轻轻旋转 1 小时。
8. 组织透明化处理后，在干净的培养皿中用 0.1 M PB （pH 7.4） 冲洗杯状视网膜。
9. 使用弹簧剪刀做 4 个径向切口，达到视网膜半径的大约 2/3，形成花瓣形状。
10. 将视网膜压平并安装在显微镜载玻片上，然后用一小块吸水纸去除任何多余的 PB。保持视网膜内部朝上放在载玻片上。
11. 用垫片圈住已安装的视网膜，并用新鲜的组织清除试剂和盖玻片填充间隙。

5. 成像和分析

1. 在组织透明化治疗之前（完成步骤 4.6 后）和之后获得视网膜的外部视图。
2. 使用全景组织切片扫描仪扫描标记视网膜的蒙太奇视图。使用 NA 为 0.08 的 2 倍物镜。
3. 通过配备以下物镜的共聚焦成像系统拍摄更高放大倍率的图像：NA 为 0.40 的 10 倍镜头和 NA 为 0.95 的 40 倍镜头。将共聚焦针孔设置为 152 μm（10 倍物镜）和 105 μm（40 倍物镜）。将图像捕获的空间分辨率设置为 1024 x 1024 像素（10 倍物镜）和 640 x 640 像素（40 倍物镜）。
4. 从标记的视网膜中捕获 50 张 2 μm 帧的图像（Z 堆栈）。在投影/地形模式下将所有图像集成到单个聚焦中。对于设置，请单击 设置起始焦平面 > 设置结束焦平面 > 设置步长 > 选择深度图案 > Z 系列的图像>捕捉。
5. 针对不同的荧光信号使用以下激发和发射波长捕获图像：499 nm 和 519 nm 处的绿色荧光信号;591 nm 和 618 nm 处的红色荧光信号;以及 401 nm 和 421 nm 处的蓝色荧光信号。
6. 通过将 Z 堆栈共聚焦图像导入分析软件，方法是选择“ 添加新表面”>选择“体积”设置>选择“源通道”>“调整显示”>“调整表面角度>快照”，从而在三维图案中重建图像。

结果

从整体视网膜的外观来看，与没有组织透明化的视网膜相比，使用组织透明化治疗的全身视网膜的组织透明度增加（图 1）。

对于全支架视网膜的组织学检查，通过眼眶后注射用荧光番茄凝集素将视网膜脉管系统标记为红色，视网膜周细胞用 PDGFR-β 显示为绿色（图 2、 图 3 和 图 4）。尽管在组织透明化前后可以在样品上观察到这种标记，但作为比较，组织透明化处理降低了视网膜样品的背景噪声（图 2）。该处理还使标记的视网膜周细胞和脉管系统在全景组织切片扫描仪（图 2）和激光扫描共聚焦显微镜（图 3）下更加清晰。

视网膜周细胞的渐变分布也沿视网膜维管树在这里得到证明（图 3）。从视网膜的中央部分到其外围区域，周细胞位于视网膜脉管系统的基底膜上，包括血管干和分支以及毛细血管（图3）。

基于上述观察，用来自透明视网膜样本的更高放大的 Z 堆栈图像进一步评估周细胞和视网膜脉管系统的空间相关性（图 4）。在图像处理系统的帮助下，我们进一步提供了 3D 视图，以证明周细胞以不同直径紧紧包裹在视网膜脉管系统周围（图 4）。图 4A0-D0 表示视网膜血管从最高到最低的分层分支。由于周细胞在毛细血管中分布更丰富，因此与图 4A0-C0 相比，图 4D0 中的 PDGFRβ 染色显示出更强的强度和信号。

与未经组织透明化治疗的小鼠视网膜相比（图 1A、 图 2A、 图 3A0-D0），目前的方法有效地减少了视网膜背景信号，用于证明来自整个视网膜的周细胞和血管之间的空间关系（图 1B、 图 2B、 图 3A1-D1）。

图 1：未经组织透明化处理和有组织透明化治疗的整个安装视网膜的光学透明度比较。 （A、B） 组织透明化处理前 （A） 和 （B） 后整个安装视网膜的外视图。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：未经组织透明化处理和有组织透明化处理的整个支架视网膜的视网膜周细胞和脉管系统的标记特征的比较。 （A、B） 在虚拟载玻片系统下拍摄 （A） 和 （B） 组织透明化处理之前和 （B） 整个支架视网膜的代表性蒙太奇视图。脉管系统为红色（荧光番茄凝集素），周细胞为绿色 （PDGFR-β），细胞核为蓝色 （DAPI）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：组织透明化处理前后视网膜周细胞沿视网膜血管树渐变的成像分辨率比较。 （A-D） 组织透明化处理前 （A0-D0） 和组织透明化处理后 （A1-D1） 标记视网膜的代表性图像显示了视网膜脉管系统周围周细胞的分布，按血管干 （A0， A1）、第一级分支 （B0， B1）、第二级分支 （C0， C1） 和毛细管 （D0， D1）。脉管系统为红色（荧光番茄凝集素），周细胞为绿色 （PDGFR-β），细胞核为蓝色 （DAPI）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：不同直径的周细胞与视网膜脉管系统的空间相关性。 （A-D）来自标记视网膜沿视网膜血管树的代表性高分辨率图像显示了视网膜脉管系统周围不同直径的周细胞分布，包括血管干 （A0， A1）、一级分支 （B0， B1）、二级分支 （C0， C1） 和毛细血管 （D0， D1）。A1-D1：重建面板 A0-D0 的相应图像，在三维视图中显示周细胞与不同直径视网膜脉管系统的空间相关性，并进一步展示面板 A1-D1 （箭头） 中局部区域的放大视图，带插图。脉管系统为红色（荧光番茄凝集素），周细胞为绿色 （PDGFR-β），细胞核为蓝色 （DAPI）。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

在这项研究中，我们详细介绍了使用眶后注射荧光番茄凝集素、使用 PDGFR-β 进行免疫荧光检查和溶剂型组织透明化来证明视网膜脉管系统中周细胞形态的技术过程。结果表明，这些技术与突出整个视网膜中的周细胞高度兼容。这些方法的结合提供了一种从详细的 3D 视角可视化视网膜脉管系统中周细胞的形态学特征的有效方法。

其中一项关键技术，即小鼠眼眶后注射，被证明是一种简单且最佳的血管标记剂递送方法，在观察小鼠视网膜脉管系统方面优于尾静脉和腹膜内注射方法^13,14。尽管通过眼眶后注射进行血管标记的原理和机制尚不完全清楚，但很明显，这种方法用荧光番茄凝集素稳健地标记视网膜脉管系统。荧光标记在组织化学处理和组织透明化过程中保持稳定。因此，除了用于体内成像外，用荧光番茄凝集素进行眼眶后注射可有效标记血管腔，为体外和离体组织学检查提供视网膜脉管系统的清晰视图。

为了标记视网膜周细胞，我们利用 PDGFR-β¹⁵ 进行免疫荧光染色。考虑到染色的视网膜在显微镜形态学检查下接受了组织透明化试剂的进一步处理以减少组织光散射，视网膜在染色溶液中孵育的时间更长，以增强抗体的渗透^16,17。

整个视网膜相对透明，可以概览视网膜脉管系统¹⁸。然而，由于其厚度的光散射，它限制了光的穿透和高分辨率成像¹⁹。在组织透明化技术的帮助下，可以从高分辨率角度观察整个视网膜中的周细胞^19,20。然而，这些方法尚未广泛应用于小鼠视网膜周细胞的研究。在这项研究中，基于溶剂的组织透明化方法显着增强了我们在视网膜脉管系统中可视化周细胞的能力，使我们能够使用激光扫描共聚焦显微镜获得高分辨率的 Z 堆栈图像。

沿微血管树分布的周细胞在视网膜毛细血管网络内血液的复杂时空分布中起着重要作用²²。它们高度可塑的形态和适应性收缩能力使周细胞成为在生理和病理条件下响应局部神经元活动调节毛细血管血流的理想选择²³。作为血-视网膜屏障或视网膜神经血管耦合的关键参与者，视网膜周细胞在维持新生血管形成、血管生成和白细胞迁移方面也受到关注²⁴。

作为技术限制，应记住，除了 PDGFR-β 外，其他标志物（如 NG-2 和 CD13）也已用于识别周细胞 22,24,25。因此，选择合适的周细胞特异性标记物来明确证明周细胞仍然是一个挑战。这项研究提供了进一步的证据，表明 PDGFR-β 是揭示周细胞形态特征的更好候选者。

综上所述，我们证明了荧光番茄凝集素的眶后注射、免疫荧光染色和组织透明化相结合能够获得高分辨率图像，揭示了生理条件下小鼠视网膜脉管系统中周细胞的详细形态。这些发现表明，该方法对于未来研究病理条件下视网膜周细胞的改变可能很有价值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	赛默飞世尔科技	D3571	光
Alexa Fluor 488 驴抗山羊 IgG （H+L）	赛默飞世尔科技	A-11055	光
C57BL/6 小鼠 北京	维塔尔河实验动物科技有限公司	SCXK （Jing） 2021-0006
共聚焦成像系统	奥林巴斯	FV1200
山羊抗 PDGFR->	研发	AF1042	25 & micro;g
Imaris 软件	牛津仪器	v.9.0.1
番茄凝集素，DyLight594	赛默飞世尔科技	L32471	1 mg
微量离心管	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
正常驴血清	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 mL
全景组织切片扫描仪	Olympus	VS120-S6-W
Photoshop 和  插图	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 溶液	SunJin Lab	RC152001	10 mL
六孔板	Costar	3335
弹簧剪刀	Fine Science Tools	15003-08
Superfrost Plus 显微镜载玻片	默飞世尔科技	4951PLUS-001	25 mm x 75 mm x 1 mm