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通过免疫染色法对小鼠视网膜血管周细胞进行三维可视化观察

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DOI：

10.3791/67436

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2024年11月1日

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1Department of Integration of Chinese and Western Medicine, School of Basic Medical Sciences, Peking University, 2Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

通过球后注射荧光番茄凝集素后，采用血小板源性生长因子受体β的免疫荧光染色检测视网膜血管中的周细胞。标记后的视网膜经组织透明化处理，并整体封片，以便在共聚焦显微镜下观察围绕视网膜血管的周细胞的三维结构。

摘要

视网膜周细胞对视网膜血管的发育和稳定性至关重要，在维持视网膜血管系统完整性方面发挥关键作用。为了详细观察周细胞的形态学特征，本研究描述了一种新方法，结合了眶后注射荧光试剂、免疫荧光染色以及组织透明化处理。首先，将荧光番茄凝集素注入活体小鼠的眶后窦，以标记视网膜血管系统。5分钟后处死小鼠，小心地从视杯中取出完整视网膜，并使用血小板源性生长因子受体β进行免疫荧光染色，以显示周细胞。此外，染色后的视网膜经组织透明化试剂处理，并整体封片于显微镜载玻片上。通过这些方法，可在透明化的视网膜中清晰观察到视网膜血管系统及周细胞。在共聚焦显微镜下，能够获得高分辨率图像，从而在三维视角下进一步重建和分析沿视网膜血管树分布的周细胞的形态学特征。从方法学角度而言，该实验方案为可视化视网膜血管系统中的周细胞提供了一种有效手段，有助于深入理解其在生理和病理条件下的功能作用。

引言

视网膜周细胞嵌于血管内皮细胞基底膜的远腔面侧，其短程突起呈网状结构包裹视网膜血管1。周细胞与视网膜血管系统的紧密接触有助于维持视网膜内环境的稳态2。尽管已有大量研究提供了视网膜血管中周细胞的形态学证据，但目前对视网膜周细胞形态特征的认识主要来源于传统的组织学技术3。

与这些研究一致，本研究旨在结合传统组织学技术与现代前沿科学方法，更有效地展示视网膜微血管中周细胞的更多形态学细节。该方法整合了三项关键技术：活体小鼠眶后注射荧光番茄凝集素、血小板源性生长因子受体β（PDGFR-β）免疫荧光染色，以及基于溶剂的组织透明化策略。研究表明，眶后注射荧光番茄凝集素在体内和体外观察小鼠视网膜血管系统方面均有效且可靠4,5。PDGFR-β是周细胞免疫荧光染色中常用的一种生物标志物6。为了在较厚的全层视网膜样本中获取周细胞的高分辨率图像，组织透明化策略可增强组织的光学透明度2,7,8。

尽管这些技术已分别应用于视网膜研究中，但它们联合用于小鼠视网膜血管周细胞研究的兼容性仍不明确。由于小鼠视网膜的平均厚度约为180–220 µm9，在未经透明化处理的此类厚组织中进行抗体标记和共聚焦成像常导致较高的背景信号，从而难以观察周细胞与血管之间的空间关系10。通过本文所述方法，我们旨在提供一种简便的技术，可在共聚焦显微镜下以三维（3D）视角清晰呈现视网膜血管系统中的周细胞。该方法所获得的视网膜血管周细胞更丰富的细胞信息，有助于加深对视网膜微环境稳态的理解，并凸显血管保护的潜在策略，从而改善视网膜血管性疾病的功能预后。

方案

本研究使用了三只年轻的雄性C57BL/6小鼠（8–10周龄，体重20–25 g）。小鼠饲养于温度和湿度受控的环境中，光照/黑暗周期为12小时，可自由获取食物和饮水。本研究经中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准（批准号：2023-03-14-04），并依照美国国家卫生研究院《实验动物护理和使用指南》（国家科学院出版社，华盛顿特区，1996年）进行。

1. 在体 眼后注射荧光番茄凝集素

  1. 以50 mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠。通过评估小鼠对脚趾夹捏刺激无反应来判断麻醉深度。
  2. 将小鼠置于右侧卧位，头部朝向左侧。
  3. 用两根手指轻轻按压眼周区域，使小鼠左眼暴露，以便于将注射物最方便地注入动物的左侧眶后窦11。
  4. 使用配有27G针头的1 mL注射器，针尖斜面朝前，以45°角轻轻刺入小鼠眶静脉窦约2-3 mm。
  5. 向小鼠眶静脉窦内注射0.1 mL（1 mg/mL）荧光番茄凝集素。

2. 眼睛的灌注与去核

  1. 经眶后注射5分钟后，通过腹腔注射三溴乙醇溶液（250 mg/kg）使小鼠深度麻醉。随后通过放血和心脏灌注处死动物。呼吸停止后，用手术剪打开胸腔12。
  2. 呼吸停止后，用手术剪打开胸腔。提前对手术器械进行灭菌，并在通风橱内操作。使用24G针头，从左心室心尖部插入左心室，插入深度为2 mm。以3 mL/min的速度先用20 mL 0.9%生理盐水灌注，随后用20 mL含4%甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）灌注。
  3. 将已处死的小鼠侧放，用剪刀去除覆盖眼睛的皮肤。使用剪刀和镊子摘除眼球。
  4. 剪断视神经及周围组织，然后取出眼球并转移至12孔板中，在含4%甲醛的0.1 M PB中后固定2小时。
  5. 在4 °C条件下，将组织置于含25%蔗糖的0.1 M PB（pH 7.4）中进行冷冻保护，直至组织沉降至溶液底部。
    注意：由于眼组织在蔗糖溶液中脱水效果良好，视网膜可更轻松且完整地分离，有利于后续全面研究。

3. 视网膜的解剖分离

  1. 使用塑料巴斯德吸管将眼球转移至含有0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）的培养皿中。
  2. 用锋利的剪刀刺穿角膜边缘，沿角膜和虹膜周围剪开，并弃去。
  3. 用镊子取出晶状体和玻璃体。然后用精细镊子从眼球中心将杯状视网膜剥离。在干净的培养皿中用0.1 M磷酸缓冲液（pH 7.4）冲洗视网膜。

4. 视网膜的免疫荧光染色与组织透明化

  1. 小心取出杯状视网膜，并将其在含2% Triton X-100的0.1 M PB缓冲液（pH 7.4）中于4 °C孵育过夜。
  2. 将视网膜转移至封闭液（0.1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0.2%叠氮化钠 + 10%正常驴血清）中，在摇床上以72 rpm于4 °C旋转孵育过夜。
  3. 将视网膜转移至含有山羊抗PDGFR-β一抗（10 µg/mL）的稀释缓冲液（0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100 + 0.2%叠氮化钠 + 1%正常驴血清）中，置于微量离心管内，在摇床上于4 °C旋转孵育2天。
  4. 在室温下用洗涤缓冲液（0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100）清洗视网膜2次，每次1小时，随后将其在洗涤缓冲液中于4 °C在摇床上继续孵育过夜。
  5. 次日，将视网膜转移至含有驴抗山羊488二抗（1 mg/mL）和荧光核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，0.2 ng/mL）的混合液中，置于微量离心管内，在摇床上以72 rpm于4 °C旋转孵育5小时。
  6. 在6孔板中用洗涤缓冲液于室温清洗视网膜2次，每次1小时；随后将其保留在洗涤缓冲液中，在摇床上于4 °C孵育过夜。按照步骤5进行成像与分析，以获得组织透明化前的图像。
  7. 将视网膜转移至组织透明化试剂中，在摇床上以60 rpm于37 °C轻轻旋转处理1小时。
  8. 组织透明化处理后，在洁净的培养皿中用0.1 M PB缓冲液（pH 7.4）冲洗杯状视网膜。
  9. 使用弹簧剪刀在视网膜上做4条放射状切口，切口长度约为视网膜半径的2/3，形成花瓣状结构。
  10. 将视网膜展平并贴附于载玻片上，用一小块吸水纸吸除多余的PB缓冲液，确保视网膜内表面朝上放置于载玻片上。
  11. 用间隔圈围绕固定好的视网膜，并在间隙中加入新鲜的组织透明化试剂，盖上盖玻片。

5. 成像与分析

  1. 在组织透明化处理前（完成步骤 4.6 后）和处理后，获取视网膜的外部视图。
  2. 使用全景组织切片扫描仪扫描标记后的视网膜拼接图像。采用数值孔径（NA）为 0.08 的 2x 物镜。
  3. 使用配备以下物镜的共聚焦成像系统获取更高倍率的图像：NA 为 0.40 的 10x 物镜和 NA 为 0.95 的 40x 物镜。将共聚焦针孔设置为 152 µm（10x 物镜）和 105 µm（40x 物镜）。图像采集的空间分辨率设置为 1024 × 1024 像素（10x 物镜）和 640 × 640 像素（40x 物镜）。
  4. 从标记的视网膜中以 2 µm 为步长采集 50 张图像（Z-stack）。在投影/地形模式下将所有图像整合为单一聚焦图像。设置时依次点击 Set Start Focal Plane > Set End focal plane > Set step size > Choose Depth Pattern > Image Capture > Z series。
  5. 使用以下激发和发射波长采集不同荧光信号的图像：绿色荧光信号为 499 nm 和 519 nm；红色荧光信号为 591 nm 和 618 nm；蓝色荧光信号为 401 nm 和 421 nm。
  6. 通过将 Z-stack 共聚焦图像导入分析软件，并依次选择 Add New Surfaces > Choose Volume settings > Choose Source Channel > Adjust display > Adjust Surface Angle > Snapshot，重建三维图像。

结果

从整体视网膜的外部观察来看，经过组织透明化处理的整装视网膜其组织透明度较未经透明化处理的视网膜有所提高（图1）。

为了对整体视网膜进行组织学检查，通过眶后注射使用荧光番茄凝集素将视网膜血管系统标记为红色，视网膜周细胞则通过PDGFR-β显示为绿色（图2、图3 和 图4）。尽管在组织透明化处理前后的样本中均可观察到该标记信号，但作为对比，组织透明化处理降低了视网膜样本的背景噪声（图2）。该处理还使得在全景组织切片扫描仪（图2）和激光共聚焦显微镜（图3）下，标记的视网膜周细胞和血管结构更加清晰。

此处还展示了视网膜周细胞在视网膜血管树上的渐变分布（图3）。从视网膜中央区域到周边区域，周细胞位于视网膜血管系统的基底膜上，包括血管主干、分支以及毛细血管（图3）。

基于上述观察结果，利用透明化视网膜样本的高倍Z轴层扫图像进一步评估了周细胞与视网膜血管之间的空间相关性（图4）。借助图像处理系统，我们进一步提供了三维视图，以展示周细胞紧密包绕在不同直径的视网膜血管周围（图4）。图4A0-D0展示了视网膜血管从最粗到最细的分级分支结构。由于周细胞在毛细血管中的分布更为丰富，图4D0中的PDGFRβ染色强度和信号强于图4A0-C0。

与未经组织透明化处理的小鼠视网膜相比（图1A、图2A、图3A0-D0），本方法有效降低了视网膜背景信号，从而清晰展示了整个视网膜铺片中周细胞与血管之间的空间关系（图1B、图2B、图3A1-D1）。

蒸发图案、可视化实验结果、液体在玻片上的沉积、对称设计。
图1：整体视网膜在未进行组织透明化处理与进行组织透明化处理后的光学透明度比较。（A, B）整体视网膜在组织透明化处理前（A）和处理后（B）的外部观。 请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜图像，植物叶片结构，绿色-红色荧光，细胞分析。
图 2：视网膜周细胞和血管系统在整体视网膜标本中经组织透明化处理前后标记特征的比较。（A, B）在虚拟切片系统下拍摄的整体视网膜标本在组织透明化处理前（A）和处理后（B）的代表性拼接图像。血管呈红色（荧光番茄凝集素标记），周细胞呈绿色（PDGFR-β），细胞核呈蓝色（DAPI）。请点击此处查看该图的高清版本。

微血管网络的显微成像；展示血管模式分析的实验。
图3：视网膜周细胞在视网膜血管树不同分支层级中，组织透明化处理前后成像分辨率的比较。 （A-D）来自标记后视网膜的代表性图像显示了围绕视网膜血管的周细胞分布情况，依次为血管主干（A0, A1）、一级分支（B0, B1）、二级分支（C0, C1）和毛细血管（D0, D1），其中A0-D0为组织透明化处理前的图像，A1-D1为处理后的图像。血管呈红色（荧光番茄凝集素标记），周细胞呈绿色（PDGFR-β标记），细胞核呈蓝色（DAPI染色）。请点击此处查看该图的放大版本。

微血管网络的3D可视化、共聚焦显微镜、血流分析、科学研究。
图4：不同直径下视网膜血管周围周细胞的空间相关性。（A-D）来自标记视网膜沿视网膜血管树的代表性高分辨率图像，显示围绕不同直径视网膜血管的周细胞分布情况，包括主干血管（A0, A1）、一级分支（B0, B1）、二级分支（C0, C1）以及毛细血管（D0, D1）。A1-D1：对应A0-D0图的图像被重建，以在三维视图中展示不同直径下周细胞与视网膜血管的空间相关性，并进一步在A1-D1图中展示局部区域的放大视图（箭头所示），插图为局部放大图。血管呈红色（荧光番茄凝集素标记），周细胞呈绿色（PDGFR-β），细胞核呈蓝色（DAPI）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究详细阐述了通过眶后注射荧光番茄凝集素、PDGFR-β免疫荧光检测以及基于溶剂的组织透明化技术，展示视网膜血管系统中周细胞形态的技术流程。结果表明，这些技术在整体装片视网膜中对周细胞的标记具有高度兼容性。这些方法的结合为从详细的三维视角可视化视网膜血管中周细胞的形态特征提供了一种有效的手段。

小鼠眶后注射是一种关键技术，已被证实是递送血管标记剂的简单且最佳方法，在观察小鼠视网膜血管系统方面优于尾静脉注射和腹腔注射方法13,14。尽管通过眶后注射实现血管标记的原理和机制尚未完全明确，但已有充分证据表明，该方法能够利用荧光番茄凝集素 robustly 标记视网膜血管系统。这种荧光标记在组织化学处理和组织透明化过程中均保持稳定。因此，除了可用于体内成像外，使用荧光番茄凝集素进行眶后注射 还能有效标记血管腔，为体外和离体组织学检查提供清晰的视网膜血管结构图像。

为了标记视网膜周细胞，我们采用PDGFR-β进行免疫荧光染色15。考虑到染色后的视网膜还需经过组织透明化试剂处理，以减少显微形态学观察中的组织光散射，因此将视网膜在染色液中孵育更长时间，以增强抗体的渗透性16,17。

整个视网膜铺片具有相对透明的特性，便于整体观察视网膜血管系统18。然而，由于组织厚度引起的光散射，限制了光线的穿透和高分辨率成像19。借助组织透明化技术，现已能够从高分辨率视角观察整个视网膜铺片中的周细胞19,20。然而，这些方法尚未被广泛应用于小鼠视网膜周细胞的研究。在本研究中，基于溶剂的组织透明化方法显著增强了我们对视网膜血管中周细胞的可视化能力，使我们能够利用激光扫描共聚焦显微镜获取高分辨率的Z轴层扫图像。

周细胞分布于微血管树中，在视网膜毛细血管网络内血液的复杂时空分布中发挥着关键作用22。其高度可塑的形态和适应性收缩能力使周细胞能够根据生理和病理条件下局部神经元活动的变化，有效调节毛细血管血流23。作为血-视网膜屏障或视网膜神经血管耦合的关键参与者，视网膜周细胞在新生血管形成、血管生成以及白细胞跨内皮迁移的维持过程中也受到广泛关注24。

由于技术上的局限性，需要注意的是，除了PDGFR-β之外，其他标志物如NG-2和CD13也已被用于鉴定周细胞22,24,25。因此，选择一种合适的周细胞特异性标志物以明确示踪周细胞仍是一个挑战。本研究进一步证明，PDGFR-β是揭示周细胞形态特征的更优候选标志物。

综上所述，我们证明了眼后注射荧光番茄凝集素、免疫荧光染色与组织透明化技术相结合，能够获取高分辨率图像，从而揭示小鼠视网膜血管周细胞在生理条件下的精细形态。这些结果表明，该方法可能对未来研究视网膜血管周细胞在病理条件下的改变具有重要价值。

致谢

本研究得到北京市自然科学基金（编号：7244480）、中国医学科学院创新基金（编号：CI2021A03407）、国家自然科学基金（编号：82004492）以及中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（编号：ZZ-YQ2023008、ZZ14-YQ-032、ZZ-JQ2023008、ZZ-YC2023007）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）赛默飞世尔科技D3571避光保存
Alexa Fluor 488 驴抗山羊IgG（H+L）赛默飞世尔科技A-11055避光保存
C57BL/6小鼠北京维通利华实验动物技术有限公司SCXK (京) 2021-0006
共聚焦成像系统奥林巴斯FV1200
山羊抗PDGFR-βResearch and DevelopmentAF104225 µg 
Imaris 软件牛津仪器v.9.0.1
番茄凝集素，DyLight594标记赛默飞世尔科技L324711 mg
微量离心管AxygenMCT-150-C1.5 mL
正常驴血清Jackson ImmunoResearch017-000-12110 mL
全景组织切片扫描仪奥林巴斯VS120-S6-W
Photoshop 和 IllustratorAdobeCS6
RapiClear 1.52 溶液森金实验室RC15200110 mL
六孔板Corstar3335
弹簧剪 Fine Science Tools15003-08
Superfrost Plus 显微镜载玻片赛默飞世尔科技4951PLUS-00125 mm x 75 mm x 1 mm

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