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骨骼肌间质细胞外囊泡的酶法分离

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DOI：

10.3791/67439

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2025年2月7日

 ,  ,  , 
1Regenerative Bioscience Center, Department of Animal and Dairy Science, College of Agricultural and Environmental Science, University of Georgia

本文内容

摘要

本方案旨在通过机械剥离、酶解离、过滤和差速超速离心法，从啮齿类动物肌肉组织中分离和纯化骨骼肌间质细胞外囊泡（SkM-EVs）。该方法具有良好的重复性和可靠性。所获得的SkM-EVs有助于研究肌肉稳态及肌肉相关疾病，并有望作为诊断生物标志物或治疗载体加以应用。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放的脂质双分子层包裹的纳米颗粒，用于运输蛋白质、RNA和DNA等生物活性物质，介导细胞间通讯。研究EV在肌肉稳态与疾病中的细胞间相互作用，有望加深我们对肌肉发育、再生及萎缩过程的理解。然而，目前分离骨骼肌来源EV（SkM-EVs）的方案在实现高纯度和高得率方面仍面临挑战，主要原因是难以在不破坏细胞膜的前提下有效地从肌肉组织中释放EV。本文介绍了一种高效的SkM-EV分离方案，包括机械剥离、酶解消化、过滤和超速离心等步骤。这些步骤经过优化，可增强EV从肌肉组织中的释放，获得高纯度的SkM-EVs。随后通过纳米流式细胞术、BCA蛋白定量分析和Western blot分析对分离得到的SkM-EVs的数量和质量进行表征。该方案有望为获取组织来源的EV建立一个可靠的平台，推动基础研究、疾病诊断及药物递送领域的发展。

引言

细胞外囊泡（EVs）是细胞释放到细胞外环境中的纳米级膜结合颗粒。这些EVs可通过被受体细胞摄取，传递核酸、蛋白质和脂质，从而调控多种信号通路。特别是来源于骨骼肌的EVs（SkM-EVs），已被证实可通过传递成肌调节性miRNA或转录因子，在肌肉退变、再生和生长过程中发挥重要作用1,2,3,4。随着对SkM-EV亚群及其特性的认识不断深入，这些囊泡在作为早期诊断生物标志物5,6以及神经肌肉疾病治疗靶点方面展现出广阔前景。这一快速发展的领域为病理机制研究和临床应用提供了令人期待的机遇。

目前关于骨骼肌细胞外囊泡（SkM-EVs）的研究主要集中于通过ex vivo培养后从细胞培养上清液中获取的EVs2,7,8，这引发了人们对细胞系在连续传代后靶细胞特性保真度的担忧，以及EVs特征在人工环境中易发生改变的问题。因此，有必要直接从肌肉组织中分离SkM-EVs，以避免ex vivo培养带来的影响，更真实地反映体内状态。尽管已有多种从肌肉组织中分离EVs的方法被建立9,10，但各研究在实验方案细节上仍存在显著差异，影响了结果的一致性和可比性。迫切需要建立一套标准化的SkM-EV分离与表征流程，以确保相关研究结果的可靠性。

基于骨骼肌的生理特性，我们建立了一种从啮齿类动物骨骼肌样本中分离和纯化骨骼肌来源细胞外囊泡（SkM-EVs）的实验方案，该方法结合了机械剥离、酶解消化、过滤以及差速超速离心技术。通过纳米流式细胞术、BCA 蛋白定量分析和 Western blot 检测等综合分析表明，该方案可在较短时间内稳定地获得高纯度和高产量的 SkM-EVs。该方法适用于多种状态下的骨骼肌样本，包括急性与慢性肌肉损伤模型。此外，经过适当优化后，该技术也可用于人类患者或其他动物模型的肌肉组织。标准化 SkM-EV 的分离流程对于确保 SkM-EV 质量的一致性至关重要，有助于对 EVs 的特征（如产量、粒径、携带物组成及功能）进行有效比较，并推动其作为诊断生物标志物的潜在应用，同时加深我们对 SkM-EVs 在多种生理与病理过程中作用机制的理解。

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方案

本方案通过机械剥离、酶解离、过滤和差速超速离心法从骨骼肌组织中分离细胞外囊泡（EVs）。该方法可用于分离单个或联合的啮齿类动物肢体肌肉群中的EVs，包括胫骨前肌（TA）、趾长伸肌（EDL）、比目鱼肌（SOL）、腓肠肌（GAS）和股四头肌（QUA）。动物实验已获得佐治亚大学机构动物护理与使用委员会批准，研究遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理与使用的指南。动物饲养于佐治亚大学动物与乳品科学系的动物设施中。本研究使用野生型（C57BL/6J）成年雄性小鼠，组织取自3月龄处死的小鼠。所用试剂与设备的详细信息见于 材料表.

1. 小鼠肌肉群的机械分离

  1. 用 CO 处死小鼠2，随后进行颈椎脱位（遵循机构批准的方案）。剃除后肢两侧的毛发。
  2. 将小鼠腿部固定于无菌培养皿中，使腿部前侧朝上（图1A).
  3. 使用解剖剪在小鼠踝关节外侧皮肤上做一个5 mm的小切口。
  4. 将剪刀的一侧刀刃小心插入切口，置于皮肤下方，但不得进入深层肌肉组织。随后，沿皮肤向上朝膝盖方向剪开，以延长切口长度。
  5. 用粗头镊子夹住切口处的皮肤，扩大切口直至肌肉可见。
  6. 定位胫骨外侧从膝部延伸至踝部的趾长伸肌11，并使用尖头镊子夹住并剥离覆盖在肌肉上的薄层结缔组织（图1B).
  7. 在踝关节附近，辨认胫骨前肌（TA）末端的两条肌腱：其中一条直接与TA肌肉相连，另一条为趾长伸肌（EDL）肌腱，较细小，位于TA肌腱外侧相邻位置。使用解剖剪将两条肌腱切断。
  8. 用粗头镊子夹住两条肌腱。然后，用另一把粗头或尖头镊子将肌腱分开，从而将趾长伸肌（TA）与趾长伸肌（EDL）分离。图1C).
  9. 用粗头镊子夹住新切断的肌腱提起跟腱（TA）。然后使用解剖剪在靠近膝关节处剪断跟腱，从而分离肌肉。重复此操作以分离趾长伸肌（EDL），并将两块肌肉置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存。
  10. 松开腿部，将小鼠翻转，使其背侧朝上。
  11. 腿部皮肤现已部分去除，使用解剖剪在踝关节附近剪开皮肤。然后用粗头镊子夹住皮肤并向上朝膝关节后方剥离，暴露腓肠肌（GAS）。
  12. 使用解剖剪在踝关节附近切断腓肠肌腱（GAS tendon）图1D).
  13. 用粗头镊子夹住腓肠肌（GAS）肌腱并向上提起，以暴露腓肠肌的下面。
  14. 在靠近膝关节处（GAS 仍保持连接的位置）的 GAS 下方找到细小的 SOL 腱。使用解剖剪切断 SOL 腱，导致 SOL 向上收缩（图1E).
  15. 用尖头镊子夹住切断的腓肠肌（SOL）肌腱，轻轻提起，从而将SOL从腓肠肌（GAS）的下方分离。
  16. 用解剖剪刀切断腓肠肌断端所连接的比目鱼肌末端，从而分离这两块肌肉。将比目鱼肌保留在冰上预冷的PBS中。
  17. 在靠近膝关节处切断股动脉，将其置于冰上的磷酸盐缓冲液中。
  18. 去除膝关节以下所列的四块肌肉后，将小鼠翻转，使腹侧面朝上。
  19. 如有需要，使用尖端粗糙的镊子进一步剥离皮肤，以暴露股外侧肌（QUA）。将小鼠腿部置于90°位置，使股外侧肌处于屈曲状态。使用解剖剪剪断靠近膝关节的肌腱。
    1. 通过在肌肉与骨骼之间进行切割，将股四头肌（QUA）与股骨分离，直至股四头肌仅由近端肌腱相连图1E然后，切断近端肌腱并移除股外侧肌。将股外侧肌置于冰上的磷酸盐缓冲液中。
  20. 确保肌肉离断后，胫骨和腓骨清晰暴露（图1F).
  21. 用 PBS 多次冲洗肌肉组织，以去除毛发和血液等污染物（图1G然后用纸巾轻轻擦干肌肉。使用分析天平称量肌肉重量，该数据将用于后续计算每克肌肉收集的EV含量。

2. 脱落肌肉组织块的酶解离

  1. 使用尖头镊子、碎屑镊子、手术刀或剪刀轻轻去除肌肉样本上的肌腱（图2A）。
  2. 去除肌腱后，沿肌纤维方向（从一端肌腱至另一端肌腱）用剪刀或手术刀将肌肉纵向切成厚度约为1 mm的肌肉块，以增加表面积与体积之比（图2B，C）。
    注意：切割过程中应尽量减少肌纤维的损伤。对于胫前肌（TA）、腓肠肌（GAS）和股四头肌（QUA）等较大的肌肉，相比趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌（SOL）等较小的肌肉，需进行更多切口，以确保所有肌肉样本的表面积与体积之比大致相等（图2D）。
  3. 为每只小鼠准备10 mL新鲜的消化酶缓冲液（DEB），并在使用前置于冰上保存。
    1. 配制DEB时，将2 mg胶原酶II酶溶解于1 mL含1%青霉素-链霉素溶液的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。混合后通过0.2 µm滤膜过滤溶液。
    2. 确保DEB的酶活性超过250单位。涡旋振荡DEB直至溶液充分混匀，且胶原酶II酶粉末不可见。
  4. 将肌肉组织分装成若干份，每份含20 mg肌肉组织，然后向每份中加入1 mL DEB，用于酶解离。
  5. 将DEB与肌肉组织的混合物置于摇床中，在37 °C、100转/分钟（rpm）的条件下孵育12小时（图2E）。

3. 过滤和低速离心以富集骨骼肌来源细胞外囊泡（SkM-EV）

注意：将制冷离心机设定为 4 °C 并运行至达到设定温度。所有需要的离心管和样品在使用前均应置于冰上保存。

  1. 完成酶消化步骤后，确保肉眼中不可见明显的肌肉块（图3A）。在冷藏离心前，从DEB-肌肉混合液中取出10 µL溶液，转移至0.2 mL离心管中，以备进行细胞活力检测。
  2. 准备并标记新的空的1.5 mL微量离心管。安装一个0.45 µm滤器，并取一个5 mL注射器，抽出活塞（请勿丢弃），将注射器接口旋入0.45 µm滤器的上端。将滤器放置好，使其下端插入新标记的空离心管中（图3D）。使用0.2 µm滤器过滤1x PBS缓冲液。
  3. 将混合液在4 °C条件下以1,000 x g离心10分钟，以沉淀任何残渣（图3B）。使用P200移液器将上清液（约1 mL）转移至注射器中（图3C、E）。
  4. 重新插入注射器活塞，缓慢推动上清液使其通过滤器，并收集到新标记的1.5 mL微量离心管中（图3F）。
  5. 再次取出活塞，用移液器将约200 µL的1x PBS加入注射器中。
  6. 重新插入活塞，缓慢推动200 µL的1x PBS通过滤器（图3G），以冲洗滤器中残留的上清液并收集至已标记的1.5 mL微量离心管中。
  7. 对其他样品管重复过滤过程，每个组织样品使用新的滤器。
  8. 过滤完成后，确保溶液透明，无残留肌肉块（图3H）。

4. 骨骼肌来源细胞外囊泡纯化的差速超速离心法

注意：将制冷离心机设定为 4 °C 并运行至达到设定温度。将所有需要的离心管和样品置于冰上，并准备好使用。

  1. 将过滤后的溶液转移至新的1.5 mL微量离心管中（适用于最高200,000 × g离心力）。用额外的1× PBS平衡所有微量离心管，确保体积相等，然后放入微型超速离心机中。
  2. 确认所有离心管体积相等后，盖紧管盖，并将离心管放入微型超速离心机的转子中进行平衡（图4A）。
  3. 打开微型超速离心机，设置运行条件为100,000 × g、4 °C，离心1小时（图4B）。
  4. 将装有离心管的转子放入微型超速离心机中，关闭盖子，并启动真空系统（图4C）。
  5. 当真空度达到2级时，按下启动按钮，等待离心过程完成（图4D）。
  6. 微型超速离心机运行结束后，点击真空按钮使离心腔重新加压，然后取出转子和离心管。将离心管保持在冰上，并直立放置，避免扰动沉淀物。
  7. 使用P200移液器小心吸除上清液，避免扰动沉淀物（图4E）。
  8. 弹出移液器吸头，然后在用P200移液器去除上清液后，向离心管中加入50 µL的1× PBS。对于GAS和QUA样品，可加入最多500 µL的1× PBS以促进溶解（图4F）。
  9. 使用P20移液器（若加入500 µL则使用P200移液器）轻轻吹打，重悬沉淀物，直至其完全分散且不可见。
  10. 盖紧离心管，短期储存（少于一周）置于4 °C，长期储存置于-80 °C，若样品将立即用于纳米流式细胞术、Western blot或其他检测，则将离心管放回冰上。

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结果

按照本方案，成功地从野生型小鼠的多种肌肉群中提取了骨骼肌细胞外囊泡（SkM-EVs），包括胫骨前肌（TA）、趾长伸肌（EDL）、比目鱼肌（SOL）、腓肠肌（GAS）以及股四头肌（QUA）。随后通过纳米流式细胞术对这些SkM-EVs进行了表征，其特征总结于表1。值得注意的是，仅从1 g肌肉组织中即可获得高达1.18e14 ± 4.86e13个SkM-EVs，粒子平均大小为73.93 nm ± 2.70 nm，中位粒子大小为72.55 nm ± 2.42 nm。粒径分布的方差为13.28 nm ± 1.71 nm（图5），完全符合公认的细胞外囊泡（EVs）定义12,13。

为确保分离得到的骨骼肌来源细胞外囊泡（SkM-EVs）的完整性，采用荧光原位生成膜探针MemGlow-488对SkM-EV样本中的脂质结构进行标记（图5

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讨论

该方案首先根据已有方案从小鼠后肢分离肌肉组织，或获取人死后肌肉组织16。随后的骨骼肌细胞外囊泡（SkM-EVs）分离步骤主要包括三个部分：温和酶消化组织以释放间质中的SkM-EVs，过滤和低速离心，以及超速离心。最后，采用多种技术对分离得到的SkM-EVs进行表征分析。

鉴于不同肢体肌肉在大小、肌纤维类型以及对外界刺激的抵抗能力方面存在显著差异17，本实验方案提供了从每一块单独肌肉中分离骨骼肌来源细胞外囊泡（SkM-EVs）的详细步骤，包括胫骨前肌（TA）、趾长伸肌（EDL）、比目鱼肌（SOL）、腓肠肌（GAS）以及股四头肌（QUA）。用于从小鼠体内分离肌肉组织并从这些肌肉组织中解离细胞的技术，借鉴自先前用于从成年啮齿类动物肌肉中分离完整肌纤维和干细胞的方法11,18。

随后，使用胶原酶对组织进行酶解消化，以松解细胞...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国防部W81XWH2210261项目（资助对象：Yao Yao）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.6 mL 微型离心管赛默飞世尔科技05-408-120
1.5 mL 微量离心管（C） Eppendorf5720411009
1.5 mL 微量离心管赛默飞世尔科技3448透明、有刻度、非无菌
BD 5 mL 注射器Becton Dickinson14-827-52 鲁尔锁紧头
细胞计数板，用于细胞计数仪的双腔室伯乐（Bio-Rad）145-0011
Centrifuge 5430REppendorf22620667
清洗液NanoFCM公司
胶原酶II沃辛顿生化公司LS004176
DPBS（10倍浓缩液）（无钙、无镁）CytivaSH30378.02最终使用稀释倍数为1x
DPBS/改良型（1x）CytivaSH30264.02
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Genesee Scientific25-500
E-POD 纯水远程分配器Millipore SigmaZRXSP0D01
FA-45-30-11 微型离心机转子Eppendorf05-401-503
Fisher Vortex Genie 2赛默飞世尔科技12-812
Flow NanoAnalyzerNanoFCM公司
Heratherm OGS60 通用程序烘箱赛默飞世尔科技51028112重力对流，2.3立方英尺，120伏
MemGlow-488 探针Cytoskeleton公司MG01-02
Millipak Special MilliporeMillipore SigmaTANKMPK02
青霉素-链霉素Gibco15070063
Pipet-Lite LTS 移液器 L-1000XLS+Rainin17014382
Pipet-Lite LTS 移液器 L-200XLS+Rainin17014391
Pipet-Lite LTS 移液器 L-20XLS+Rainin17014392
Pipette tips ER LTS 1000µL F 768G/8Rainin30808038
Pipette tips ER LTS 20µL F 960G/10Rainin30807966
Pipette tips ER LTS 200µL F 960G/10Rainin30807967
质控微珠NanoFCM公司
S110-AT 固定角转子赛默飞世尔科技4553911,000 转/分钟
S16 exo 65-155 nm 微珠NanoFCM 公司
剪刀SPI，美国
Sorvall mX 150+ 微型超速离心机赛默飞世尔科技50135641
TC 20 自动细胞计数仪Bio-Rad1450102
台盼蓝溶液康宁25-900-CI
镊子SPI，美国
VWR 15 mL 离心管Avantor89039-668
Whatman Puradisc 13 滤器Cytiva6782-13040.45 µm 孔径大小
野生型 C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室品系编号 #000664

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