热应激条件下利用多聚核糖体图谱检测翻译效率

摘要

本方案通过多聚核糖体分析，将与核糖体结合的转录组（即翻译组）分离为非多聚核糖体RNA和多聚核糖体RNA 拟南芥 通过蔗糖密度梯度离心法。该方法可检测热应激条件下翻译效率 拟南芥.

摘要

热应激下不同基因的翻译调控是植物适应环境的关键步骤。评估各类基因的翻译活性有助于我们理解植物抗逆性的分子机制，从而推动在全球气候变化背景下培育抗逆性更强作物的发展。本文介绍了一种通过多聚核糖体分析法评估热应激植物中翻译效率的详细方法。该流程分为三个部分：热应激处理、 拟南芥，利用多聚核糖体图谱进行翻译效率检测，以及根据图谱分离非多聚核糖体RNA和多聚核糖体RNA并计算翻译效率。第一部分 拟南芥 植物在受控的热胁迫条件下进行处理，以模拟环境中的逆境挑战。该处理包括将植物暴露于特定高温下持续规定时间，确保热胁迫诱导的一致性和可重复性。此步骤对于研究植物对热胁迫的生理和分子响应至关重要。第二部分涉及利用多聚核糖体分析（polysome profiling）检测翻译效率。通过蔗糖梯度离心法提取多聚核糖体，该方法根据mRNA的核糖体负载情况实现分离，从而可分析mRNA上的核糖体占据情况，揭示在胁迫条件下翻译调控的机制。第三部分从多聚核糖体和非多聚核糖体组分中分离RNA，并使用外参RNA（spike-in RNA）精确测定各组分中的RNA含量。通过比较正常条件与热胁迫条件下mRNA在上述组分中的分布，计算翻译效率。此外，利用与核糖体结合的RNA和总RNA进行定量实时荧光PCR（qRT-PCR），进一步评估特定基因的翻译活性。该方法专注于热胁迫的影响，为分析植物中翻译调控提供了一套详细的实验方案。 关键词：热胁迫，翻译效率，多聚核糖体分析，蔗糖梯度离心，RNA分离，外参RNA，qRT-PCR，植物，翻译调控

引言

翻译对于生物体从mRNA合成具有功能的蛋白质至关重要，它支持代谢和信号传导等基本细胞功能与生物过程，并使细胞能够响应环境胁迫。若缺乏翻译过程，细胞将无法产生维持生命所必需的蛋白质，从而影响其结构、功能和调控，进而危及生命的维持以及生物多样性的形成^1,2。因此，研究植物的翻译效率具有重要意义。翻译过程包含多个关键步骤：首先，在起始阶段，mRNA在起始因子（如真核生物中的eIFs）的协助下与核糖体结合，这些因子识别起始密码子（通常为AUG）。随后进入延伸阶段，携带特定氨基酸的转运RNA（tRNA）分子依次与核糖体结合，相邻氨基酸之间形成肽键，按照mRNA的序列逐步延长多肽链。最后，当核糖体遇到终止密码子（UAA、UAG或UGA）时，释放因子识别该信号并触发终止过程，使核糖体释放新合成的蛋白质。在整个翻译过程中，多种真核起始因子（eIFs）、延伸因子以及核糖体RNA协同作用，以确保翻译的准确性与高效性^3,4。

先前的研究表明，翻译后修饰在调控真核起始因子（eIFs）之间的相互作用中发挥关键作用，从而影响翻译效率。体外研究表明，酪蛋白激酶2（CASEIN KINASE 2, CK2）可磷酸化eIF3c、eIF5和eIF2β，增强它们彼....

方案

1. 热胁迫处理的 拟南芥 幼苗样品制备

1. 使用滴管将每个重复和每个处理条件下的250粒种子点播到置于不含蔗糖（pH 5.6）、添加1.2%植物凝胶的MS（Murashige和Skoog）基础培养基琼脂平板上的滤纸上。
   注意：在MS平板上种植幼苗时，需在平板上放置无菌滤纸，以防止幼苗根部深入培养基内部，便于后续取样。种子应点播在滤纸表面。为排除糖类对植物生长及实验结果的影响，建议使用不含蔗糖的MS培养基进行培养。
2. 用铝箔包裹含有已播种种子的MS平板以避光，并在4 °C下孵育2天，以诱导春化作用。
3. 将完成春化的种子转移至生长室，在22 °C条件下培养，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，光照强度为100 µmol/m²/s。
4. 对于热胁迫处理样本，用防水胶带密封含有5日龄幼苗的MS培养基平板，并将其置于40 °C水浴中处理1小时。
5. 对于热处理后恢复阶段的样本，在热处理结束后立即对平板进行降温，随后将其置于22 °C的生长室中恢复2小时。
6. 将经处理或未处理的250株幼苗收集至1.5 mL微量离心管中，每个重复一组，并立即用液氮速冻保存。
   注意：每种处理条件下准备两组样本，一组用于多聚核糖体图谱分析，另一组用于非多聚核糖体和多聚核糖体RNA的提取。

结果

拟南芥野生型 Col-0 在 MS 培养基上于 16 小时光照：8 小时黑暗的光周期条件下培养。对照组使用未经热胁迫处理的 5 日龄幼苗。热胁迫组在预热的水浴中于 40 °C 处理 1 小时，而恢复组在热处理后立即置于 22 °C 环境中恢复 2 小时。通过采用不同的热处理条件和恢复条件，我们可利用后续步骤测定其翻译效率。

在进行RNA提取之前，必须首先制备蔗糖梯度。为了根据非多聚核糖体RNA与多聚核糖体RNA的密度差异对其进行分离，我们配制了蔗糖浓度分别为12.5%、24.4%、36.3%、48.1%和60%的梯度溶液。然后从高浓度到低浓度依次加样，从底部开始加载（图1A）。随后，可利用该梯度将低密度的非多聚核糖体RNA分离至上方层，而高密度的多聚核糖体RNA则分布于蔗糖浓度较高的下层。从经处理或未处理的Col-0材料中提取非多聚核糖体和多聚核糖体RNA。为防止溶液中的颗粒物影响多聚核糖体分析结果，含RNA的溶液应通过细胞滤筛过滤，以获得无颗粒的提取液。将过滤后的上清液加载至预先制备好的蔗糖梯度中并进行.......

讨论

本方案概述了一种测量拟南芥幼苗翻译效率的简单且标准化的方法。该方案的关键步骤包括通过二次离心和RNA提取试剂确保RNA的稳定性，以及蔗糖梯度的精细制备。此外，我们提供了利用外源添加RNA（spike-in）标准化方法对非多聚核糖体RNA和多聚核糖体RNA进行归一化与定量的关键操作步骤。所有操作均必须在冰上进行，并使用无RNase的缓冲液和工具。同时，务必准确配制蔗糖浓度，并尽量减少振荡，以降低对梯度的干扰。在以往的研究^24,25,26中，对胁迫响应的研究主要集中在转录水平和表型分析。通过多聚核糖体图谱分析，我们能够进一步探究植物在胁迫或其他环境刺激下翻译过程的调控机制。

理解翻译过程不仅需要进行多聚核糖体谱型分析实验，还需结合叠氮高丝氨酸（Azidohomoalanine, AHA）标记实验。AHA标记用于研究蛋白质合成及翻译活性²⁷。该方法利用AH.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	Labcon	3012-870-000-9	RNA 提取
13.2 mL 离心管	Beckman Coulter	331372	超速离心
溴酚蓝	Honeywell	32712	多聚核糖体图谱
氯仿	Honeywell	32211	RNA 提取
环己酰亚胺（CHX）	Sigma-Aldrich	SI-C7698	多聚核糖体图谱
焦碳酸二乙酯（DEPC）	Sigma-Aldrich	D5758	RNA 提取
乙醇	Sigma-Aldrich	32221	RNA 提取
GeneChip 真核生物 Poly-A RNA 对照试剂盒	Invitrogen	900433	标准化
甘油	Honeywell	15523	标准化
肝素	Sigma-Aldrich	SI-H3149	多聚核糖体图谱
HiScript III RT SuperMix for qPCR 试剂盒	Vazyme	R323-01	标准化
KCl	J.T.Baker	3040-01	多聚核糖体图谱
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	多聚核糖体图谱
MS 基础培养基	Phyto	M524	植物培养
Peak Chart 注射泵	Brandel	SYN4007LS	多聚核糖体图谱
聚氧乙烯-10-十三醇醚（PTE）	Sigma-Aldrich	P2393	多聚核糖体图谱
RNasin	Promega	N251B	多聚核糖体图谱
脱氧胆酸钠（DOC）	Sigma-Aldrich	SI-D6750	多聚核糖体图谱
蔗糖	Sigma-Aldrich	S5391	多聚核糖体图谱
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	标准化
TRI 试剂	MRC	TR118	RNA 提取
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	多聚核糖体图谱
超速离心机	Beckman Coulter	Optima L-100K	超速离心
紫外/可见光检测器	Brandel	UA-6	多聚核糖体图谱