本方案通过多聚核糖体分析，将与核糖体结合的转录组（即翻译组）分离为非多聚核糖体RNA和多聚核糖体RNA 拟南芥 通过蔗糖密度梯度离心法。该方法可检测热应激条件下翻译效率 拟南芥.
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摘要
摘要
热应激下不同基因的翻译调控是植物适应环境的关键步骤。评估各类基因的翻译活性有助于我们理解植物抗逆性的分子机制，从而推动在全球气候变化背景下培育抗逆性更强作物的发展。本文介绍了一种通过多聚核糖体分析法评估热应激植物中翻译效率的详细方法。该流程分为三个部分：热应激处理、 拟南芥，利用多聚核糖体图谱进行翻译效率检测，以及根据图谱分离非多聚核糖体RNA和多聚核糖体RNA并计算翻译效率。第一部分 拟南芥 植物在受控的热胁迫条件下进行处理，以模拟环境中的逆境挑战。该处理包括将植物暴露于特定高温下持续规定时间，确保热胁迫诱导的一致性和可重复性。此步骤对于研究植物对热胁迫的生理和分子响应至关重要。第二部分涉及利用多聚核糖体分析（polysome profiling）检测翻译效率。通过蔗糖梯度离心法提取多聚核糖体，该方法根据mRNA的核糖体负载情况实现分离，从而可分析mRNA上的核糖体占据情况，揭示在胁迫条件下翻译调控的机制。第三部分从多聚核糖体和非多聚核糖体组分中分离RNA，并使用外参RNA（spike-in RNA）精确测定各组分中的RNA含量。通过比较正常条件与热胁迫条件下mRNA在上述组分中的分布，计算翻译效率。此外，利用与核糖体结合的RNA和总RNA进行定量实时荧光PCR（qRT-PCR），进一步评估特定基因的翻译活性。该方法专注于热胁迫的影响，为分析植物中翻译调控提供了一套详细的实验方案。 关键词：热胁迫，翻译效率，多聚核糖体分析，蔗糖梯度离心，RNA分离，外参RNA，qRT-PCR，植物，翻译调控
引言
翻译对于生物体从mRNA合成具有功能的蛋白质至关重要，它支持代谢和信号传导等基本细胞功能与生物过程，并使细胞能够响应环境胁迫。若缺乏翻译过程，细胞将无法产生维持生命所必需的蛋白质，从而影响其结构、功能和调控，进而危及生命的维持以及生物多样性的形成1,2。因此，研究植物的翻译效率具有重要意义。翻译过程包含多个关键步骤：首先，在起始阶段，mRNA在起始因子（如真核生物中的eIFs）的协助下与核糖体结合，这些因子识别起始密码子（通常为AUG）。随后进入延伸阶段，携带特定氨基酸的转运RNA（tRNA）分子依次与核糖体结合，相邻氨基酸之间形成肽键，按照mRNA的序列逐步延长多肽链。最后，当核糖体遇到终止密码子（UAA、UAG或UGA）时，释放因子识别该信号并触发终止过程，使核糖体释放新合成的蛋白质。在整个翻译过程中，多种真核起始因子（eIFs）、延伸因子以及核糖体RNA协同作用，以确保翻译的准确性与高效性3,4。
先前的研究表明，翻译后修饰在调控真核起始因子（eIFs）之间的相互作用中发挥关键作用，从而影响翻译效率。体外研究表明，酪蛋白激酶2（CASEIN KINASE 2, CK2）可磷酸化eIF3c、eIF5和eIF2β，增强它们彼此之间以及与eIF1的相互作用5,6。在黑暗条件下，E3连接酶CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1（COP1）通过抑制TOR介导的S6K-RPS6磷酸化来抑制翻译。未磷酸化的RPS6无法形成有功能的核糖体，从而阻断翻译过程7。相反，在光照条件下，光敏色素互作蛋白SUPPRESSOR OF PHYA 105（SPA1）激酶磷酸化eIF2α，促进eIF2复合物的组装并推动翻译起始8。这些发现揭示了响应环境信号调控翻译的复杂机制。
适度的环境刺激可有效促进翻译过程，从而促进植物生长，例如光形态建成8,9。然而，当环境因素过强时，由于植物无法移动，必须进化出适当的调控机制以减轻环境胁迫造成的损伤10。在以往关于植物胁迫响应的研究中，大多数集中在代谢、激素和转录水平的调控11,12,13,14。然而，近期研究开始强调翻译调控在植物胁迫耐受性中的作用15,16,17。植物可通过降低翻译效率来增强其胁迫耐受性，从而减少不必要的能量消耗。由于植物细胞中会形成无膜结构的应激颗粒（stress granules），未翻译的mRNA及其相关蛋白在其中聚集，导致翻译效率下降18。热胁迫是植物常遭遇的一种常见环境胁迫，已有报道指出热胁迫可诱导植物细胞内应激颗粒的形成19,20。全球变暖导致的平均气温普遍上升已严重影响作物产量21。因此，研究植物在热胁迫下的生理调控机制至关重要。先前一项研究表明，对小麦进行热处理后，其多聚核糖体结合的mRNA含量减少；但在恢复阶段，储存在应激颗粒中的mRNA被释放并重新与核糖体结合，从而促进翻译恢复22。此外，以往研究还比较了淹水条件下植物中总mRNA与多聚核糖体结合mRNA的基因表达水平16。结果表明，与脱落酸及非生物胁迫响应相关的mRNA稳态水平在淹水后略有上升，同时多聚核糖体结合的mRNA数量显著增加。这些结果提示，翻译调控可能在调控植物胁迫耐受性中发挥更为关键的作用。因此，建立一种高效的多聚核糖体RNA分离方法，对于研究经胁迫处理样品的翻译组（translatome）至关重要。
在本实验方案中，我们将高风险且耗量较大的苯酚/氯仿提取结合氯化锂沉淀法的RNA提取方法，改进为小规模的苯酚/硫氰酸胍提取法，后者所需试剂量更少。传统方法需直接与多聚核糖体组分混合，导致实验废弃物量较大9,15,23。相比之下，这种改进方法基于密度差异原理：首先将多聚核糖体RNA与高盐、无糖溶液混合，再通过超速离心进行沉淀。随后，使用少量苯酚/硫氰酸胍试剂进行RNA提取。该方法有效减少了有机废液的产生，使实验更加环保。此外，所用有机溶剂的毒性也较低。基于上述原因，我们对实验流程进行了相应的调整与优化。同时，以往的方法未提供利用外源参照标准化计算翻译效率的完整实验方案，而该步骤对于深入的翻译组学分析至关重要。
此处，我们描述了用于研究翻译效率及转译组分析的多聚核糖体分析及多聚核糖体RNA分离方案 拟南芥 热激胁迫下。该方案用于评估Col-0野生型在正常条件、热激处理及恢复阶段的翻译效率。多聚核糖体分析结果及多聚核糖体RNA百分比显示，热胁迫处理后翻译效率发生改变 拟南芥 幼苗
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方案
1. 热胁迫处理的 拟南芥 幼苗样品制备
- 使用滴管将每个重复和每个处理条件下的250粒种子点播到置于不含蔗糖（pH 5.6）、添加1.2%植物凝胶的MS（Murashige和Skoog）基础培养基琼脂平板上的滤纸上。
注意：在MS平板上种植幼苗时，需在平板上放置无菌滤纸，以防止幼苗根部深入培养基内部，便于后续取样。种子应点播在滤纸表面。为排除糖类对植物生长及实验结果的影响，建议使用不含蔗糖的MS培养基进行培养。 - 用铝箔包裹含有已播种种子的MS平板以避光，并在4 °C下孵育2天，以诱导春化作用。
- 将完成春化的种子转移至生长室，在22 °C条件下培养，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，光照强度为100 µmol/m2/s。
- 对于热胁迫处理样本，用防水胶带密封含有5日龄幼苗的MS培养基平板，并将其置于40 °C水浴中处理1小时。
- 对于热处理后恢复阶段的样本，在热处理结束后立即对平板进行降温，随后将其置于22 °C的生长室中恢复2小时。
- 将经处理或未处理的250株幼苗收集至1.5 mL微量离心管中，每个重复一组，并立即用液氮速冻保存。
注意：每种处理条件下准备两组样本，一组用于多聚核糖体图谱分析，另一组用于非多聚核糖体和多聚核糖体RNA的提取。
2. 蔗糖梯度的制备
- 配制含有以下蔗糖浓度的梯度溶液：12.5%、24.4%、36.3%、48.1% 和 60%。溶液组成为 50 mM Tris-HCl、25 mM KCl、10 mM MgCl2、100 µg/mL 肝素（Heparin）和 50 µg/mL 环己酰亚胺（CHX）。
- 将梯度溶液从高浓度到低浓度依次加载，从离心管底部开始向上逐层加入。每加入一层浓度的梯度溶液后，需将其冷冻至完全凝固，再加入下一层浓度的溶液。每层蔗糖梯度溶液加入 2.2 mL。此过程将形成不连续的蔗糖密度梯度。
- 将制备好的蔗糖梯度暂时储存于 -80 °C，使用前在 4 °C 条件下过夜解冻。
3. 多聚核糖体分析样品制备
- 使用均质器以每秒30个循环的频率，将250株5日龄的Col-0幼苗（无论是否经过热处理）在预先冷冻成粉末后研磨1分钟。
注意：当相同遗传背景的植株数量相等时，其RNA提取产量相同。然而，在比较不同遗传背景的过表达转基因植株或突变体植株时，应根据植株生长状况调整所用植株的数量。 - 为获得含有非多聚核糖体RNA和多聚核糖体RNA的提取液，向每支试管中加入500 µL多聚核糖体提取缓冲液（200 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mM KCl，25 mM MgCl2，50 µg/mL环己酰亚胺，100 µg/mL肝素，2% PTE，10% DOC，400 U/mL核糖核酸酶抑制剂），通过倒置和涡旋混合样品。确保整个过程在4 °C下进行。
- 在4 °C下以12,000 × g 离心提取液10分钟。随后将上清液通过100 µm细胞筛过滤，以获得澄清且无颗粒的提取液。
注意：提取液中存在的颗粒可能在超速离心中沉淀，形成沉淀物，从而影响多聚核糖体图谱分析结果的准确性。 - 将过滤后的上清液加载至预先制备好的蔗糖梯度中，并确保其达到平衡状态。
注意：由于超速离心机转速极高，必须确保设备运行安全且功能正常。为此，在旋转前需确认各样品重量一致。因此，我们使用精密天平验证各梯度管重量完全均一。 - 使用超速离心机的摆动桶转子，在4 °C下以210,000 × g 离心3.5小时。加速度和减速度均设为最大值。超速离心后，非多聚核糖体RNA和多聚核糖体RNA将根据其密度在蔗糖梯度溶液中分布。
注意：在蔗糖梯度中，密度较低的非多聚核糖体RNA分布于上层，而由于mRNA上结合了大量正在进行活跃翻译的核糖体，密度较高的多聚核糖体RNA则分布于下层。随后可使用密度梯度分部收集仪进行多聚核糖体图谱分析。
4. 多聚核糖体分析
注意：使用带有微体积注射泵的密度梯度分级仪来测定多核糖体分析谱型。
- 为微量注射泵配制洗脱液（70%蔗糖、10%甘油和0.02%溴酚蓝）。
- 使用软件控制密度梯度分级仪。用去离子水校准仪器。校准后，用其进行多聚核糖体分析。
- 进行基线调整时，打开UV/VIS检测器，直至指示灯由红色变为绿色。调节记录仪偏移旋钮使标记线对齐，然后将基线调节旋钮调至最小开启位置。将UV/VIS检测器上的灵敏度旋钮设为2.0档，并按下自动基线按钮。最后，使用记录仪偏移旋钮将所需基线调整至20。校准过程可能因设备品牌和不同样品而有所差异。
- 超速离心后，使用穿管系统将含样品的离心管放置到密度梯度分级仪上，使离心管与含有洗脱液的微量注射泵及紫外检测器连接。
- 将密度梯度分级仪切换至软件控制模式（REMOTE），并将微量注射泵的注入流速设置为3 mL/min。
- 启动软件设置，通过测量OD254利用分级仪开始实验并获得多聚核糖体图谱。
5. 非多聚核糖体RNA与多聚核糖体RNA的分离
注意：在本实验步骤中，使用了同一批次的另一组样品，这些样品在经过与前述步骤相同的超速离心处理后进行后续操作。
- 根据多聚核糖体谱分析结果，分别收集非多聚核糖体和多聚核糖体的RNA组分。计算非多聚核糖体和多聚核糖体组分的溶液体积，并收集非多聚核糖体组分（上层部分）。
注意：根据谱图，含有两个以上核糖体的组分定义为多聚核糖体组分，而含有40S、60S和80S rRNA峰的组分定义为非多聚核糖体组分。 - 将目标RNA组分与预冷的2×高盐溶液（400 mM Tris-HCl，pH 8.0，100 mM KCl，50 mM MgCl2）充分混合。
- 从试剂盒中加入8 µL真核生物poly-A RNA对照品的稀释储备液。
注意：用于第七步所需的加标归一化。真核生物poly-A RNA对照品试剂盒包含如B. subtilis的基因（例如DAP基因），这些基因在植物中不存在，可作为参考基因。为了确定提取后反应过程中参考基因的损失比例，在提取前向含有非多聚核糖体或多聚核糖体RNA的不同管中加入等量含有DAP基因RNA样本的试剂。这可以用于确定提取后反应过程中参考基因的损失比例，并可用于归一化分析。 - 将混合高盐溶液的RNA在4 °C条件下，使用超速离心机摆动桶转子以450,000 × g离心5小时。
- 超速离心后，RNA将沉淀于离心管底部。小心倾去上清液，以保留底部的RNA沉淀。
- 用500 µL预冷的焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水快速洗涤RNA沉淀，重复此步骤3次。
注意：为防止DEPC处理水在洗涤过程中重新溶解RNA，使用前必须将DEPC处理水预冷以降低其溶解能力。此外，洗涤过程中DEPC处理水与RNA沉淀的接触时间应尽量缩短。
6. 非多聚核糖体和多聚核糖体RNA提取
- 加入500 µL RNA提取试剂，与待提取的RNA样品混匀，孵育10分钟。
- 加入100 µL氯仿，充分混匀，孵育10分钟以实现相分离。
- 将反应混合物在4 °C、12,000 × g 条件下离心10分钟。转移含有RNA的上层透明水相至新离心管中，轻轻加入等体积异丙醇，于-20 °C孵育2小时以沉淀RNA。
- 沉淀完成后，在4 °C、12,000 × g 条件下离心10分钟。小心弃去上清液，保留管底的RNA沉淀。
- 用1 mL预冷的75%乙醇洗涤RNA沉淀。在4 °C、12,000 × g 条件下离心10分钟，弃去上清液，将RNA沉淀室温晾干。
- 待RNA沉淀完全干燥后，将其重悬于30 µL经DEPC处理的水中，使用全波长光谱（220 nm–750 nm）分光光度计测定RNA浓度（OD260）。
7. spike-in 标准化
- 按照 qPCR 试剂盒的说明书，使用 1000 ng 提取的 RNA 进行逆转录。非多聚核糖体 RNA 和多聚核糖体 RNA 均需逆转录为 cDNA。
- 将 1 µL cDNA 与 DAP 基因引物混合，并使用 SYBR 缓冲液按照制造商说明检测目标基因的表达水平。随后，通过实时 PCR 检测 DAP 基因的表达。
注意：DAP 基因引物序列如下：
正向引物 = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
反向引物 = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3' - 比较测定的非多聚核糖体和多聚核糖体 RNA 组中 DAP 基因的表达水平，并在成比例损失条件下估算 RNA 含量。根据标准化后的 RNA 含量，计算多聚核糖体中的 RNA 比例。
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结果
拟南芥野生型 Col-0 在 MS 培养基上于 16 小时光照：8 小时黑暗的光周期条件下培养。对照组使用未经热胁迫处理的 5 日龄幼苗。热胁迫组在预热的水浴中于 40 °C 处理 1 小时，而恢复组在热处理后立即置于 22 °C 环境中恢复 2 小时。通过采用不同的热处理条件和恢复条件，我们可利用后续步骤测定其翻译效率。
在进行RNA提取之前，必须首先制备蔗糖梯度。为了根据非多聚核糖体RNA与多聚核糖体RNA的密度差异对其进行分离，我们配制了蔗糖浓度分别为12.5%、24.4%、36.3%、48.1%和60%的梯度溶液。然后从高浓度到低浓度依次加样，从底部开始加载（图1A）。随后，可利用该梯度将低密度的非多聚核糖体RNA分离至上方层，而高密度的多聚核糖体RNA则分布于蔗糖浓度较高的下层。从经处理或未处理的Col-0材料中提取非多聚核糖体和多聚核糖体RNA。为防止溶液中的颗粒物影响多聚核糖体分析结果，含RNA的溶液应通过细胞滤筛过滤，以获得无颗粒的提取液。将过滤后的上清液加载至预先制备好的蔗糖梯度中并进行...
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讨论
本方案概述了一种测量拟南芥幼苗翻译效率的简单且标准化的方法。该方案的关键步骤包括通过二次离心和RNA提取试剂确保RNA的稳定性，以及蔗糖梯度的精细制备。此外，我们提供了利用外源添加RNA（spike-in）标准化方法对非多聚核糖体RNA和多聚核糖体RNA进行归一化与定量的关键操作步骤。所有操作均必须在冰上进行，并使用无RNase的缓冲液和工具。同时，务必准确配制蔗糖浓度，并尽量减少振荡，以降低对梯度的干扰。在以往的研究24,25,26中，对胁迫响应的研究主要集中在转录水平和表型分析。通过多聚核糖体图谱分析，我们能够进一步探究植物在胁迫或其他环境刺激下翻译过程的调控机制。
理解翻译过程不仅需要进行多聚核糖体谱型分析实验，还需结合叠氮高丝氨酸（Azidohomoalanine, AHA）标记实验。AHA标记用于研究蛋白质合成及翻译活性27。该方法利用AH...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢中国台湾国立台湾大学生命科学学院技术共用平台以及由科技部资助的仪器中心提供的超速离心机技术研究服务。同时感谢梁育玲提供的技术支持，以及郑实验室成员对稿件的审阅。本研究工作得到了中国台湾国家科学与技术委员会青年学者爱因斯坦计划的资助，项目编号 NSTC 113-2636-B-002-007，资助对象为 M.-C.C。M.-C.C. 同时感谢中国台湾国立台湾大学提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | Labcon | 3012-870-000-9 | RNA 提取 |
| 13.2 mL 离心管 | Beckman Coulter | 331372 | 超速离心 |
| 溴酚蓝 | Honeywell | 32712 | 多聚核糖体图谱 |
| 氯仿 | Honeywell | 32211 | RNA 提取 |
| 环己酰亚胺（CHX） | Sigma-Aldrich | SI-C7698 | 多聚核糖体图谱 |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma-Aldrich | D5758 | RNA 提取 |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 32221 | RNA 提取 |
| GeneChip 真核生物 Poly-A RNA 对照试剂盒 | Invitrogen | 900433 | 标准化 |
| 甘油 | Honeywell | 15523 | 标准化 |
| 肝素 | Sigma-Aldrich | SI-H3149 | 多聚核糖体图谱 |
| HiScript III RT SuperMix for qPCR 试剂盒 | Vazyme | R323-01 | 标准化 |
| KCl | J.T.Baker | 3040-01 | 多聚核糖体图谱 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | SI-M8266 | 多聚核糖体图谱 |
| MS 基础培养基 | Phyto | M524 | 植物培养 |
| Peak Chart 注射泵 | Brandel | SYN4007LS | 多聚核糖体图谱 |
| 聚氧乙烯-10-十三醇醚（PTE） | Sigma-Aldrich | P2393 | 多聚核糖体图谱 |
| RNasin | Promega | N251B | 多聚核糖体图谱 |
| 脱氧胆酸钠（DOC） | Sigma-Aldrich | SI-D6750 | 多聚核糖体图谱 |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S5391 | 多聚核糖体图谱 |
| SYBR Green Supermix | Bio-Rad | BP170-8882 | 标准化 |
| TRI 试剂 | MRC | TR118 | RNA 提取 |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4109-06 | 多聚核糖体图谱 |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | Optima L-100K | 超速离心 |
| 紫外/可见光检测器 | Brandel | UA-6 | 多聚核糖体图谱 |
参考文献
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