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方法文章

通过柠檬酸吸入建立咳嗽高敏感性小鼠模型

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DOI：

10.3791/67462

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2025年1月10日

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1State Key Laboratory of Respiratory Disease, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University

本文内容

摘要

本方案描述了一种咳嗽高敏感性小鼠模型的建立方法，该模型可作为研究慢性咳嗽机制的理想模型。

摘要

咳嗽是多种呼吸系统疾病的最常见症状之一。慢性咳嗽显著影响生活质量，并带来较大的经济负担。咳嗽敏感性增高是慢性咳嗽的病理生理学特征。已有研究发现，咳嗽高敏感性与气道炎症、气道感觉神经的重塑以及中枢神经系统的改变有关。然而，其精确的分子机制尚不明确，仍需借助合适的动物模型进一步阐明。既往研究常采用豚鼠作为咳嗽研究的模型，但这些模型存在多种实验局限性，包括成本较高、缺乏转基因工具以及商用试剂稀缺等。此外，豚鼠在受到刺激时通常表现出较差的环境耐受性和较高的死亡率。相比之下，小鼠体型更小、易于饲养、成本更低，且适合进行遗传操作，因而更适用于机制研究。本研究建立了一种通过持续吸入柠檬酸（CA）诱导咳嗽高敏感性的小鼠模型 via 。该模型操作简便，结果可重复，是研究慢性咳嗽机制及潜在新疗法的有力工具。

引言

咳嗽是一种重要的防御性反射，有助于清除呼吸道分泌物或气道内的异物。然而，它也是多种呼吸系统疾病最常见的症状之一，常促使患者寻求医疗帮助1。慢性咳嗽是指成人持续咳嗽超过8周，显著影响生活质量，可导致尿失禁、失眠、反流及其他不适体验，并带来巨大的经济负担2,3,4。目前普遍认为，咳嗽敏感性增高是慢性咳嗽的病理生理学特征，此时低强度的热、机械或化学刺激即可诱发咳嗽5。咳嗽高敏感性与气道炎症6、气道感觉神经的重构7以及中枢神经系统的变化相关8，但其确切的分子机制尚不明确，仍需通过合适的动物模型进一步阐明。

多种动物，包括豚鼠、猫、兔子、狗和猪，已被用于研究咳嗽的机制9。传统上，豚鼠被认为是最适合研究咳嗽机制及镇咳药物疗效的动物模型9,10,11,12。然而，这些模型存在若干实验局限性，包括成本较高、缺乏转基因工具以及商用试剂稀缺。此外，豚鼠在受到刺激时常常表现出较差的环境耐受性和较高的死亡率。相比之下，小鼠体型更小、易于饲养、成本更低，且适合进行遗传操作，因此更适用于机制性研究。以往关于咳嗽模型的研究主要集中在气道炎症诱发的咳嗽，主要用于评估镇咳药物的疗效及外周作用机制13,14。目前尚缺乏用于咳嗽高敏感性的动物模型。

为此，我们提出一种建立咳嗽高敏感性小鼠模型的方法 通过 持续吸入柠檬酸（CA）。与其他动物模型相比，该模型更简单、易于构建且可行性更高。

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方案

所有动物实验程序均经广州医科大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准（20230656）。本研究使用8至10周龄、体重20至25 g的成年雄性无特定病原体级C57BL/6小鼠。所用试剂和设备的详细信息见 材料表。

1. 化学试剂的配制

  1. 柠檬酸（CA）溶液的配制
    1. 用于咳嗽评估时，将 3.84 g 柠檬酸粉末溶于生理盐水中，定容至 50 mL，配制成 0.4 M 的溶液。
    2. 用于动物处理时，将 9.6 g 柠檬酸粉末溶于生理盐水中，定容至 500 mL，配制成 0.1 M 的溶液。
  2. 辣椒素溶液的配制
    1. 将 30.5 mg 辣椒素粉末溶于含 10% 乙醇和 10% Tween-80 的 PBS 中，配制成 10 mM 的储备液。
    2. 将储备液用生理盐水按 1:100 稀释，得到 100 µM 的工作液。
  3. 乙酰甲胆碱溶液的配制
    1. 将 100 mg 乙酰甲胆碱粉末溶于 PBS 中，定容至 2 mL，配制成 50 mg/mL 的溶液。
    2. 用 PBS 稀释该溶液，得到 25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL 和 3.125 mg/mL 的不同浓度溶液。

2. 动物准备

  1. 饲养条件
    1. 将小鼠饲养在笼中，自由获取食物和水，环境温度维持在 22 ± 1 °C，采用标准的 12 小时光照/12 小时黑暗循环。实验操作在小鼠适应喂养环境 1 周后进行。
  2. 适应期
    1. 在进行实验操作前，让小鼠在喂养环境中适应 1 周。

3. 模型的建立

  1. 分组
    1. 将小鼠随机分为模型组和对照组，每组8只。
  2. 暴露设置
    1. 将小鼠分别放入两个独立的暴露舱内（如 图1所示），每个暴露舱连接一台超声雾化器。
    2. 模型组暴露于0.1 M柠檬酸（CA）气溶胶，对照组暴露于0.9%生理盐水（NS）气溶胶，雾化速率为3 mL/min，每日2小时，持续2周（如图2所示）。每次暴露结束后将小鼠放回笼中。
  3. 咳嗽敏感性评估
    1. 末次暴露后，通过诱发性咳嗽（使用生理盐水、0.4 M柠檬酸（CA）和100 µM辣椒素刺激）和自发性咳嗽（无任何刺激）来评估咳嗽敏感性。
      注：为监测模型建立过程中咳嗽敏感性的动态变化，可在第0、3、7和10天使用0.4 M柠檬酸（CA）刺激进行咳嗽敏感性评估。

4. 咳嗽敏感性评估

  1. 仪器准备
    1. 使用无创性全身体积描记（WBP）系统测量咳嗽敏感性。根据使用手册连接腔室、流量传感器、偏置气流及其他组件（见材料表）。
    2. 点击校准按钮执行校准程序，以确保测量准确。状态屏幕将显示校准进度，当进度条达到100%时，校准完成。
  2. 咳嗽检测
    1. 为小鼠创建咳嗽实验，并设置参数：适应期1分钟，反应时间10分钟，化学溶液递送时间10分钟。
    2. 将清醒的小鼠放入各自的腔室内，确保每个腔室仅放置一只小鼠。
      注意：关闭盖子前务必确认小鼠已完全进入腔室，以避免损伤其尾部和趾部。
    3. 向雾化器中加入1 mL化学溶液（NS、CA或辣椒素）。
      注意：实验开始后，系统将记录咳嗽事件次数——每个咳嗽事件包含三个阶段：吸气期、压缩期和呼气期15（如图3所示）。记录10分钟后，咳嗽检测完成。每次检测完一只动物后应清洁腔室，以避免交叉污染。

5. 气道高反应性（AHR）测量

  1. 仪器准备
    1. 按照步骤 4.1 中所述准备仪器。
  2. 气道阻力（AHR）测量
    1. 为小鼠建立剂量-反应研究，设置测量类型、参数和任务顺序：1 分钟适应时间，30 秒甲胆碱溶液递送，3 分钟反应时间，以及 1 分钟恢复时间。
    2. 将清醒的小鼠分别放入独立的检测舱内，确保每个舱内仅有一只小鼠。
    3. 向雾化器中加入 50 µL 化学溶液（PBS 或甲胆碱），并启动实验。
    4. 记录不同浓度甲胆碱（0 mg/mL、3.125 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL）刺激下 Penh 值的变化，Penh 是支气管收缩的指标。

6. 支气管肺泡灌洗液采集

  1. 处死
    1. 使用戊巴比妥钠（50 mg/kg）通过过量麻醉处死小鼠 通过 腹腔注射（遵循机构批准的方案）。
  2. 样本采集
    1. 从小鼠眶后窦采集血液至1.5 mL微量离心管中，立即将管子置于冰上。以3000 x g 4°C下离心10分钟。用移液器收集上清液，分装后于-80 °C保存。
    2. 通过打开胸腔暴露气管，将22 G留置针插入气管，用预冷的PBS每次0.5 mL，灌洗三次，收集支气管肺泡灌洗液（BALF）。
    3. 收集后，将BALF在500 x g下离心 g 4 °C下离心10分钟。收集上清液，分装后于-80 °C保存。将沉淀物重悬于100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中，并制备细胞涂片以进行后续分析。
    4. 打开胸腔暴露肺组织，取出肺组织并置于冻存管中，于 -80 °C 保存以备后续研究。

7. 定量RT-PCR

  1. 使用TRIzol试剂从肺组织中提取总RNA。按照制造商说明书（见材料表），使用第一链cDNA合成试剂盒进行cDNA合成。
  2. 利用SYBR Green荧光在实时定量PCR检测系统中进行PCR扩增。以β-Actin9的表达量为参照，对SP和CGRP mRNA的相对表达量进行归一化处理。

8. 统计分析

  1. 以均值 ± 标准误表示数据。使用 t 检验 比较两组之间的数据，以 P < 0.05 为具有统计学意义。所有统计分析均使用统计与绘图软件进行。

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结果

如图4A所示，与对照组（NS组）相比，模型组（CA组）小鼠在暴露1周后咳嗽敏感性显著升高，且这种增高的敏感性在整个暴露期间持续存在。在造模过程中，对照组和模型组小鼠均未出现死亡（图4B）。图4C和图4D显示，暴露后模型组自发性咳嗽次数显著增加。此外，在暴露期结束后，模型组对NS（图4E和图4F）、CA（图4G和图4H）以及辣椒素（图4I和图4J）诱发的咳嗽敏感性也明显高于对照组。

在图5A、B中，两组在支气管肺泡灌洗液（BALF）中的总炎性细胞数及分类细胞计数方面均无显著差异。

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讨论

本研究通过持续吸入柠檬酸（CA）成功建立了一种具有咳嗽高敏感性的小鼠模型。该模型在自发性咳嗽以及由柠檬酸和辣椒素诱发的反射性咳嗽方面均表现出可靠的咳嗽敏感性升高。柠檬酸和辣椒素被广泛用于评估咳嗽反射敏感性16。

本方案中有多个关键步骤可确保其实验效果。首先，实验所用的暴露室不能完全密闭；为保证适当通风，应在暴露室后部设置通风口。其次，应避免实验动物在室内过度拥挤，将小鼠数量控制在10至12只以内，以防止可能发生的小鼠踩踏。第三，暴露后的护理至关重要：每次暴露后，必须使用暖风将小鼠体表残留的液体吹干。

尽管豚鼠传统上被用于研究咳嗽机制并评估镇咳药物，但小鼠模型具有多项优势。既往研究已建立了通过柠檬酸暴露诱导咳嗽高敏感性的豚鼠模型。例如，Nakaji 等使豚鼠暴露于 0.5 M 柠檬酸中，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家自然科学基金（NSFC 82100034）和广州市科技计划项目（202102010168）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠溶液BiosharpBL158A
辣椒素Cayman Chemical92350
柠檬酸Sigma-AldrichC2404
乙醇广州化学试剂厂GSHB15-AR-0.5L
第一链 cDNA 合成试剂盒TransGen BiotechAT341
乙酰甲胆碱Sigma-AldrichA2251
无创全身体积描记（WBP）系统DSI601-1400-001
戊巴比妥钠MerkP3761
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601
磷酸盐缓冲液（PBS）MeilunbioMA0015
实时 定量 PCR 检测 系统Bio-rad CFX  Connect
TRIzol 试剂Invitrogen15596026CN
吐温-80SolarbioT8360-100
超声雾化器鱼跃402AI

参考文献

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