方法文章

通过柠檬酸吸入建立咳嗽高敏感性小鼠模型

DOI：

10.3791/67462

⸱

2025年1月10日

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种咳嗽高敏感性小鼠模型的建立方法，该模型可作为研究慢性咳嗽机制的理想模型。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

咳嗽是多种呼吸系统疾病的最常见症状之一。慢性咳嗽显著影响生活质量，并带来较大的经济负担。咳嗽敏感性增高是慢性咳嗽的病理生理学特征。已有研究发现，咳嗽高敏感性与气道炎症、气道感觉神经的重塑以及中枢神经系统的改变有关。然而，其精确的分子机制尚不明确，仍需借助合适的动物模型进一步阐明。既往研究常采用豚鼠作为咳嗽研究的模型，但这些模型存在多种实验局限性，包括成本较高、缺乏转基因工具以及商用试剂稀缺等。此外，豚鼠在受到刺激时通常表现出较差的环境耐受性和较高的死亡率。相比之下，小鼠体型更小、易于饲养、成本更低，且适合进行遗传操作，因而更适用于机制研究。本研究建立了一种通过持续吸入柠檬酸（CA）诱导咳嗽高敏感性的小鼠模型 via 。该模型操作简便，结果可重复，是研究慢性咳嗽机制及潜在新疗法的有力工具。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

咳嗽是一种重要的防御性反射，有助于清除呼吸道分泌物或气道内的异物。然而，它也是多种呼吸系统疾病最常见的症状之一，常促使患者寻求医疗帮助1。慢性咳嗽是指成人持续咳嗽超过8周，显著影响生活质量，可导致尿失禁、失眠、反流及其他不适体验，并带来巨大的经济负担2,3,4。目前普遍认为，咳嗽敏感性增高是慢性咳嗽的病理生理学特征，此时低强度的热、机械或化学刺激即可诱发咳嗽5。咳嗽高敏感性与气道炎症6、气道感觉神经的重构7以及中枢神经系统的变化相关8，但其确切的分子机制尚不明确，仍需通过合适的动物模型进一步阐明。

多种动物，包括豚鼠、猫、兔子、狗和猪，已被用于研究咳嗽的机制9。传统上，豚鼠被认为是最适合研究咳嗽机制及镇咳药物疗效的动物模型9,10,11....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物实验程序均经广州医科大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准（20230656）。本研究使用8至10周龄、体重20至25 g的成年雄性无特定病原体级C57BL/6小鼠。所用试剂和设备的详细信息见 材料表。

1. 化学试剂的配制

  1. 柠檬酸（CA）溶液的配制
    1. 用于咳嗽评估时，将 3.84 g 柠檬酸粉末溶于生理盐水中，定容至 50 mL，配制成 0.4 M 的溶液。
    2. 用于动物处理时，将 9.6 g 柠檬酸粉末溶于生理盐水中，定容至 500 mL，配制成 0.1 M 的溶液。
  2. 辣椒素溶液的配制
    1. 将 30.5 mg 辣椒素粉末溶于含 10% 乙醇和 10% Tween-80 的 PBS 中，配制成 10 mM 的储备液。
    2. 将储备液用生理盐水按 1:100 稀释，得到 100 µM 的工作液。
  3. 乙酰甲胆碱溶液的配制
    1. 将 100 mg 乙酰甲胆碱粉末溶于 PBS 中，定容至 2 mL，配制成 50 mg/mL 的溶液。
    2. 用 PBS 稀释该溶液，得到 25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL 和 3.125 mg/mL 的不同浓度溶液。....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

如图4A所示，与对照组（NS组）相比，模型组（CA组）小鼠在暴露1周后咳嗽敏感性显著升高，且这种增高的敏感性在整个暴露期间持续存在。在造模过程中，对照组和模型组小鼠均未出现死亡（图4B）。图4C和图4D显示，暴露后模型组自发性咳嗽次数显著增加。此外，在暴露期结束后，模型组对NS（图4E和图4F）、CA（图4G和图4H）以及辣椒素（图4I和图4J）诱发的咳嗽敏感性也明显高于对照组。

在图5A、B中，两组在支气管肺泡灌洗液（BALF）中的炎性细胞总数及分类细胞计数方面均无显著差异。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究通过持续吸入柠檬酸（CA）成功建立了一种具有咳嗽高敏感性的小鼠模型。该模型在自发性咳嗽以及由柠檬酸和辣椒素诱发的反射性咳嗽方面均表现出可靠的咳嗽敏感性升高。柠檬酸和辣椒素被广泛用于评估咳嗽反射敏感性16。

本方案中有多个关键步骤可确保其实验效果。首先，实验所用的暴露室不能完全密闭；为保证适当通风，应在暴露室后部设置通风口。其次，应避免实验动物在室内过度拥挤，将小鼠数量控制在10至12只以内，以防止可能发生的小鼠踩踏。第三，暴露后的护理至关重要：每次暴露后，必须使用暖风将小鼠体表残留的液体吹干。

尽管豚鼠传统上被用于研究咳嗽机制并评估镇咳药物，但小鼠模型具有多项优势。既往研究已建立了通过柠檬酸暴露诱导咳嗽高敏感性的豚鼠模型。例如，Nakaji 等使豚鼠暴露于 0.5 M 柠檬酸中，.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由国家自然科学基金（NSFC 82100034）和广州市科技计划项目（202102010168）资助。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠溶液BiosharpBL158A
辣椒素Cayman Chemical92350
柠檬酸Sigma-AldrichC2404
乙醇广州化学试剂厂GSHB15-AR-0.5L
第一链 cDNA 合成试剂盒TransGen BiotechAT341
乙酰甲胆碱Sigma-AldrichA2251
无创全身体积描记（WBP）系统DSI601-1400-001
戊巴比妥钠MerkP3761
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601
磷酸盐缓冲液（PBS）MeilunbioMA0015
实时 定量 PCR 检测 系统Bio-rad CFX  Connect
TRIzol 试剂Invitrogen15596026CN
吐温-80SolarbioT8360-100
超声雾化器鱼跃402AI

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morice, A. H. Epidemiology of cough. Pulm Pharmacol Ther. 15 (3), 253-259 (2002).
  2. Lai, K., Long, L. Current status and future directions of chronic cough in China. Lung. 198 (1), 23-29 (2020).
  3. Zeiger, R. S., et al.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章