基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

摘要

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。

摘要

人急性单核细胞白血病（AML）THP-1 细胞系被广泛用作研究人单核细胞来源的巨噬细胞功能的模型，包括其与重要人类病原体（如人类免疫缺陷病毒（HIV））之间的相互作用。与其他永生化的髓系细胞系相比，THP-1 细胞保留了多种完整的炎症信号通路，并表现出更接近原代单核细胞的表型特征，包括在佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯（PMA）处理后分化为巨噬细胞的能力。利用 CRISPR-Cas9 技术通过靶向基因敲除（KO）对 THP-1 细胞进行基因工程改造，为深入表征免疫相关机制（包括病毒-宿主相互作用）提供了有力手段。本文介绍了一种基于电穿孔递送预先组装的 Cas9:sgRNA 核糖核蛋白至细胞核的高效 CRISPR-Cas9 基因编辑方案。使用多个在相近位置靶向同一基因座的 sgRNA 可导致大片段 DNA 的缺失，从而提高编辑效率，该效率通过 T7 内切酶 I 检测进行评估。在基因水平上的 CRISPR-Cas9 编辑通过 Sanger 测序结合 CRISPR 编辑推断（ICE）分析进行验证。蛋白耗竭通过免疫印迹联合功能实验得以确认。采用本方案，可在靶向基因座实现高达 100% 的插入缺失（indel）率，并使蛋白表达水平降低超过 95%。如此高的编辑效率使得通过有限稀释法分离单细胞克隆变得十分便捷。

引言

THP-1 是一种来源于急性髓系白血病（AML）患者的单核细胞系，其表型特征与原代单核细胞非常相似¹与不分裂、寿命有限且表型存在供体间和供体内部变异的原代单核细胞来源巨噬细胞相比，THP-1细胞可近乎无限地培养，且行为更为均一，有利于实验结果的可重复性^2,3,4,5,6值得注意的是，THP-1 细胞可通过佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸盐（PMA）诱导分化为类似巨噬细胞的表型，因此被广泛使用 体外 用于研究单核细胞/巨噬细胞对炎症信号反应的模型^{7,8,9,10,11,12,13} 或由....

方案

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 使用 CRISPOR 进行向导设计（图 1.1）

注意：可在步骤 4、7 和 10 中使用 SnapGene Viewer 软件对编辑靶位点以及目的基因内 PCR 引物杂交位置进行注释。

1. 前往 Ensembl 网站（www.ensembl.org）。在 搜索 选择物种并输入目标基因名称。点击 开始选择与基因（而非转录本）对应的结果。
2. 点击 显示转录本表格 然后选择 转录本 ID 对应于金标记的蛋白质编码 生物型 柱。进入转录页面后，点击 外显子 在左侧菜单中。
3. 向下滚动并点击 下载序列确保文件格式为 FASTA。在 设置 - 包含的序列，取消选择除...以外的所有内容 基因组序列.
   输入数字 "500" 在

结果

构建了稳定表达GFP报告蛋白的THP-1细胞系（THP-1_GFP）（图2A），并将其用作建立高效CRISPR-Cas9介导基因编辑方案的工具。为此，使用CRISPOR网络工具²⁹ 设计了3条靶向EGFP基因的sgRNA（图2B），这些sgRNA与Cas9以9:1的摩尔比形成核糖核蛋白复合物（RNP），随后通过不同参数的电穿孔将RNP递送至细胞中。之后，细胞培养于仅含20% FBS的RPMI培养基中（图2C，上图）或与条件培养基以1:1比例混合的培养基中（图2C，下图）。通过监测细胞增殖及GFP表达水平（作为EGFP基因敲除效率的读数）随时间的变化进行评估。在多种条件下，GFP阳性细胞比例迅速下降，在电穿孔后第7天达到>90%的减少率。在电穿孔后第3天，细胞数量减半，可能是由于电穿孔对细胞活力的负面影响所致。.......

讨论

本文描述了一种成功实现CRISPR介导的THP-1细胞系基因编辑的实验方案。该方法依赖于通过电穿孔/核转染将预先组装的sgRNA/Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）导入细胞。选择该策略旨在限制由慢病毒介导的sgRNA/Cas9表达盒整合所可能导致的脱靶效应，避免核酸酶的持续表达。为实现可靠且高效的基因编辑，我们针对目标基因设计了多个sgRNA，以提高产生基因组插入或缺失（indel）的可能性，从而导致蛋白表达丧失和功能性的基因敲除（KO）³²。在电穿孔条件的优化上也给予了特别关注，以实现细胞膜通透性的最佳调控，确保sgRNA/Cas9 RNP高效递送，同时避免过度的细胞死亡³³。在此过程中，细胞在电穿孔前的培养状态（例如较低的传代次数）是一个关键参数。

通过T7EI错配检测实验在遗传水平上验证了CRISPR-Cas9介导的基因编辑，该方法可对多个样本进行快速且经济的评估，用于Sanger测序前的预筛选。该方法最初是通过比较全长扩增子与切割产物的条带强度，以单个sgRNA评估编辑效率而开发.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm 注射器滤器	ClearLine	146560	_
0.4 % 台盼蓝	Beckman Coulter	383200	_
1.5 mL 离心管	Eppendorf	3810X	_
24 孔板	Corning	353047	_
6x TriTrack DNA 上样染料	Thermo scientific	R1161	_
75 cm² 带通气盖培养瓶	Corning	353136	_
8 联 PCR 管（带盖）	Life technologies	AM12230	_
96 孔平底板	Corning	353072	_
96 孔圆底板	Corning	353077	_
琼脂糖	Euromedex	D5	_
ATGpr	_	_	https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc 成像系统	BIO-RAD	12003153	_
细胞计数板	NanoEntek	DHC-N04	_
CRISPOR	_	_	http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBS	Gibco	14190094	_
Ensembl	EMBL-EBI	_	https://www.ensembl.org/index.html
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F7524	_
FlowJo	BD Life Sciences	v10.10	_
GeneRuler 100 bp Plus DNA Marker	Thermo scientific	SM0323	_
基因组数据浏览器（Genome Data Viewer）	NCBI	_	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad Prism	Dotmatics	_	版本 9.3.1
Herculase II 融合 DNA 聚合酶	Agilent	600679	_
ICE CRISPR 分析工具	Synthego	_	https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab Touch	BIO-RAD	_	版本 2.4.0.03
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	随 T7EI M0302S 提供
Neon 转染试剂盒，10 µL	Invitrogen	MPK1025K	电穿孔试剂盒，包含枪头、管、缓冲液 R 和 E
Neon 转染系统	Invitrogen	MPK5000	_
NetStart 1.0	_	_	https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
无核酸酶水	Synthego	_	_
PCR 引物（EGFP）	Eurofins	_	Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR 引物（SAMHD1）	Eurofins	_	Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	_
多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	15714	_
佛波酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P8139	_
PrimerQuest	IDT	_	https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104	_
QuickExtract DNA 提取液	Biosearch Technologies	QE09050	_
RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX	Gibco	61870010	_
SnapGene Viewer	Dotmatics	_	版本 7
SpCas9 2NLS 核酸酶	Synthego	_	_
SYBR Safe DNA 凝胶染料	Invitrogen	S33102	_
合成 sgRNA（EGFP）	Synthego	_	#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
合成 sgRNA（SAMHD1）	Synthego	_	#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
注射器 Plastipak 鲁尔锁头	BD	301229	_
T100 梯度 PCR 仪	BIO-RAD	1861096	_
T7 核酸内切酶 I	New England Biolabs	M0302S	_
TAE 缓冲液 UltraPure，10x	Invitrogen	15558026	400 mM Tris-乙酸盐，10 mM EDTA
THP-1 细胞	ATCC	TIB-202	_
胰蛋白酶-EDTA（0.05 %）	Gibco	25300054	_
ZE5 细胞分析仪	BIO-RAD	12014135	_