建立模拟性别确认激素治疗的大鼠模型

摘要

本方案描述了通过皮下注射睾酮或雌二醇联合醋酸环丙孕酮（用于跨性别者的性别肯定激素治疗）建立两种啮齿类动物模型的方法：剂量设定、相关生物标志物的确定以及治疗效果的评估。

摘要

跨性别（TG）人群是指性别认同与出生时被指定的生理性别不一致的个体。他们通常会接受性别肯定激素治疗（GAHT），这是一种医学干预手段，可使其获得更符合自身性别认同的第二性征，并在改善多种社会心理变量方面表现出稳定效果。然而，GAHT作用于多个身体系统，已记录到一些副作用，但其全面识别与特征描述尚不充分。因此，在风险评估框架下，接受GAHT的跨性别者可被视为易感人群亚群，应予以特别关注，例如通过使用针对性的动物模型进行研究。本研究描述了建立两种模拟GAHT的大鼠模型的操作流程：去雄化-女性化模型（dMF），用于模拟跨性别女性的GAHT；去雌化-男性化模型（dFM），用于模拟跨性别男性的GAHT。这些模型已 通过与人类性别肯定激素治疗（GAHT）相同的给药途径，为期两周给予相同激素：对dMF个体给予β-雌二醇联合醋酸环丙孕酮，对dFM个体给予睾酮。治疗期间每日观察大鼠健康状况及潜在攻击性行为。处死时采集血液和靶组织样本并保存，用于生化、分子及组织病理学分析。同时评估性别特异性参数，如精子计数和阴蒂尺寸。此外，鉴定并表征大鼠肝脏中特有或优势表达的CYP450同工酶，作为验证GAHT效果及建立模型的新生物标志物。甲状腺作为内分泌系统的关键靶器官，其受累情况亦被探讨。

引言

个体在心理上对自身为男性、女性、非男非女、兼具两性或介于两者之间的感知¹ 称为性别认同。它可能与生理性别一致（顺性别），也可能不一致（跨性别 - TG）。跨性别男性指出生时为女性但自我认同为男性的个体；跨性别女性指出生时为男性但自我认同为女性的游戏副本²据估计，目前全球有2500万跨性别者³，其中大多数患有性别不安，这是一种心理状况，表现为个体的性别认同与其出生时被指定的性别之间存在不一致⁴，这可能导致社会歧视以及在社交中遇到困难 工作和家庭中的压力，常导致抑郁、焦虑和应激⁵因此，跨性别者通常会接受性别肯定激素治疗（GAHT）和/或性别肯定手术。跨性别男性的GAHT以睾酮（T）给药为特征。表1），对于跨性别女性，则使用雌激素（E2）联合抗雄激素（表2)⁶.

性别肯定激素治疗通常持续个体一生，持续作用于内分泌系统^7,8因此，分析性别肯定激素治疗（GAHT）对跨性别者健康的影響及其潜在的长期效应非常重要。....

方案

本研究遵循欧盟指令2010/63/EU、意大利2014年3月4日第26号立法法令以及经济合作与发展组织（OECD）良好实验室规范（GLP）原则。研究方案已获意大利卫生部批准（授权编号：806/2021-PR）。实验选用16只性成熟的年轻Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半（雄性体重304 ± 13 g，雌性体重190 ± 7 g，年龄8–9周），每笼饲养2只，在标准实验室条件下饲养（温度22 ± 0.5 °C，相对湿度50%–60%，光照-黑暗周期12小时交替，每小时换气12–14次），自由饮水和进食 随意摄取在所有笼具中，为每只动物提供木制啃咬块以进行环境丰富化，并每周更换一次。

注意：选择8-9周龄的动物是因为性别肯定激素治疗（GAHT）可在青春期（Tanner分期2至3期）开始，这在啮齿类动物中相当于8-9周龄，且该治疗可能持续很长时间，甚至贯穿跨性别者的一生⁹。

1. 分组与动物护理

1. 使用8至9周龄的年轻成年雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠作为模型，因为大鼠是经合组织（OECD）推荐的首选物种（例如，指南421生殖/发育毒性筛选试验），也是OECD指南407（啮齿类动物重复给药28天口服毒性研究，已更新用于检测内分泌干扰物的参数）中提出并考虑的唯一啮齿类动物物种。
....

结果

如 Tassinari 等人¹⁴ 和 Tammaro 等人³³ 所证明，以下结果展示了性别肯定激素治疗（GAHT）在大鼠中的成功应用以及模型的适用性。

未记录到死亡或异常行为（如攻击性），也未观察到任何毒性或痛苦的临床症状（如活动减少、毛发竖立和外观凌乱）¹⁴.

成年雄性大鼠以及处于动情期和动情前期的雌性大鼠血浆睾酮（T）浓度分别为 5.71 ± 0.84 ng/ml、1.24 ± 0.29 ng/ml 和 0.80 ± 0.36 ng/ml³⁴。性腺完整的雄性大鼠循环睾酮（T）平均水平为 3.5 ± 0.5 ng/mL³⁵。两种模型中对照组大鼠测得的睾酮（T）和雌二醇（E2）水平均处于文献报道的生理范围之内³³。雌性大鼠雌二醇（E2）的生理范.......

讨论

建立模拟性别肯定激素治疗（GAHT）的啮齿类动物模型，对于研究跨性别者可能存在的特异性易感性和脆弱性，以及通常持续其一生的长期治疗结局至关重要。

由于文献中类似研究数量有限，本实验的关键在于选择建立模型所用的剂量；这些剂量应足够低，以确保在动物中长期给药时不会引起不良反应、毒性或死亡。另一个关键点是选择最佳给药途径，同时需考虑人类临床实践中常用的给药方式。事实上，在dFM模型中，睾酮（T）的给药途径遵循跨性别男性中的临床实践¹⁵；而在dMF模型中，给药途径却与跨性别女性的临床实践不一致¹⁵。因此，仍需进一步实验以建立更为可靠的方法。这两个大鼠模型旨在尽可能模拟人类治疗方案，可提供关于两种性别肯定激素治疗（GAHT）对包括生殖功能、甲状腺稳态 和肝脏代谢在内的多种身体功能影响的关键数据，部分填补了现有研究空白。

可采用多种额外措施来改进这两个模型，使其更加稳健并更易于向人类转化。例如，可通过植入可释放E2的聚合物储库进行皮下.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分析天平 ABJ 320-4NM	Kern	Z741091
Bouin 氏液	Biooptica	05-M01008
离心机 5415 R	Eppendorf		适用于 eppendorf
醋酸环丙孕酮	Sigma-Aldrich	C3412
D-MEM 培养基	Gibco
ExcelTaq 2X 快速 q-PCR 预混液（SYBR，ROX），200 次反应	Smobio	TQ1210
中性缓冲福尔马林溶液，10%	Sigma-Aldrich	HT501128
GraphPad Prism 软件版本 5.0 （Windows 版）	GraphPad Software
苏木精	Biooptica	05-06002/L
伊红	Biooptica	05-10007/L
成像软件	Nikon		NIS-BR
JMP 10 统计分析软件	SAS Institute
切片机 Microm	Thermo Scientific	HM 325
显微镜	Nikon Microphot FX
小鼠/大鼠睾酮 ELISA 试剂盒	Biovendor	RTC001R	96T
NanoDrop 1000 分光光度计	Thermo Scientific		ND-1000
石蜡	Biooptica	087910
便携式天平 SCOUT STX2202	OHAUS	30253064
引物	Life Technologies		由 PrimerBlast 设计
大鼠雌二醇 ELISA 试剂盒	Biovendor	RTC009R	96T
大鼠促甲状腺激素（TSH）ELISA 试剂盒	ELK Biotechnology	ELK2283	96T
大鼠促甲状腺激素（TSH）ELISA 试剂盒	ELK Biotechnology	ELK2283	96T
SensiFAST cDNA 合成试剂盒	Bioline	BIO-65053	50 次反应
芝麻油	ACROS	AC241000010
雄性和雌性 Sprague Dawley 大鼠	Envigo		8/9 周龄
标准饲料	Mucedola	4RF18
甲状腺素（T4）ELISA 试剂盒	ELK Biotechnology	ELK8716	96T
十一酸睾酮	Sigma-Aldrich	T3006
荧光定量 PCR 仪 LineGene 9600 Plus Bioer	Aurogene
组织处理仪	Shandon Excelsior ES, Thermo Scientific
总 RNA 提取试剂盒	Norgen	17200	50 柱
Victor 3 多功能酶标仪	Perkin Elmer
β-雌二醇-17-戊酸酯	Sigma-Aldrich	E1631