利用数字平面测量法评估小鼠模型中伤口闭合动力学

摘要

伤口是全球健康面临的一项挑战。本研究开发了一种利用数字平面测量法的标准化摄影装置，以减少伤口测量的变异性。对小鼠伤口进行为期14天的监测发现，伤口面积和周长在初期增加，随后逐渐闭合。该方法可能有助于评估临床前模型中的伤口闭合动力学。

摘要

由于慢性伤口患病率高，已成为一个严重的全球性健康问题。有效的治疗策略可显著加快愈合过程，从而降低并发症风险，并减轻医疗系统的经济负担。尽管已有大量实验研究探讨伤口愈合过程，但大多数研究依赖于定性观察或直接的定量测量。本研究旨在标准化一种基于数字图像测量法的间接伤口测量方法，结合数字标尺校准与图像分割技术。该方法弥补了目前在伤口准确评估方面缺乏详细、分步操作指南的不足。本研究设计并搭建了一个摄影记录装置，采用计算机辅助的数字图像测量工具，以尽量减少伤口面积、周长以及从伤口中心到边缘距离等参数测量中的变异性。在雄性CD1小鼠（n = 4，10周龄，体重30–35 g）肩胛水平背部中线处制造一个直径为5 mm的圆形创伤性伤口。使用自行设计的摄影装置对伤口演变过程进行为期14天的摄影记录，该装置可控制光照条件、焦距和实验动物体位。利用ImageJ软件中的图像分割功能进行标尺校准和伤口测量，统计分析则通过统计分析软件完成。伤口闭合动力学结果显示，伤口面积和周长在第0天至第2天略有增加，随后逐渐减小，直至第14天完全闭合。摄影记录装置与计算机辅助数字图像测量技术实现了变异度极小的定量测量。综上所述，这些工具为临床前模型中评估伤口闭合动力学提供了一种可靠且可重复的方法。

引言

创伤愈合大约需要21天，具有明确的四个阶段顺序：（1）止血期，（2）炎症期，（3）增殖期，以及（4）重塑期¹。如果伤口愈合的任一阶段被延长，可能导致慢性伤口的形成¹。由于其高发病率、潜在并发症²以及巨大的经济负担，慢性伤口被视为全球性健康问题。

临床前研究旨在通过促进创面完全再上皮化^3,4,5、预防并发症以及降低治疗成本，实现更快的愈合。这些研究评估了多种策略，包括生物材料的开发、药物干预以及其他再生医学技术^6,7,8,9。

已开发出多种实验模型用于创伤伤口的研究。一些模型侧重于宏观可见的定性特征，如伤口大小、炎症指标、肉芽组织的存在、分泌物以及结痂形成⁵。另一些模型则分析定量数据，包括伤口面积、周长、半径、直径、颜色、深度，以及从伤口中心到边缘的距离等。

在这方面，大多数in vivo研究直接测量伤口的半径和深度。然而，在宏观图像中手动勾画伤口边缘可能会引入测量偏差¹⁰。其他研究采用机械平面测量法，使用带有网格的透明塑料片，事先在上面勾画出伤口边缘；在这两种情况下，获取面积或周长均需借助尺子或数字测面积仪等手动工具。如今，计算机辅助数字平面测量法可对伤口或塑料片的宏观图像进行计算机化分析。In situ操作以及宏观图像的质量仍存在局限性，但该工具^11,12,13,14显著降低了面积和周长测量之间的变异性。

该研究方法在评估小鼠伤口闭合方面相较于现有技术具有显著优势^{15,16,17,18,19,20}。尽管摄影记录被认为是评估伤口闭合动力学的一种准确且一致的工具，但先前的研究^21,22已指出人工测量伤口存在的局限性，例如观察者偏差以及因光照和相机位置不一致导致的变异性。本方法通过使用定制成像舱标准化成像条件，解决了上述问题，提高了实验的可重复性和精确性。此外，计算机数字平面测量法可实现更准确的定量评估，增强对治疗干预效果的评价能力，并减少测量误差，这一点已在比较人工与数字技术的其他研究中得到证实^12,22，因此该方法特别适用于小鼠模型中的伤口闭合动力学研究，能够在严格控制图像采集条件的基础上，精确评估各类治疗方法的效果。

方案

所有涉及实验小鼠的实验操作均按照墨西哥官方标准（NOM-062-ZOO-1999）中关于实验动物饲养与护理的伦理规范和规定进行。本实验方案已由国家核能研究所（ININ）实验动物护理与使用内部委员会（CICUAL）审查并批准，批准编号为CICUAL-01-23。本研究使用了4只10周龄的雄性CD1小鼠，体重范围为28–32 g。所有动物在品系、年龄、性别和体重方面均保持一致，以尽量减少实验结果的变异性。所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 用于获取宏观图像的拍照装置构建

注意：使用授权的 SolidWorks 软件（2015 版本）设计了一个摄影亭，以消除外部光源的影响。该摄影亭采用一英寸厚的白色铝型材构建，为一个 40 cm × 40 cm 的立方体。该立方体由三个部分依次组装而成：屋顶、侧墙和底板（图 1A）。

1. 屋顶构造
   注意：屋顶被划分为前缘（A）、后缘（B）以及两侧边缘（C 和 D），以进行定位（图 1B）。
   1. 在屋顶侧边缘（C 和 D）内侧区域固定一条带槽铝型材（设计用于固定玻璃），尺寸为宽 1.5 cm、厚 2.51 cm、长 34.9 cm（图 1B）。
   2. 在每条屋顶型材的槽口中放置一块长 34.5 cm、宽 13 cm 的矩形铝板，铝板中心带有聚乙烯材料（见 图 1C 中的板 1 和板 2），以实现沿两个型材槽口的滑动。
   3. 使用双面胶带将一根长 20 cm、色温范围为 2500–9000 K 的 RGB LED 灯管以 45° 角安装在板 1 的底边下侧（图 1C）。
   4. 在屋顶板 1 和板 2 上安装一块尺寸为 32 cm × 12 cm 的矩形泡沫板，板中央设有直径为 7.82 cm 的圆形切口，以便安装相机镜头（图 1C）。
2. 底板构造
   1. 在底板区域的型材上方放置一块 40 cm × 40 cm 的方形白色泡沫板。从泡沫板每个角裁去边长为 2.54 cm 的正方形（图 1E）。
3. 侧墙构造
   1. 裁切四块 40 cm × 40 cm 的四边形泡沫板。
   2. 使用硅胶将其中两块板分别粘接在 C 和 D 侧，形成左侧和右侧墙体（图 1F）。
   3. 在铝型材 A 和 B 上粘贴钩环扣带条，以便于操作摄影舱内部元件。此外，在两条粘扣带边缘 1 cm 处分别粘贴一条粘性固定条于两块泡沫纸板的一侧，并将这两块纸板安装在前墙和后墙上（图 1F）。
4. 参考基座的构造
   注意：需要一个参考基座，以在麻醉期间及伤口演变记录过程中保持小鼠处于俯卧位。3D 部件采用熔融沉积成型（FDM）技术，使用 PLA 材料通过 3D 打印机制作^23,24。
   1. 3D 打印一个底面尺寸为 2 cm 宽、2 cm 长、2 cm 高的面罩，并将其放置在预先裁切好的 40 cm × 28 cm 白色泡沫板矩形边缘 11.5 cm 处，用于维持小鼠吸入麻醉状态（图 1D，红色部分）。
   2. 3D 打印一个矩形平台（长 9 cm、宽 5 cm、高 2.5 cm），其上设有四个凸起区域，用于在图像采集过程中对齐小鼠背部。这些区域支撑头部、四肢和腹部，以维持俯卧姿势。将该平台粘接到参考基座的中心位置（图 1D，绿色部分）。
   3. 3D 打印一个尺座模块（宽 2 cm、长 8 cm、高 2.5 cm），并将其固定在小鼠基座左侧边缘 1 cm 处，用于放置数字图像处理所需的测量参考元件（图 1D，蓝色部分）。
   4. 将一根 15 cm 长的不锈钢刻度尺安装到尺座模块上，并将整个参考基座安装至舱内，用于图像比例标定（图 1D）。

图1：宏观图像采集箱构建示意图。（A）箱体各部分（屋顶、侧壁、地板）。（B）构成屋顶的型材方向；前部（A）、后部（B）以及侧面（型材内侧为红色“C,D”）。（C）屋顶面板1和2，LED灯管安装，相机镜头板及地板安装。（D）麻醉面罩（红色）、小鼠平台（绿色）以及用于放置标尺的矩形平台（蓝色）在基准底座上的安装位置。（E） 基准底座的最终位置。（F）侧面、前面和后面墙壁的安装。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 动物饲养

1. 获得机构生物伦理委员会的动物实验许可。使用10周龄的CD1小鼠（n = 4），体重为28–32 g。
2. 将小鼠饲养在标准条件下：保持温度为 21 °C，12/12 小时明暗循环，45% 湿度，并提供 随意摄取 除拍照记录期间外，可自由获取水和食物。

3. 创伤性伤口的制备

1. 使用经校准的挥发器以1.5 L/min的氧气流速输送浓度为5%的吸入性七氟烷麻醉小鼠²⁵（遵循机构批准的方案）。
   1. 通过趾间夹捏测试确认麻醉深度，观察是否无回缩反射。在眼睛上涂抹眼用软膏以防止麻醉期间角膜干燥。手术及恢复期间（20分钟）维持小鼠体温稳定在37 °C。
2. 将小鼠置于俯卧位，使用手术刀从颈部向尾侧方向脱毛，脱毛区域为2.5 cm × 3 cm。拉紧皮肤以避免切割损伤。采用聚维酮碘与无菌水交替冲洗多轮的方式进行无菌处理和消毒。
3. 使用无菌的5 mm活检打孔器，以旋转加压方式在肩胛骨水平处制作真皮-表皮切口。用带齿镊夹取皮瓣，并用显微剪刀剪除（图2A）。
4. 若伤口存在出血点，使用电凝设备止血。
5. 使用钟表匠镊将直径1 cm的圆形真皮膜覆盖于伤口上，以防止污染和伤口收缩。
6. 所有可存活手术均须在无菌条件下进行。使用聚维酮碘等消毒剂准备手术区域。佩戴无菌手套和口罩，并在整个操作过程中使用无菌器械，尽量减少与非无菌表面的接触，以维持无菌状态。
   1. 术后将小鼠置于24 °C的独立笼具中，持续监测直至恢复正常的自主活动能力。术中及术后使用外部热源控制体温，防止低体温。
7. 通过将酮咯酸（片剂，10 mg）溶解于饮水中制备镇痛剂，终浓度为0.025 mg/mL。此浓度相当于一只体重30 g、每日饮水量约6 mL的小鼠每日摄入剂量为5 mg/kg。术前48小时开始给药，持续至创伤后第4天，以确保实现预先镇痛和持续镇痛效果²⁶。
8. 术后至少连续5天每日监测动物状态。评估每只小鼠的身体状况评分、毛发外观、疼痛或痛苦的行为表现（如活动减少、异常姿势）以及伤口情况（如分泌物、红肿或感染迹象）。将观察结果记录于机构动物护理日志中。持续定期监测至第14天，此时健康啮齿类动物的伤口通常已进入较晚期的愈合阶段。根据国际标准，采用CO₂舱内置换O₂的方式实施安乐死。此步骤标志着研究终点。

4. 宏观图像采集

1. 连续14天每天拍摄伤口图像，以监测伤口闭合的动态过程。使用半专业或专业相机，将镜头对准摄影箱顶部的圆形开口。
   注意：根据实验条件可适当调整时间安排。
2. 使用处于相关色温（CCT）模式的RGB LED灯管，设定为9000 K色温和100%亮度进行照明。
3. 将参考底座置于摄影箱底部中央。
4. 将小鼠放入吸入麻醉室中3分钟（图2B）。
5. 诱导麻醉后，将小鼠俯卧于小鼠平台之上，将其鼻部固定在七氟烷麻醉面罩内，以1.5 L/min的氧气流速输送5%七氟烷（图2C）。
6. 拍摄图像前，使用钟表镊去除伤口处的皮肤敷料，并将参考底座与相机镜头对齐。
7. 安装摄影箱前壁，使用以下参数拍摄宏观图像：光圈f/3.2，曝光时间1/200秒，ISO感光度80，焦距4 mm。
8. 使用钟表镊在移除麻醉面罩前，将直径为1 cm的皮肤敷料覆盖于伤口上。将小鼠转移至单独的笼具中，并观察直至运动功能恢复。

5. 图像处理

1. 生成宏观图像的备份副本。使用 ImageJ 软件处理图像。
2. 通过以下路径在 ImageJ 中打开备份图像： 文件 > 开放 > 搜索 在图像中，然后单击“打开”。
3. 通过参考标尺缩放图像：最大化图像，选择 直线 工具，使用 + 键放大鼠标旁的标尺，对标尺图像绘制一条 10 mm 的直线，然后进入 分析 > 设定比例尺 > 输入“10” 用于 已知距离 > 设置 长度单位 到 毫米，然后点击 好的。这确定了宏观图像的像素与距离的比率（图 2D).
4. 将伤口区域从图像中分离：使用矩形工具选择伤口周围的区域（w = 150，h = 150）。记录 X 和 Y 值，右键单击 矩形 > 重复 > 命名主题 > 按 Enter 键在新图像中，按 + 键两次以放大图2E).
5. 按照以下路径保存裁剪后的图像： 文件 > 另存为 > 蒂芙 > 输入名称 > 保存.
6. 复制裁剪后的图像以避免在分割过程中被修改：右键单击 裁剪后的图像 > 重复 > 命名它 通过在末尾添加“Segmentation”来实现。接着按 Enter 键。在新图像中，连续按 + 键两次以放大。
7. 通过以下路径将图像按颜色通道分离： 图像 > 类型 > RGB 图像堆栈在红色通道图像（1/3 Red）中，右键单击 重复，然后按压 好的 在“重复”窗口中。
8. 分割红色通道图像。单击红色通道图像， 图像 > 调节 > 阈值接下来，选择 默认 > 应用 (图2F).
9. 校正感兴趣区域（ROI），以确保伤口完全覆盖并避免分割失真。
   注意：如果伤口周围区域未包含在分割范围内，请前往 过程 > 二元的 > 填补孔洞. 若要去除伤口外的黑点，请前往 过程 > 二元的 > 侵蚀如果“侵蚀”命令减小了伤口尺寸，请使用“处理”命令进行校正 > 二元的 > 稀释。
10. 标记感兴趣区域（ROI）的边界： 编辑 > 选择 > 创建选区ROI 将以黄色标出。通过以下步骤将其添加到 ROI 管理器中 编辑 > 选择 > 添加到管理器 (图 2G).
11. 验证分割结果：打开 ROI 管理器窗口，选择要查看的 ROI： 更多 > 翻译输入第4步记录的X值和Y值，然后按压 好的.
    1. 最大化原始图像，然后选择 感兴趣区域 在 ROI 管理器. 使用方向键调整 ROI，直至其与伤口对齐（图2H）。如果该ROI与伤口吻合，则分割成功；否则，从步骤2开始重复操作。
12. 确认分割后，获取伤口的测量数据： 分析 > 测量结果表格将显示面积、周长以及X/Y坐标值。将这些数值复制到SPSS软件中，用于记录和统计分析。图 2I).

图2：使用数字平面测量法和图像分割技术进行伤口测量的工作流程。（A）使用无菌5 mm活检打孔器进行真皮-表皮切口。（B）将小鼠置于吸入麻醉舱中麻醉3分钟。（C）将麻醉后的小鼠置于摄影舱内，将其鼻部固定于七氟烷面罩中进行拍照记录。（D）在ImageJ中打开所获图像，并以标尺为参考进行图像标定。（E）使用矩形工具提取伤口区域。（F）将图像分离为RGB通道，并对红色通道进行处理。（G）勾画并管理感兴趣区域（ROI）。（H）通过将ROI与伤口轮廓匹配来验证分割结果。（I）测量伤口参数，并记录结果用于统计分析。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 术后安乐死

注意：研究在第14天结束，此时健康啮齿类动物的伤口通常已达到愈合的较晚期阶段。在此阶段，根据机构批准的安乐死程序对小鼠实施人道安乐死。

1. 准备设备。确保安乐死舱干净、干燥，且大小合适，能够容纳小鼠而不至于过度拥挤。将舱体连接至带有流量调节器的医用级 CO₂ 气源。
2. 轻柔地将小鼠转移至舱内，以尽量减少应激反应。确保其处于安静环境，尽量减少外界干扰。
3. 根据《动物安乐死美国兽医医学协会指南》的建议，将 CO₂ 流速设定为每分钟舱体体积的 30%–70%。逐步增加 CO₂ 浓度，以避免引起小鼠痛苦或不适。
4. 在操作过程中密切观察小鼠。注意其逐渐丧失意识的迹象，包括活动减少、呼吸减缓，随后出现呼吸停止和心脏停搏。
5. 当小鼠停止呼吸且无任何运动迹象时，确认其死亡；再等待额外 1–2 分钟，以确保生命功能完全终止。通过确认反射（如角膜反射）和心脏活动消失来验证死亡。
6. 将尸体转移至指定的生物危害废物容器中。遵循机构规程和国家指南，安全处置动物遗体。
7. 记录实施安乐死的动物数量、日期以及任何相关观察结果，以确保符合伦理和机构标准。

结果

使用 ImageJ 软件对图像进行缩放后，通过数字分割方法获得了伤口的平均周长（表 1）和面积（表 2）及其各自的标准差。这些数值记录自第 0 天至第 14 天（D0–D14）。

<...

天数	周长（mm）
0	22.75 ± 0.8900
1	21.65 ± 0.0200
2	25.25 ± 0.5900
3	24.37 ± 0.1600
4

讨论

在临床前模型中，由于伤口大小、局部炎症反应³⁴、位置和/或操作等因素的影响，对创伤性伤口演变过程进行定量分析面临诸多挑战。目前已有直接手动³⁶和间接数字^11,16,37,38测面积法用于此类测量。与常受观察者偏倚和光照条件差异影响的手动方法研究相比，本研究采用了标准化的数字测面积法。采用手动测量的研究报告了伤口尺寸具有较高的变异性^10,38，而本研究的技术在时间推移中表现出更高的重复性。此外，与其他数字方法^11,16,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mm 皮肤活检打孔器	MILTEX, USA	33-35	用于标记伤口边缘
带聚乙烯芯的铝板	Alucobond,USA	Bright Silver 119	用于构建宏观图像采集台
相机镜头	Sony, Japan	SEL2470Z	用于对拍摄图像进行对焦
电凝器	Bonart, USA	ART-E1	用于消除伤口中可能存在的出血点
钩环扣条	VELCRO
IBM SPSS Statistics 版本 22	IBM Corporation, USA	https://www.ibm.com/analytics/spss-statistics	用于伤口测量数据（包括面积和周长）的统计分析
ImageJ 版本 1.53t	美国国立卫生研究院, USA	https://imagej.nih.gov/ij/	用于处理宏观图像，包括图像标定、分割以及伤口参数的测量
酮咯酸	SIEGFRIED RHEIN, 墨西哥	493977	用于术后疼痛管理
Miltex 睫状体剪刀，4-1/8" 弯型	MILTEX, USA	V95-306	用于剪切由活检打孔器产生的伤口皮瓣
RGB LED 灯管	ANDOER, 中国	‎ B09F8RLMSY	用于为宏观图像采集台提供照明
半专业相机	Sony, Japan	DSC-HX300	用于拍照
有齿镊	MILTEX, USA	V96-118	用于在切割过程中夹持皮瓣
七氟烷	Baxter, USA	AMX2L9117PR	用于吸入麻醉
戊巴比妥钠	Aranda, 墨西哥	734.448.001.212	用于腹腔注射麻醉
SolidWorks 版本 2015	Dassault Systèmes, 法国	https://www.solidworks.com/	用于设计和创建三维模型，以制造图像记录台的配件
手术刀片	HERGOM, 墨西哥	H10	用于剃除将要制造伤口区域的毛发
透明粘性敷料	3M, USA	F51CA07	用于覆盖创伤性伤口