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用于研究感染相关基因表达的囊性纤维化聚集生物膜模型

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DOI：

10.3791/67477

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2025年4月18日

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1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, University of Liverpool, 2Division of Molecular Microbiology, School of Life Sciences, University of Dundee

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究概述了一种构建多微生物聚集性生物膜模型的框架，并优化了RNA提取方案，以评估反映囊性纤维化肺部环境的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）基因表达。该模型的应用包括在与囊性纤维化相关的条件下评价抗菌效果以及研究抗生素替代方案。

摘要

囊性纤维化患者慢性肺部感染的标准临床前检测方法无法反映其恶劣肺部微环境的实际条件。目前简化的检测条件可能导致某些化合物在缺乏其对囊性纤维化肺部微环境有效性的证据下，仍被推进临床前研发流程。多种用于研究传统抗菌药物的方法可能不适用于抗生素替代疗法，包括抗毒力治疗药物，如抗群体感应剂和铁载体抑制剂。本方案记录了一种聚集性生物膜模型 铜绿假单胞菌 比较单一种类与多种类共培养中与抗性及感染相关基因的表达金黄色葡萄球菌 和 白色念珠菌），检测菌落形成单位（CFU）的减少情况以及基因表达的变化，以 algD 作为代表性基因。该模型针对小体积静态细菌培养物进行优化，适用于药物研发流程中发现阶段新型化合物的研究，此阶段化合物的可获得量通常有限。单一种类 P. aeruginosa 生物膜在合成囊性纤维化培养基2（SCFM2）中培养24小时后，用不同浓度（1、16和256 µg/mL）的美罗培南处理，继续培养24小时。多微生物生物膜通过共培养建立 Staphylococcus aureus 和 白色念珠菌 在SCFM2中混合，然后接种 P. aeruginosa 再孵育24小时并用美罗培南处理。临床前测试中化合物疗效评估与临床试验结果之间缺乏直接关联，这使人对当前实验室筛选工具的适用性产生质疑。该模型使我们能够理解相关因素的影响 P. aeruginosa 基因表达，包括参与耐药性和毒力的基因，从而弥补这一空白。

引言

囊性纤维化（CF）是白种人群中最常见的常染色体隐性遗传病1。囊性纤维化跨膜传导调节因子（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator，CFTR）基因的突变会导致一系列临床症状，包括呼吸道内黏液过度分泌。离子转运功能受损导致黏液脱水，因而无法被黏液纤毛系统有效清除，从而增加慢性肺部感染的易感性1。囊性纤维化患者肺部的微生物组成具有特定的特征，其中流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）被认为是感染婴幼儿及儿童肺部的主要病原体；随着年龄增长，这些病原体的检出率下降，成年后逐渐被伯克霍尔德菌属（Burkholderia spp.）或铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）定植所取代1,2,3,4。除了细菌外，真菌微生物在囊性纤维化肺部环境中也十分常见，其中念珠菌属（Candida spp）和曲霉菌属（Aspergillus spp）是最常分离到的真菌种类3,4,5。尽管这些微生物在囊性纤维化肺部感染中发挥重要作用，但培养技术的进步以及非依赖培养的方法表明，囊性纤维化肺部感染极少仅由单一细菌物种引起，凸显了其复杂的多微生物感染特性1,6。

尽管已有这些认知，目前 体外 和 体内 用于慢性肺部感染的抗生素研发与测试方法尚不能完全模拟囊性纤维化肺部微环境7，重点在于测定药物对单一种类培养物的最低抑菌浓度（MIC）。这种方法对感染微环境的考量有限，而感染微环境正是囊性纤维化肺部病理的关键组成部分8因此，通常采用的方法是将细菌以浮游培养物的形式进行培养，而这种生长状态很可能无法反映细菌在囊性纤维化（CF）患者肺部内的实际状态。这一点尤其重要 P. aeruginosa 通常以生物膜聚集体的形式出现，这些聚集体还常常包含其他细菌和真菌物种9这些因素在测试慢性肺部感染的抗生素时带来了挑战，并凸显了抗生素敏感性检测方法与囊性纤维化肺部环境中抗菌活性之间的差异。9,10这些挑战在筛选抗生素替代品（如抗毒力药物）时尤为突出，因为最小抑菌浓度（MIC）测定法无法指示此类药物的活性，也无法提供关于宿主-病原体相互作用的理解。11.

海藻酸盐是一种细胞外多糖，是 P. aeruginosa 肺部微环境中的生物膜可提高细菌对抗生素和免疫因子的耐受性，并增强其对表面的黏附能力12海藻酸盐是抗毒力治疗开发的一个有吸引力的靶点，目前已开发出多种针对海藻酸盐生物合成的治疗剂，例如靶向 algD, 海藻酸盐生物合成中的一个关键基因13,14此类治疗可与囊性纤维化患者的抗生素治疗联合使用，以破坏 P. aeruginosa 生物膜，使细菌转化为浮游状态。这会提高抗生素的疗效，因为破坏生物膜的胞外基质可增强抗生素到达细菌靶点的能力15。然而，尽管有证据表明 体外 活性，这些治疗药物在囊性纤维化肺部微环境中的作用机制仍不明确。

本文提出的聚集性生物膜模型通过添加S. aureus和C. albicans来解决上述问题，这两种微生物在囊性纤维化（CF）肺部常与P. aeruginosa共同定植。该模型还允许P. aeruginosa以生物膜聚集体的形式生长，更接近其在呼吸道环境中的实际状态。采用模拟痰液成分的合成囊性纤维化培养基2（SCFM2）作为生长所需的营养环境，可引入宿主相关因素的影响，包括黏蛋白、细胞外（e）DNA以及与CF肺内环境一致的氨基酸谱16。

为了进一步模拟囊性纤维化（CF）肺部的环境，将生物膜暴露于美罗培南（meropenem）中，这是一种在肺部症状加重期间经常用于CF患者的抗生素。建议在此模型中使用抗生素，以模拟抗毒力药物可能被处方的临床条件，例如与抗生素联合使用作为组合疗法，以在症状加重期间控制呼吸道症状。此外，加入美罗培南可评估在与感染相关的条件下，P. aeruginosa 对抗生素暴露的转录响应。该模型可用于提供有关在CF肺环境中哪些因子适合作为药物靶点的信息。此外，该模型还可进行调整，以包含其他相关抗生素（如妥布霉素，tobramycin），并评估其他目的基因的表达情况。

在此，利用该多微生物聚集模型，评估Staphylococcus aureus和Candida albicans的存在以及不同浓度的美罗培南（1、16 和 256 µg/mL）对P. aeruginosa中algD表达的影响。美罗培南主要用于治疗P. aeruginosa引起的肺部感染，对S. aureus或C. albicans无直接作用，这两种共存微生物的 MIC 均为>256 µg/mL。

本研究将增进对相关因素（如SCFM2中的宿主因子以及共同定植的微生物）如何影响铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染相关基因表达 的理解，并为开发和测试用于慢性囊性纤维化呼吸道感染的抗毒力疗法奠定基础。

方案

1. 单一物种生物膜的制备

  1. 通过将单个冻存珠接种于胰蛋白胨大豆琼脂（Lysogeny Broth, LB）平板上划线，并在37 °C下培养24小时，复苏铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）PAO1菌株。
  2. 取划线平板上的单个菌落接种至5 mL LB液体培养基中，制备PAO1过夜培养物。37 °C振荡培养18小时后，将菌液稀释至OD600为0.05（相当于1 × 108 CFU/mL），再按1:100比例进一步稀释于根据Palmer等16方法配制的SCFM2培养基中。
  3. 将180 µL菌液接种至96孔圆底微孔板的各孔中。为进行菌落形成单位（CFU）计数，每个生物重复设置三个技术重复孔；仅用于qPCR检测的样本则每个生物重复设置三个独立孔。另取三个独立孔，每孔加入180 µL无菌SCFM2培养基作为培养基对照。
    注意：选择圆底微孔板而非传统的平底板，因其可使整个生物膜与周围培养基接触更均匀，从而提高实验重复性17。
  4. 在37 °C、75 rpm振荡条件下培养24小时，使生物膜充分形成。

2. 多物种生物膜的制备

  1. 按照上述方法，从冻存菌珠中复苏 P. aeruginosa PAO1 和 S. aureus SH1000。通过将单个菌珠划线接种至沙氏葡萄糖琼脂平板，于37 °C培养24小时，复苏C. albicans CAF2.1。
  2. 取划线平板上的单菌落，分别接种于5 mL LB液体培养基中，制备SH1000和CAF2.1的过夜培养物（每种微生物分别培养过夜）。37 °C孵育18小时。将S. aureus SH1000和C. albicans CAF2.1的过夜培养物用LB培养基调整至OD600为0.1，其对应的菌浓度分别为1 × 109和1.2 × 107 CFU/mL17,18。
  3. 将S. aureus和C. albicans菌液稀释，配制成单一接种液，其中两者的浓度分别为1 × 106和1 × 105 CFU/mL，稀释液为SCFM2培养基。
  4. 向96孔微孔板的各孔中加入162 µL上述接种液。每种生物样本设置三个生物学重复，用于菌落形成单位（CFU）计数。仅用于qPCR分析时，每个生物学重复再设三个技术重复。另取三个独立孔，每孔加入180 µL无菌SCFM2培养基，作为空白培养基对照。
  5. 将生物膜在37 °C、75 rpm振荡条件下培养24小时，使其形成。
  6. 取划线平板上的单菌落，接种于5 mL LB培养基中，制备PAO1的过夜培养物。37 °C孵育18小时后，将培养物调整至OD600为0.05（相当于1 × 108 CFU/mL），再用SCFM2培养基进一步稀释至1 × 105 CFU/mL。
  7. 向96孔微孔板的各孔中加入14.2 µL PAO1接种液，使PAO1的最终接种浓度为1 × 104 CFU/mL。
    注：不同物种接种浓度的差异设置，旨在确保在无抗生素存在的24小时生物膜中，S. aureus和C. albicans不会被P. aeruginosa过度竞争抑制，从而可通过点种平板法有效回收所有物种。
  8. 将多微生物生物膜在37 °C、75 rpm振荡条件下继续培养24小时，使其形成。

3. 单物种和多物种生物膜的DNase和抗生素处理

  1. 在含有生物膜的孔中直接加入 2 µL DNase I，使其终浓度为 50 µg/mL，在 37 °C 下孵育 1 小时，并以 75 rpm 振荡。
    注意：添加 DNase I 可降低生物膜的黏稠度，从而促进抗菌剂更好地渗透，该剂量模拟囊性纤维化患者为控制肺部急性加重而使用的重组人 DNase（rhDNase）的给药方案。
  2. 使用蒸馏水作为稀释液，配制浓度为 2.56 mg/mL 的美罗培南抗生素储备液。通过连续两倍稀释法，获得 0.01 mg/mL 至 2.56 mg/mL 的系列浓度。
  3. 向生物膜中加入 20 µL 每种美罗培南稀释液，使终浓度范围为 1 µg/mL 至 256 µg/mL。在阴性对照组生物膜中，用 20 µL 蒸馏水代替抗生素。
  4. 用透明封板膜密封 96 孔微孔板，在 37 °C 下孵育 24 小时，同时以 75 rpm 振荡。

4. 活细胞计数与代谢活性检测

注意：以下步骤仅适用于用于CFU定量的生物膜。

  1. 向生物膜中加入10 µL纤维素酶（100 mg/mL，0.05 M柠檬酸盐缓冲液），在37 °C下以140 rpm振荡孵育1小时。纤维素酶常用于破坏生物膜中的纤维素骨架19,20,21如有需要，可通过上下吹打进一步破坏生物膜，直至无可见团块存在。
  2. 加入10 µL 0.02%刃天青溶液，以评估测试生物膜和对照生物膜的代谢活性，于37 °C、140 rpm振荡孵育1 h。
  3. 使用酶标仪，以540 nm为激发波长，590 nm为发射波长，测定每孔的荧光值。
  4. 通过减去空白培养基样品的荧光值来校正背景荧光，并计算荧光降低百分比，公式为：（F 的平均值经抗生素处理的生物膜平均值 F阴性对照) × 100%
  5. 通过连续稀释并将样品点样接种于选择性琼脂平板上，对含有破坏后生物膜和浮游细胞的各孔内容物进行计数，具体步骤如下：
    假单胞菌 添加1%甘油和CN补充剂的选择性琼脂，用于计数 P. aeruginosa
    用于计数的甘露醇盐琼脂 金黄色葡萄球菌
    添加青霉素（250 U/mL）、链霉素（250 µg/mL）、硫酸庆大霉素（30 µg/mL）和万古霉素（3 µg/mL）的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂，用于计数 C. albicans.
    注意：由于难以将游离的聚集体生物膜与浮游细胞分离，因此对孔内全部内容物进行计数。然而，该方法更能准确反映囊性纤维化肺部的实际情况。培养后，盖子上可能出现冷凝水。为确保孔间无污染，将无菌对照涂布于选择性琼脂平板上。
  6. 在选择性琼脂平板上点种后，于37 °C培养24小时，然后进行计数。

5. 用于RNA提取的生物膜制备

注意：从这一步开始的所有操作仅适用于将进行 RT-qPCR 分析的生物膜样本。

  1. 从37 °C培养箱中取出含有生物膜的96孔微孔板，并将其转移至1 mL微量离心管中。转移时，确保将每次生物学重复的生物膜样本合并，以保证有足够的生物量用于RNA提取。
  2. 将含有生物膜的1.5 mL离心管在16,000 × g 条件下离心5分钟。若当天进行RNA提取，则进入步骤6.2.1；若非当天提取RNA，则吸去上清液，并将沉淀物加入250 µL RNA 稳定液中，于-20 °C保存。该溶液已在多项研究中用于保存细菌沉淀22,23。

6. RNA 提取

  1. 使用商业试剂盒提取单菌种和多菌种生物膜的细菌RNA。按照制造商说明书中的指示配制缓冲液。
  2. 移除培养基上清液并弃去。如果沉淀物保存在稳定溶液中，则将其恢复至室温，并在16,000 × g条件下离心5分钟。将沉淀物重悬于600 µL RNA提取试剂中，然后使用连接在2 mL注射器上的0.2 mm针头手动破碎样品（抽吸5–10次，或直至沉淀物完全破碎）。
  3. 按照制造商说明书中的指示进行RNA纯化步骤。
  4. 使用紫外分光光度计、RNA BR检测试剂盒和配套管进行RNA定量。该检测试剂盒可检测的RNA浓度范围为10 – 1200 ng/µL，因此本实验方案可接受的最低RNA产量为10 ng/µL。
    1. 为样品和标准品（需准备2个标准品）设置所需数量的离心管。
    2. 通过每份样品（包括2个标准品和2个误差预留管）加入199 µL缓冲液和1 µL试剂，配制工作液。
    3. 在不同的离心管中分别加入190 µL工作液以及10 µL标准品1和标准品2。
    4. 在不同的离心管中分别加入199 µL工作液和1 µL RNA样品。涡旋振荡30秒，随后避光放置5分钟。
    5. 在荧光计上选择 RNA > Broad range RNA ，并按照仪器提示操作。
    6. 使用分光光度计评估RNA质量。通过移取1 µL无DNase/RNase水至分光光度计样品台进行空白校正。使用无尘擦拭纸擦去水分，并将吸光度比值设定为260/280 nM。再移取1 µL RNA样品至分光光度计。若RNA纯度较高，则在260至280 nM之间将出现单一吸收峰，且比值约为2.0。
  5. 使用cDNA合成试剂盒将提取的RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。对于浓度超过50 ng/µL的RNA样品，需先用无DNase/RNase水稀释至50 ng/µL。
    1. 使用离心管，根据 表1 配制cDNA反应体系。
    2. 将离心管放入热循环仪中，设置以下反应条件：25 °C孵育5分钟，42 °C孵育30分钟，85 °C孵育5分钟。所得cDNA可立即使用，或于-20 °C冷冻保存。

7. qPCR

  1. 使用qPCR预混液进行qPCR实验。采用以下algD基因和看家基因（16S）引物（表2）。
    注意：引物设计参考了P. aeruginosa的全基因组序列，使用NCBI引物Blast在线工具完成，随后由商业供应商合成。通过NCBI引物Blast工具进行序列比对，验证了引物在多微生物生物膜中的特异性。
  2. 将引物用无DNase/RNase水稀释至4 µM（4 pm/µL），即取20 µL引物加入480 µL无DNase/RNase水中。稀释后的引物可冷冻保存，用于多次实验。
  3. 根据表3中的说明配制qPCR预混液的工作液。
    注意：algD工作液的用量足以满足每个亚胺培南浓度下3次生物学重复和3次技术重复、6个阴性对照以及2次误差余量；16S工作液的用量足以满足2个已知RNA浓度的标准品以及2次误差余量。
  4. 向相应的qPCR反应管中加入18 µL algD工作液。共需准备36个用于algD表达分析的反应管和6个阴性对照管。
  5. 向各qPCR反应管中加入2 µL RNA，向阴性对照管中加入2 µL无DNase/RNase水。
  6. 向相应的qPCR反应管中加入18 µL 16S工作液，共需2个反应管。向这两个qPCR反应管中各加入2 µL已知浓度的RNA。
  7. 按照以下条件进行qPCR扩增：95 °C预变性2分钟，95 °C变性15秒（共40个循环），60 °C退火延伸1分钟。
  8. 采用前述的2-ΔΔCt法分析qPCR结果24。分析algD基因表达时，以0 µg/mL亚胺培南处理组的algD表达水平作为相应生物膜组成的对照，计算相对于未处理培养物的表达倍数变化。

结果

所示结果 图1A 突出单物种的恢复力 假单胞菌 当使用美罗培南处理时，生物膜未表现出显著减少，因为在所有测试剂量下均未观察到显著下降。未暴露于美罗培南的阴性对照组显示出8.31 ± 0.07 Log的恢复值10CFU/mL，而活菌数减少最显著的情况出现在 16 µg/mL，回收率为 8.06 ± 0.10 Log10CFU/mL。然而，这种耐药水平是可预期的，因为文献表明 P. aeruginosa 生物膜对美罗培南的耐药性远高于其浮游状态的对应物，所需浓度 >256 µg/mL 对生物膜具有杀菌作用25,26，与浮游细胞相比，其MIC为 2 µg/mL.

图1B 显示了与未暴露于美罗培南的对照生物膜相比，单培养的 P. aeruginosa 生物膜在不同抗生素浓度下代谢活性的平均降低百分比。荧光强度的降低代表代谢活性减少，可作为活细胞数量减少的替代指标。经美罗培南处理的培养物显示出代谢活性增加（以负的百分比降低表示），表明该药物无杀菌作用（或杀菌作用非常有限）。

代谢活性增加但菌落形成单位（CFU）回收量未增加，可能表明细菌对暴露于抗生素产生的代谢响应。在单一种类与多种类生物膜之间（图2），总体生长情况 P. aeruginosa 仅略有差异，单一种类生物膜中可存活细胞的回收率为 0.74 ± 0.17 Log10CFU/mL，高于未添加抗生素时多微生物生物膜中的数值。 S. aureus 从多微生物生物膜中回收的菌量为 6.95 ± 0.11 Log10CFU/mL，以及 C. albicans 1.66 ± 2.88 Log 被回收10CFU/mL 白色念珠菌， 然而，该现象仅出现在未添加美罗培南的环境中，在已施用该抗生素的任何生物膜中均未观察到。由于美罗培南对念珠菌无直接作用，这一点已在实验室先前开展的最小抑菌浓度（MIC）测定实验中得到证实。 C. albicans 单一培养中亚胺培南的MIC值 >256 µg/mL很可能是其他共栖物种的细菌应激反应， S. aureus 和 P. aeruginosa 导致真菌生存环境恶劣的抗生素暴露。

由于铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物膜在单培养以及与共定植病原体共同培养时，在美罗培南浓度高达256 µg/mL的情况下仍无活菌回收量的减少，这凸显了临床上需要采用替代疗法（如抗毒力疗法）来应对此类慢性感染，此类疗法或可与抗菌药物联用，以有效降低细菌负荷。

algD 表达在 P. aeruginosa PAO1单物种生物膜
表达的 algD 在 P. aeruginosa PAO1 暴露于不同浓度的美罗培南（1、16 和 256 µg/mL在SCFM2中培养的菌株使用SYBR Green RT-qPCR检测。随后采用2-ΔΔCt法分析基因表达水平，以 16S 用作对照基因（图3）。表达的 algD 在所使用的美罗培南浓度之间未表现出显著差异，表明当PAO1以单一种类生物膜形式生长时 algD 美罗培南的存在对表达影响不大。

algD 表达于 P. aeruginosa PAO1 多物种生物膜
表达 algD 也进行了评估 P. aeruginosa 由生物膜中生长的PAO1组成 S. aureus SH100 和 C. albicans CAF2.1 以评估共定植微生物的存在是否影响了基因表达 algD 或对PAO1中亚胺培南的反应。无显著差异 algD 在 0- 之间观察到表达16 µg/mL 美罗培南暴露。然而，在 256 µg/mL，表达的 algD 显著高于其他抗生素浓度（0 µg/mL 与 256 µg/mLp = 0.0075, 1 µg/mL 与 256 µg/mL p = 0.035， 16 µg/mL 与 256 µg/mL p = 0.0048），约为对照组条件的7倍图4）。这表明，在存在 S. aureus 和 白色念珠菌， 表达水平升高 algD 在美罗培南最高浓度下，与……相比 P. aeruginosa 单独培养时相比，提示在多微生物环境中海藻酸盐的产生增加。尽管已证明存在差异 algD 单一种类与多物种生物膜之间的表达差异，目前尚不清楚这种表达水平的升高是否由某一特定物种的存在所驱动S. aureus 或 白色念珠菌 或者由这两种微生物共同参与的相互作用是否驱动了该基因表达的变化。

这些结果凸显了理解治疗手段和环境因素对基因表达影响的重要性，特别是在针对毒力因子的治疗策略未来测试中的意义。

铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的细菌生长抑制柱状图与浓度关系。
图 1：由Pseudomonas aeruginosa PAO1 组成的单一种类生物膜。生物膜在 SCFM2 培养基中培养 24 小时，随后用 50 µg/mL DNase I 处理 1 小时，再用不同浓度的美罗培南进一步处理 24 小时。（A）平均 Log10CFU/mL。虚线表示与阴性对照相比，P. aeruginosa 回收量减少 2 个对数级（相当于减少 99%）。（B）相对荧光单位的百分比减少。虚线表示荧光减少 50%，首次超过该点的浓度被视为 MIC50 值。请点击此处查看此图的放大版本。

不同美罗培南浓度下细菌生长（A）和荧光强度降低（B）的曲线图。
图 2：由Pseudomonas aeruginosa PAO1、Staphylococcus aureus SH1000 和 Candida albicans CAF2.1 组成的多物种生物膜。生物膜在 SCFM2 培养基中培养 24 小时，随后用 50 µg/mL DNase I 处理 1 小时，再用不同浓度的美罗培南继续处理 24 小时。虚线表示与阴性对照相比，P. aeruginosa 的回收量减少了 2 个对数级（相当于减少 99%）。统计学显著性通过双因素方差分析（two-way ANOVA）确定，其中 **** 表示 p < 0.0001。请点击此处查看该图的放大版本。

相对表达量与浓度（µg/ml）的柱状图，显示统计分析结果（ns）。
图3： 从单一物种 P. aeruginosa PAO1 中提取的 algD 基因表达情况。 生物膜在SCFM2培养基中培养24小时，用50 µg/mL DNase I处理1小时，随后暴露于不同浓度的美罗培南（0、1、16、256 µg/mL）。采用2-ΔΔCt法分析基因表达，内参基因为16S。显著性检验采用Tukey多重比较检验。请点击此处查看该图的放大版本。

相对表达量与浓度的柱状图；统计学显著性；基因表达分析。
图4：从由 P. aeruginosa PAO1、S. aureus SH1000 和 C. albicans CAF2.1 组成的多物种生物膜中提取的 algD 基因表达情况。生物膜在 SCFM2 培养基中培养，先用 50 µg/mL DNase I 处理 1 小时，再用不同浓度（0、1、16、256 µg/mL）的美罗培南进一步处理 24 小时。采用 2-ΔΔCt 法分析基因表达，内参基因为 16S。**p < 0.01，经 Tukey 多重比较检验确定。请点击此处查看该图的放大版本。

每份cDNA反应体积（μL）
5X iscript 反应混合液4
iscript 逆转录酶1
无DNase/RNase水14
2.5ng RNA1
总反应体积20

表1：cDNA反应主混合液的工作溶液。 每次cDNA反应所需的组分及体积。

基因正向引物反向引物
algDCGCCGAGATGATCAAGTACATGTAGTAGCGCGACAGGTTG
16SACCGCATACGTCCTACGGCGAAGACCTTCTTCACACACG

表2：algD 和 16S 的qPCR正向与反向引物。

每反应体积 (µL)algD 工作体积 (µL)16S 工作体积 (µL)
GoTaq qPCR Master Mix (2X)1044040
正向引物1444
反向引物1444
无 DNase/RNase 水626424
总量 1879272

表3：qPCR预混液的工作溶液。 配制algD和16S qPCR预混液所需的组分及其体积。

补充图1：由铜绿假单胞菌 LESB58、金黄色葡萄球菌 SH1000 和白色念珠菌 CAF2.1 组成的多物种生物膜。生物膜在 SCFM2 培养基中培养 24 小时（n = 3），经 50 µg/mL DNase I 处理 1 小时后，再用不同浓度的美罗培南进一步处理 24 小时。虚线表示与阴性对照相比，P. aeruginosa 的回收量减少 2 个对数级（相当于减少 99%）。采用双因素方差分析进行统计学分析。*p=0.0242，** p=0.0013，**** p <0.0001。请点击此处下载该图。

讨论

这些结果表明，尽管美罗培南常用于管理囊性纤维化患者的肺部加重症状，但它并未显著影响以下微生物的生长 P. aeruginosa 在单物种或多物种生物膜模型中。轻微增加 P. aeruginosa 在采用128 µg/mL和256 µg/mL美罗培南治疗后，两种模型均观察到恢复，这一点与前述结果一致 S. aureus 在多物种生物膜中；然而，这些增加并不显著。下降在 C. albicans 当暴露于美罗培南时，细菌在抗菌压力下可能为真菌创造了不利的生存环境，从而导致上述现象。未观察到显著差异。 algD 不同美罗培南浓度之间的表达差异 P. aeruginosa 作为单一物种生物膜培养。然而， algD 在用256 µg/mL美罗培南处理时，多物种生物膜中的表达显著更高，表明在此条件下藻酸盐的产生可能增加。这些差异在 algD 不同生物膜组成与美罗培南浓度之间的基因表达差异揭示了相关因素对感染相关基因表达的影响，强调了在开发和测试抗生素替代方案时，需考虑抗菌药物使用情况及多菌种感染状态的重要性。

尽管这些模型具有实用性，但在确保成功应用时仍需考虑若干因素。模型的建立 S. aureus 和 C. albicans 在感染前了解生物膜内的状况至关重要 P. aeruginosa 由于存在风险 S. aureus 和 C. albicans 被革兰氏阴性菌在竞争中占据优势。在此生物膜模型中， C. albicans 由于其生存率明显低于……，似乎是一个较差的组合 S. aureus 和 P. aeruginosa 即使在没有抗生素的情况下亦是如此。这表明酵母菌可能因资源竞争处于劣势，或受到生物膜内种间相互作用的负面影响。27,28. 缺失的 C. albicans 尽管美罗培南本身无直接抗真菌活性，但在其存在条件下支持了以下观点：该抗生素的应激反应 S. aureus 对美罗培南的耐药性可能会创造一种不利于生存的环境 C. albicans29,30然而，需要注意的是，菌株的选择可能会对数量产生影响 C. albicans 可从多微生物生物膜模型中回收的微生物。在使用不同方法时，观察到不同的趋势。 P. aeruginosa LESB58 而非 PAO1（补充 图1). 使用LESB58， 白色念珠菌 在所有浓度的美罗培南下均可回收，且实际上显示出轻微增加 P. aeruginosa 由于抗菌物质的作用，浓度降低，导致群落组成发生变化。然而，尽管存在这些差异，本模型仍采用PAO1，因其为实验室参考菌株，可为比较研究提供一致且特征明确的基准。这种一致性对于生物膜内相互作用研究的可重复性以及得出可靠结论至关重要。

由于SCFM2培养基具有较高的黏性，从在该培养基中培养的细菌中提取高产量RNA可能具有挑战性。因此，在RNA提取前使用0.2 mm针头破坏生物膜是提高RNA得率并确保提取到足够浓度（≥10 ng/µL）以用于RT-qPCR的重要步骤。RNA极易降解31，因此提取后，所有涉及RNA的下游操作均应在冰上进行。RNA、cDNA和qPCR引物的反复冻融会增加产物降解的风险，应尽可能避免。在应用这些模型时另一个常见挑战是RNA提取或qPCR检测过程中存在污染风险。可通过在RNA提取前用DNA降解溶液喷洒设备，并在整个操作过程中使用无DNase/RNase的移液器吸头来降低该风险。定期更换无DNase/RNase的水也有助于减少qPCR检测中的污染风险。

本方案选择 algD 作为目标基因，是因为其在藻酸盐合成中具有必要性；藻酸盐被描述为 P. aeruginosa 在急性和慢性感染过程中的一种关键毒力因子32。因此，藻酸盐正日益成为抗毒力治疗药物研究的重要靶点33,34。尽管本模型已被用于评估 algD 的表达，但它也可用于评估其他 P. aeruginosa 基因的表达，以服务于不同的抗毒力药物靶点研究。本研究中选用美罗培南，是由于已有证据表明该抗生素会影响藻酸盐生物合成相关基因的表达，尤其是在 P. aeruginosa 与 C. albicans 共培养时35。此外，美罗培南在临床上常用于治疗和管理 P. aeruginosa 引起的呼吸道感染，突显了其在本模型中的相关应用价值36。然而，在该模型中加入其他不同的抗生素，甚至联合用药处理，也是可行的。将抗生素引入该模型还可使该系统用于研究细菌耐药机制的进化变化，例如 P. aeruginosa 对碳青霉烯类抗生素产生的孔蛋白介导耐药性的形成过程37。该多微生物生物膜模型还可根据需要进行调整，纳入其他相关微生物，例如共生细菌如 Rothia sp. 和 Streptococcus sp.，或替换为其他致病微生物如 Aspergillus sp.，以更好地反映所研究药物候选物的具体需求。

已有研究开发出可模拟囊性纤维化（CF）肺部环境的多微生物生物膜模型38。本文所述模型在既往研究基础上进行了改进，采用适用于小体积微生物培养的实验装置，以提高通量。这一优势在测试新型化合物时尤为突出，因为可用的化合物材料可能有限。由于该模型规模较小且为静态培养，可在不同氧气供应条件下培养生物膜，从而更接近肺部的微需氧环境39,40。出于便于重复实验及成本效益的考虑，本研究中报道的生物膜均在有氧条件下培养。

尽管本研究取得了有价值的发现，但仍需承认存在若干局限性。首先，由于缺乏宿主细胞，该模型在研究以哺乳动物细胞为直接靶点的毒力因子方面应用受限。这凸显了建立此类实验体系所面临的挑战 体外 适用于毒力因子研究的模型，并强调需要进一步开发能够模拟慢性感染恶劣环境的模型。此外，尽管藻酸盐被视为一种毒力因子，但它也是生物膜的关键特征，并由 P. aeruginosa 在实验室和环境中均如此。使用 体外 与使用模型研究其他抗毒力疗法（如抗外毒素药物，其靶点可直接作用于真核细胞）相比，利用模型研究抗生物膜制剂可能更具可行性41.

尽管选择 P. aeruginosa PAO1菌株适用于实验的可重复性与标准化 体外 在模型中，可能需要纳入来自慢性感染的分离株。未来将利用从患者样本中分离的菌株进行该模型的实验，以观察抗菌药物对适应呼吸道生态位菌株的作用效果。

将SCFM2用作痰液模拟物在此项研究中的应用 体外 该模型可在与气道环境相关的条件下，对生物膜聚集体在抗生素治疗过程中的行为变化进行标准化和可重复的观察。相较于原始的SCFM，本研究选用SCFM2的原因在于其含有细胞外DNA（eDNA）和黏蛋白，这些成分对生物膜的形成具有重要支持作用。然而需注意，其他版本的合成痰液培养基也已存在，例如SCFM3，其含有对氨基苯甲酸、NAD+、腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤。42，以及SCFM4（一种缺铁版本）。此外，还可使用由Ruhluel及其同事开发的合成痰液培养基，例如囊性纤维化肺培养基（CFLM）和囊性纤维化鼻窦培养基（CFSM）。43，可实现气道的区室化，以观察抗毒力疗法在不同环境中对多微生物生物膜的行为及效应。

尽管AlgD是海藻酸盐生物合成途径中的关键酶，但仅凭其表达水平不应作为海藻酸盐产量的指标。其他因素，如转录后和翻译后修饰以及调控机制，均可能影响海藻酸盐的产量，导致生物膜形成减少、对环境胁迫的敏感性增加以及抗生素敏感性增强，尤其是在海藻酸盐产量降低的情况下12,14。目前有多种靶向海藻酸盐蛋白的抗毒力疗法正在研发中，对于这些疗法，该模型并不适用于评估其疗效，而直接测定海藻酸盐的产量或功能性读数将更为合适44。此外，某些抗毒力疗法可能靶向海藻酸盐生物合成或调控的不同阶段，因此直接测量海藻酸盐的产量能够更准确地反映疗法对毒力因子的总体效应44。然而，当前研究中的部分抗毒力疗法确实靶向关键的海藻酸盐基因，因此此类基因表达模型适用于研究这些疗法的作用效果13,14。此类技术还可轻松改造用于高通量筛选，从而快速评估大量样本或不同条件，这对于涉及潜在抗毒力化合物初筛的大规模研究具有重要意义。

总体而言，单物种和多物种生物膜模型是研究感染相关基因表达的有力工具 P. aeruginosa 在符合囊性纤维化治疗要求的条件下。大规模推广调节剂治疗已彻底改变了囊性纤维化的医疗格局。然而，尽管囊性纤维化调节剂具有多种临床益处，研究显示某些克隆谱系的 假单胞菌 是 s持续循环，强调需要新的疗法来管理 P. aeruginosa 肺部感染仍然需要关注45,46尽管存在上述局限性，这些模型在药物研发流程的发现阶段仍具有应用价值，可用于评估化合物在囊性纤维化肺部微环境中的有效性，以及新型抗毒力化合物在此环境中与已知抗生素的相互作用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

HL、DN 和 JF 获得了英国囊性纤维化信托基金和美国囊性纤维化基金会资助的“囊性纤维化抗微生物治疗药物开发的循证临床前框架”（PIPE-CF；项目编号：SRC 022）战略研究中心（SRC）项目的支持。TH 获得了英国医学研究理事会（MRC）Discovery Medicine North 博士培训伙伴计划博士生奖学金的支持。我们感谢囊性纤维化信托基金、囊性纤维化基金会（SRC022）以及 MRC DiMEN DTP 项目提供的经费支持

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
多孔板透气密封膜 Sigma Aldrich Z763624
本生灯
纤维素酶（100 mg/mL）Cambridge Bioscience HY-B2220-5g
CN添加剂 Sigma Aldrich 1.07624
Direct-zol RNA Miniprep 试剂盒Zymo ResearchR2050
Dnase I Thermo Fisher ScientificEN0521
无DNase/RNase水VWRJ60610.XC
硫酸庆大霉素（30 µg/mL）Sigma Aldrich G3632
甘油（1%）Thermo Fisher Scientific15514029
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6101
iScript cDNA合成试剂盒 Bio-Rad1708890
青霉素（250 U/mL）Scientfic Laboratory SuppliesP3032-10MU
Qubit 4 荧光仪Thermo Fisher ScientificQ33238
Qubit RNA BR 检测试剂盒 Thermo Fisher ScientificQ10210
Qubit 管Thermo Fisher ScientificQ32856
刃天青溶液（0.02%）Thermo Fisher ScientificR12204
RNA later 溶液InvitrogenAM7021
链霉素（250 µg/mL）Sigma Aldrich S9137
PCR仪（我们使用的是T100 PCR仪）Biorad1861096
TRIzol试剂 Invitrogen15596026
万古霉素（3 µg/mL）Sigma Aldrich 1709007

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