利用点击化学与扩展显微技术可视化细胞内唾液酸化修饰

摘要

本文提出了一种简单的方法，结合代谢寡糖工程、点击化学和扩增显微技术，利用常规显微镜设备即可实现对细胞内唾液酸化N-糖蛋白的高分辨率生物成像。

摘要

代谢标记技术可将生物正交报告分子引入糖类分子中，从而通过点击化学和生物正交化学在细胞内实现分子染料的靶向生物偶联。由于糖基化在涉及分子识别的多种生物过程中发挥关键作用，并影响从癌症、遗传性疾病到病毒和细菌感染等多种病理状态，代谢寡糖工程（MOE）已受到广泛关注。

尽管MOE更常用于检测细胞表面糖缀合物，但它也是研究生理和病理条件下细胞内糖链的重要方法。此类研究极大地受益于高空间分辨率。然而，超分辨率显微镜在大多数实验室中并不普及，且日常使用存在诸多挑战。扩展显微镜是一种新兴的替代技术，通过物理放大带有荧光标记的生物样本，从而提高显微镜的分辨率。该方法将样本包埋于可膨胀的凝胶中，并通过化学处理使其各向同性膨胀，从而无需超分辨率技术即可更精确、更高分辨率地观察亚细胞结构。

本研究展示了通过结合使用MOE和点击化学技术，利用扩增显微镜可视化细胞内唾液酸化聚糖的能力。具体而言，我们提出了一种生物正交标记与扩增显微镜联用的实验方案，该方法采用靶向唾液酸化的报告分子，并可与免疫荧光结合用于共定位研究。该实验流程可用于唾液酸聚糖缀合物的生物合成、细胞内运输及再循环等过程的定位分析。

引言

荧光显微镜虽广泛用于细胞内特定分子的标记与可视化，但其分辨率本质上受限于光的阿贝衍射极限¹，该极限限制了对间距小于约200-250 nm的物体进行分辨的能力。这一限制源于光的波动性质以及显微镜物镜的数值孔径，在对亚细胞结构成像时构成了挑战。克服这些限制有助于在纳米尺度上更深入地理解某些生物过程。

为了突破光的衍射极限，已开发出诸如STORM（随机光学重建显微镜）和STED（受激发射损耗显微镜）等超分辨率显微技术^2,3。STORM依赖于荧光分子的随机激活，使得在任意给定时间内仅有稀疏的子集被成像，从而实现对单个荧光分子的精确定位，并据此重构出高分辨率图像。而STED则通过使用损耗激光选择性地淬灭激发光斑周围区域的荧光，有效缩小点扩散函数，从而提高分辨率。

这些方法与宽场或共聚焦显微镜技术形成对比，后者同时检测所有荧光染料，生成的图像混合了所有衍射图样，无法区分邻近的单个荧光分子，从而导致分辨率下降。然而，这些超分辨率方法需要特定的光源、设备、样品制备条件和/或荧光染料，使得相关技术成本高昂，在大多数实验室中难以获取，且在常规实验中实施困难。这些限制促使科学界寻求其他可实现更高分辨率的替代方案，以兼容现有显微镜设备和常规染色流程。2015年，Boyden 及其同....

方案

1. 细胞接种

注意：在层流罩内的无菌条件下进行以下步骤。本方法可适用于本研究中使用的任何细胞系（HeLa、MCF7、原代成纤维细胞），或研究中常用的大多数贴壁细胞系模型^20,24,25。

1. 在含有10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下，在T75培养瓶中培养细胞。
2. 当细胞达到完全汇合时，移除细胞培养基，并用4 mL PBS洗涤细胞。
   注意：本步骤及后续所有洗涤步骤中使用的PBS溶液，必须在使用前通过0.2 µm PTFE膜过滤以实现无菌。
3. 加入2 mL含0.5 g/L胰蛋白酶的1×胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育5分钟，使细胞从培养瓶底部脱落。
4. 加入8 mL含10% FBS的高糖DMEM培养基，充分混匀，确保所有细胞均从培养瓶底部脱离。
5. 将细胞转移至15 mL锥形离心管中，以200 × g离心5分钟。同时，向12孔板的每个孔中加入一片盖玻片（直径12 mm，厚度130–160 µm）。
   注意：盖玻片的厚度应根据后续成像步骤所用显微镜的要求进行调整。<....

结果

下图展示了该方案在HeLa细胞（图3A）和MCF7细胞（图3B）中用于可视化唾液酸化糖蛋白的应用，未进行CQ处理（方案第2节）以及免疫荧光共定位染色（方案步骤5.3）。

图3：ExM实验前（左）与ExM实验后（右）唾液酸化标记模式的比较。（A）HeLa细胞和（B）MCF7细胞用500.......

讨论

目前的CuAAC标记方案在反应缓冲液中不包含氨基胍。由于该方案旨在可视化细胞内糖缀合物，因此在代谢标记步骤之后对细胞进行固定，再进行标记操作，以避免任何细胞毒性问题，并提高催化体系的摄取效率。通常建议在活细胞表面标记时使用氨基胍，以防止脱氢抗坏血酸与蛋白质中的精氨酸、组氨酸和赖氨酸残基发生副反应²⁸。这些修饰可能影响蛋白质功能，并可能导致细胞功能紊乱或细胞毒性。关于CuAAC反应缓冲液的另一个重要考虑因素是，BTTAA对铜离子的络合虽然迅速，但并非瞬时完成。为了确保对修饰糖的有效标记，我们建议在开始标记前至少30分钟配制该溶液，以保证新手用户获得可重复的实验结果。

可使用任意共聚焦显微镜进行图像采集。随着样品的膨胀，可观测视野也随之扩大。为完整捕获整个细胞，建议对区域进行平铺扫描，图像间重叠10%。尽管可以同时进行平铺扫描和z轴层扫，但我们建议在此情况下采用较小的平铺扫描范围，因为该过程耗时较长且会产生大量原始数据，导致后续数据处理负担加重。建议将这两种方法分开进行，仅对感兴趣区域创建z轴层扫，其参数应与膨胀前的z轴层扫保持一致。由于.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(+) L-抗坏血酸钠	Sigma Aldrich	11140
12孔细胞培养板	Corning	3513
丙烯酰胺	Sigma Aldrich	A8887
N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯	Sigma Aldrich	A8060
Alexa Fluor 488 炔烃	Jena Bioscience	CLK-1277-5
Alexa Fluor 546 山羊抗小鼠IgG	Invitrogen	A11003
过硫酸铵	Sigma Aldrich	9913
双丙烯酰胺	Sigma Aldrich	146072
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	A7906
BTTAA	Jena Bioscience	CLK-067-100
2 mL 离心管	EPPENDORF	30120094
磷酸氯喹二盐酸盐	Sigma Aldrich	C6628
15 mL 锥形管	Falcon	352097
盖玻片 12 mm #1	epredia	CB00120RA120MNZ0
盖玻片 32 mm #1	epredia	CB00320RA140MNZ0
CuSO4	Sigma Aldrich	209198
DMEM 高糖培养基	Dutscher	L0104-500
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）	Dutscher	L0615-500
胎牛血清	biowest	S1810-500
成纤维细胞 533T	-	-	取自健康个体
FIJI ImageJ 2.9.0	-	-
明胶	Bio-RAD	170-6537
盐酸胍	Sigma Aldrich	50950
HeLa 细胞	ATCC	CCL-2
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	14533
Imaris 10.2	-	-
K2HPO4	Euromedex	PB0447-B	无水
LSM 780 共聚焦显微镜	Zeiss	-
MCF7	ATCC	HTB-22
N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）	BIOSYNTH	MA05269
NaCl	Carlo Erba	479687
N-叠氮乙酰甘露糖胺（ManNAz）	BIOSYNTH	MA46002
物镜 "Plan-Apochromat" 63x/1.4 油镜 DIC M27	Zeiss	420782-9900-799
磷酸盐缓冲液（PBS）10x	Euromedex	ET330
蛋白酶K	Sigma Aldrich	P2308	来源于 Tritirachium album
纯化小鼠GM130抗体	BD Bioscience	610822	50 µg
丙烯酸钠	Sigma Aldrich	408220
T75 培养瓶	Corning	430641
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Tris-乙酸-EDTA缓冲液（TAE）10x	Euromedex	EU0202-B
吐温X-100	Sigma Aldrich	X-100
台盼蓝	Dutscher	702630
胰蛋白酶-EDTA 1x	Dutscher	L0930-100