本文提出了一种简单的方法，结合代谢寡糖工程、点击化学和扩增显微技术，利用常规显微镜设备即可实现对细胞内唾液酸化N-糖蛋白的高分辨率生物成像。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
代谢标记技术可将生物正交报告分子引入糖类分子中，从而通过点击化学和生物正交化学在细胞内实现分子染料的靶向生物偶联。由于糖基化在涉及分子识别的多种生物过程中发挥关键作用，并影响从癌症、遗传性疾病到病毒和细菌感染等多种病理状态，代谢寡糖工程（MOE）已受到广泛关注。
尽管MOE更常用于检测细胞表面糖缀合物，但它也是研究生理和病理条件下细胞内糖链的重要方法。此类研究极大地受益于高空间分辨率。然而，超分辨率显微镜在大多数实验室中并不普及，且日常使用存在诸多挑战。扩展显微镜是一种新兴的替代技术，通过物理放大带有荧光标记的生物样本，从而提高显微镜的分辨率。该方法将样本包埋于可膨胀的凝胶中，并通过化学处理使其各向同性膨胀，从而无需超分辨率技术即可更精确、更高分辨率地观察亚细胞结构。
本研究展示了通过结合使用MOE和点击化学技术，利用扩增显微镜可视化细胞内唾液酸化聚糖的能力。具体而言，我们提出了一种生物正交标记与扩增显微镜联用的实验方案，该方法采用靶向唾液酸化的报告分子，并可与免疫荧光结合用于共定位研究。该实验流程可用于唾液酸聚糖缀合物的生物合成、细胞内运输及再循环等过程的定位分析。
引言
荧光显微镜虽广泛用于细胞内特定分子的标记与可视化，但其分辨率本质上受限于光的阿贝衍射极限1，该极限限制了对间距小于约200-250 nm的物体进行分辨的能力。这一限制源于光的波动性质以及显微镜物镜的数值孔径，在对亚细胞结构成像时构成了挑战。克服这些限制有助于在纳米尺度上更深入地理解某些生物过程。
为了突破光的衍射极限，已开发出诸如STORM（随机光学重建显微镜）和STED（受激发射损耗显微镜）等超分辨率显微技术2,3。STORM依赖于荧光分子的随机激活，使得在任意给定时间内仅有稀疏的子集被成像，从而实现对单个荧光分子的精确定位，并据此重构出高分辨率图像。而STED则通过使用损耗激光选择性地淬灭激发光斑周围区域的荧光，有效缩小点扩散函数，从而提高分辨率。
这些方法与宽场或共聚焦显微镜技术形成对比，后者同时检测所有荧光染料，生成的图像混合了所有衍射图样，无法区分邻近的单个荧光分子，从而导致分辨率下降。然而，这些超分辨率方法需要特定的光源、设备、样品制备条件和/或荧光染料，使得相关技术成本高昂，在大多数实验室中难以获取，且在常规实验中实施困难。这些限制促使科学界寻求其他可实现更高分辨率的替代方案，以兼容现有显微镜设备和常规染色流程。2015年，Boyden 及其同事开发出一种通过物理性扩增样品以克服光学显微镜局限性的方法，称为扩展显微镜技术（Expansion Microscopy, ExM）。4.
ExM 是一种三步法，可在不突破光的衍射极限的情况下提供生物样本的纳米级细节（图1）。该方法通过常规的衍射极限显微镜对已发生各向同性物理放大后的样本进行成像。第一步称为凝胶化，即将生物样本（通常为固定的细胞或组织）包埋于基于丙烯酸钠和丙烯酰胺的可膨胀聚电解质水凝胶中。随后，生物样本经过酶处理，以部分降解某些组分（如蛋白质或膜结构），并破坏致密的细胞结构，确保细胞能够均匀膨胀。此步骤称为消化，通过使样本的结构组分在力学性质上趋于均一，防止因差异性膨胀而导致样本形变。最后，在第三步（称为膨胀）中，将包埋于水凝胶中并已完成消化的样本置于去离子水中，使其发生溶胀。该技术使样本在各个维度上实现约4–5倍的线性放大倍数，从而可利用标准显微镜技术观察到精细的细胞结构。由于膨胀具有各向同性，凝胶基质中放大的生物样本可保持其三维几何结构以及各结构组分之间的空间关系。因此，溶胀过程中空间信息得以保留，而凝胶锚定的荧光标记物或生物分子之间的距离则在所有方向上均匀增加，从而实现信号的更好分离，提高分辨率。
图1：ExM 实验流程概览。 （a）凝胶化：将生物样本锚定并包埋于可膨胀的聚电解质水凝胶中。（b）消化：利用酶和去污剂均一化样本的机械特性，降解可能限制膨胀并导致形变的蛋白质和脂质膜。（c）扩展：将水凝胶浸入去离子水中，使其发生各向同性膨胀。请点击此处查看该图的放大版本。
自2015年以来，扩张显微技术（ExM）在空间信息的保存方面取得了显著的技术进步。特别是，已设计出多种分子锚定物，可将生物分子直接共价连接至可膨胀水凝胶5,6在本方案中，我们使用了 N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（NAS），可与生物分子中的游离胺基（通常为赖氨酸残基或 N-蛋白质的末端位置）将丙烯酰基团共价连接至细胞蛋白质（包括糖蛋白）。在凝胶过程中，该丙烯酰基团通过交联反应与其他单体发生反应，从而将这些生物分子直接锚定在聚合物上。
ExM 可与多种标记方法兼容，包括代谢寡糖工程（Metabolic Oligosaccharide Engineering, MOE）。MOE 是一种强大的工具，可通过引入带有生物正交化学手柄的代谢前体类似物来实现对聚糖的标记7。这些类似物被称为化学报告分子，可整合到代谢通路中且不会引起毒性。在 MOE 方法中，报告单糖经代谢转化为活化的核苷酸糖，随后被转移至新生的糖缀合物上。我们的主要研究重点是唾液酸化修饰，特别是唾液酸化 N-糖蛋白的细胞内动态变化及其运输过程。由于唾液酸化在细胞间相互作用、免疫调控和发育过程中发挥关键作用，因此在健康与疾病背景下具有重要意义。异常的唾液酸化与多种疾病相关，包括癌症8,9,10,11、感染性疾病12以及遗传性疾病13,14,15，使其成为治疗开发和生物标志物发现的关键靶点。深入理解唾液酸化有助于揭示糖生物学机制及疾病发生发展的过程。
可以使用唾液酸（Neu5Ac）最丰富的前体物质——N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）类似物，或其代谢前体N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）类似物（带有生物正交标记）结合代谢寡糖工程（MOE）来检测唾液酸化修饰8,16。ManNAc在细胞质中被转化为Neu5Ac，随后在细胞核内活化为胞苷-5′-单磷酸-N-神经氨酸（CMP-Neu5Ac）。一旦活化为核苷酸糖，高尔基体中的唾液酸转移酶便会将Neu5Ac单元转移至糖链末端的延伸位置（图2）。在非天然ManNAc衍生物经代谢掺入后，带有标签的唾液酸化糖链可通过生物正交点击化学反应，与携带互补反应基团的荧光染料共价连接。这使得糖缀合物可在活体（in vivo）或离体（ex vivo）条件下被直接观察。
对于大多数单糖探针而言，需要以全乙酰化形式通过被动扩散穿过质膜。然而，已有研究表明，全乙酰化和非保护形式的探针均可有效检测唾液酸化16。非保护型唾液酸化探针可通过主动运输机制进入细胞，其中Neu5Ac类似物通过胞饮作用进入，而ManNAc则通过一种尚未明确的转运蛋白进入。尽管非保护型糖类需要较高浓度（通常为100–500 µM）才能达到相当的效果，但一旦进入细胞，便可直接进入唾液酸代谢途径。相比之下，全乙酰化糖类必须首先由细胞内非特异性酯酶完全去乙酰化，才能具备代谢活性。虽然它们可在较低浓度下使用（通常为10–50 µM），但去乙酰化不完全可能干扰酶活性，或导致部分乙酰化的唾液酸类似物被掺入，从而可能影响下游分析结果。此外，乙酸的释放可能引起局部pH变化，进而影响细胞功能。Chen及其同事还证明，全-O-乙酰化糖类可通过非酶促机制与蛋白质中的游离半胱氨酸残基发生反应，导致脱靶掺入和非特异性信号增强17,18。因此，在本实验方案中，我们采用非保护型ManNAc探针。
图2：唾液酸的代谢寡糖工程与标记。 在细胞质中，UDP-GlcNAc 由 GNE/MNK 的 UDP-GlcNAc 2-差向异构酶结构域转化为 ManNAc。随后，ManNAc 在细胞质中被 GNE/MNK 的 ManNAc 6-激酶结构域磷酸化，生成 ManNAc-6-磷酸。N-乙酰神经氨酸合酶催化 ManNAc-6-P 与磷酸烯醇式丙酮酸缩合，生成 Neu5Ac-9-磷酸，后者再由唾液酸磷酸酶去磷酸化生成 Neu5Ac。Neu5Ac 也可通过内吞作用和溶酶体循环的补救通路获得8。在转运至细胞核后，Neu5Ac 由 CMP-唾液酸合成酶转化为 CMP-Neu5Ac。在高尔基体中，CMP-Neu5Ac 是唾液酸转移酶的底物，可将 Neu5Ac 基团引入成熟糖缀合物聚糖链的末端位置，这些糖缀合物最终表达于细胞膜上或被分泌出去。带有生物正交手性基团的 ManNAz 化学探针可通过一种尚未明确的主动转运蛋白进入细胞，并进入代谢通路。在聚糖生物合成后，被整合进聚糖中的标记 Neu5Az 单元可通过 CuAAC 介导的荧光探针偶联进行标记。缩写：NAc = N-乙酰基；UDP-GlcNAc = 尿苷二磷酸N-乙酰葡萄糖胺；ManNAc = N-乙酰甘露糖胺；GNE = UDP-GlcNAc 2-差向异构酶；MNK = ManNAc 6-激酶；ManNAc-6-P = ManNAc-6-磷酸；NANS = N-乙酰神经氨酸合酶；PEP = 磷酸烯醇式丙酮酸；Neu5Ac = N-乙酰神经氨酸；Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-磷酸；NANP = 唾液酸磷酸酶；CMP = 胞苷-5′-单磷酸；CMAS = CMP-唾液酸合成酶；STs = 唾液酸转移酶；ManNAz = N-叠氮乙酰甘露糖胺；Neu5Az = N-叠氮乙酰神经氨酸。请点击此处查看该图的放大版本。
在所有可能的生物正交反应中，我们的研究重点是铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）16,19。根据我们的经验，CuAAC 是在固定细胞中标记细胞内聚糖的最佳选择。该反应在生物正交化学中已被广泛研究并确立，且已在复杂的生物环境中实现标准化，具备扎实的知识基础和优化的实验方案。其快速的动力学确实提供了高反应效率和特异性，并且所涉及的叠氮和炔基易于合成、稳定性高，在活体系统中不存在，且对天然生物分子呈惰性，因此非常适合用于固定细胞的标记，其中铜的毒性不是问题。尽管无铜的环张力促进的炔-叠氮环加成反应（SPAAC）20,21 可避免铜毒性，但其反应动力学较慢，探针体积较大，由于疏水性滞留，往往导致细胞内应用时背景信号较高、信噪比较低；而逆电子需求的Diels-Alder反应（IEDDA）22,23 虽然反应迅速且无需铜催化，但探针合成更为复杂，并需要体积更大的报告基团，这些基团在MOE应用中尚未被充分表征。由于膨胀显微技术（ExM）仅适用于固定细胞，因此CuAAC为生物正交标记提供了一种稳健且高效的解决方案。
本文介绍了一种结合代谢标记、生物正交点击化学和扩张显微技术，用于可视化细胞内唾液酸化糖蛋白的实验方案。在本文描述的实验流程中，我们采用 N-叠氮乙酰甘露糖胺（ManNAz）作为化学报告分子，并在扩张前通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）连接小分子有机荧光染料。糖蛋白在凝胶化、消化和扩张之前，通过NAS试剂锚定于水凝胶中。唾液酸的MOE标记可与免疫荧光方法联合使用，以进行共定位分析；本文以定位于cis-高尔基体的鼠源抗GM130一抗为例进行了演示。该方案适用于处于生理状态的细胞，也可用于经化学处理的细胞。为说明这一点，本文使用氯喹抑制溶酶体功能，从而影响细胞内糖蛋白的加工与运输过程。细胞核染色被用作定位标志，不仅用于识别细胞位置，还可作为评估扩张显微（ExM）处理质量的指标。扩张倍数可通过比较扩张前（preExM）与扩张后（postExM）细胞核的尺寸进行测定。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 细胞接种
注意：在层流罩内的无菌条件下进行以下步骤。本方法可适用于本研究中使用的任何细胞系（HeLa、MCF7、原代成纤维细胞），或研究中常用的大多数贴壁细胞系模型20,24,25。
- 在含有10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下，在T75培养瓶中培养细胞。
- 当细胞达到完全汇合时，移除细胞培养基，并用4 mL PBS洗涤细胞。
注意：本步骤及后续所有洗涤步骤中使用的PBS溶液，必须在使用前通过0.2 µm PTFE膜过滤以实现无菌。 - 加入2 mL含0.5 g/L胰蛋白酶的1×胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C孵育5分钟，使细胞从培养瓶底部脱落。
- 加入8 mL含10% FBS的高糖DMEM培养基，充分混匀，确保所有细胞均从培养瓶底部脱离。
- 将细胞转移至15 mL锥形离心管中，以200 × g离心5分钟。同时，向12孔板的每个孔中加入一片盖玻片（直径12 mm，厚度130–160 µm）。
注意：盖玻片的厚度应根据后续成像步骤所用显微镜的要求进行调整。 - 离心后弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL细胞培养基中。
- 通过血细胞计数法至少进行两次测量，确定每毫升的平均细胞数量。
- 将细胞悬液用细胞培养基稀释至浓度为每毫升300,000个细胞，并向每孔接种1 mL悬液。
- 在含10% FBS的高糖DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时，使细胞贴壁，再进行后续操作。
2. 氯喹处理（可选）
注意：步骤 2.1-2.8 以氯喹为例，说明如何在经外部试剂（抑制剂、效应分子、药物）处理的细胞上应用本方案。对于未经外部试剂处理的细胞，可跳过这些步骤。
- 称取适量的氯喹二磷酸盐（CQ），以配制足量的10 mM储存液。
注意：后续步骤需在超净工作台内的无菌条件下进行。 - 将固体CQ溶于所需体积的去离子水中，配制成终浓度为10 mM的溶液。
- 使用0.2 µm滤器过滤该溶液。
- 将10 mM储存液每份1 mL分装至1.5 mL微量离心管中，并于-20 °C保存。
- 用1 mL PBS洗涤第1.9步制备的细胞样品。
- 在含有10% FBS的9.9 mL高糖DMEM培养基中加入100 µL的10 mM CQ，使CQ的终浓度为100 µM。
- 将细胞在含100 µM CQ的1 mL培养基中，于37 °C、5% CO2条件下孵育8小时。
- 用1 mL PBS洗涤细胞3次。
3. 代谢寡糖工程
- 在含有10% FBS的高糖DMEM培养基中配制5 mM的ManNAz储备液（阴性对照组使用ManNAc）。
注意：储备液的体积应足够，以确保每孔可加入1 mL糖类似物溶液。后续操作均需在超净工作台内无菌条件下进行。 - 将溶液经0.2 µm滤膜过滤后，分装为1 mL每份，于-20 °C保存备用。
- 取步骤3.2中制备的1 mL储备液，加入9 mL含10% FBS的高糖DMEM培养基，稀释后制备含500 µM ManNAz或ManNAc的培养基。
- 将步骤1.9中制备的细胞（用于未处理细胞的实验）或步骤2.8中制备的细胞（用于CQ处理细胞的实验）接种于含1 mL上述含500 µM ManNAz（或对照组含500 µM ManNAc）培养基中，在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
4. 固定与通透处理
注意：所有这些步骤均在通风橱内进行。
- 用 1 mL PBS 清洗样品。
- 每张盖玻片上加入 500 µL 5% 多聚甲醛固定细胞，在室温下静置 15 分钟。
- 用 1 mL PBS 洗涤 3 次。
- 使用足够大的不透明盒子（例如聚苯乙烯盒）并加盖，自制一个湿盒；在盒子底部放置一张湿润的吸水纸，然后在其上铺一层 Parafilm。
注意：关闭湿盒时应能完全遮蔽外部光源，保护样品。 - 将盖玻片放置在 Parafilm 上，细胞面朝上。
注意：应提前在 Parafilm 上标记样品名称或编号。 - 使用含 0.5% (v/v) Triton X-100 的 PBS 溶液，每张盖玻片加 200 µL，室温孵育 15 分钟，进行细胞通透处理。
- 用 200 µL PBS 洗涤 3 次。
5. 荧光标记
- 标记唾液酸化聚糖的CuAAC标记
注意：CuAAC反应缓冲液必须在使用前新鲜配制，且反应物应按指定顺序添加，其中抗坏血酸钠最后加入。在含氧的水溶液中，抗坏血酸还原Cu(II)生成的Cu(I)离子会逐渐重新氧化为Cu(II)，导致抗坏血酸浓度随时间下降。为保证实验结果的可重复性，缓冲液在4 °C下保存不应超过数天，最好在配制当天使用。- 为标记第3节中构建的叠氮修饰唾液酸化聚糖，配制CuAAC反应缓冲液：在去离子水中加入5 µM AlexaFluor 488炔烃（AF488Alk）、150 µM CuSO4、300 µM 2-(4-((双((1-(叔-丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙酸（BTTAA）、0.1 M K2HPO4和2.5 mM抗坏血酸钠。每张盖玻片需200 µL，按需配制足够体积。
- 向每张盖玻片加入200 µL CuAAC缓冲液以启动反应。确保样品被液滴均匀覆盖，在避光条件下室温反应45分钟。
- 用200 µL PBS洗涤3次，以终止反应并去除过量探针和试剂。
- 细胞核染色
- 使用Hoechst 33342进行细胞核标记时，将10 mg/mL的储存液用PBS按1:2000稀释。
注意：可使用其他等效的细胞核复染剂如4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），效果相同。 - 每张盖玻片加入200 µL上述溶液，室温避光孵育5–10分钟。
- 用200 µL PBS洗涤3次。
- 使用Hoechst 33342进行细胞核标记时，将10 mg/mL的储存液用PBS按1:2000稀释。
- 免疫荧光染色
- 配制牛血清白蛋白（BSA）封闭缓冲液：每50 mL缓冲液中含0.1 g明胶、1 g BSA、1 mL胎牛血清（FBS）和49 mL PBS。
- 将样品在200 µL BSA封闭缓冲液中4 °C孵育1小时，避光保护。
- 使用纯化的鼠抗GM130抗体（识别表位：大鼠GM130氨基酸869–982 | RRID: AB_398142）对高尔基体进行免疫荧光染色时，将一抗用已配制的BSA封闭缓冲液按1:100稀释。
注意：本步骤可通过更换为其他特异性一抗，适配于针对不同细胞器的免疫荧光染色，此时稀释比例应根据生产商说明进行调整。 - 向每张盖玻片加入70 µL含抗体的溶液，4 °C孵育1小时，避光。
- 用200 µL PBS洗涤3次。
- 将荧光二抗（Alexa Fluor 546标记的抗小鼠IgG）用BSA封闭缓冲液按1:600稀释，每张盖玻片加入100 µL。
- 室温孵育1小时，避光。
- 用200 µL PBS洗涤3次。
- 将盖玻片转移至6孔板中，加入2 mL PBS，4 °C避光保存数天。
注意：建议始终准备一个平行样本专用于扩增显微镜（preExM）前的成像，作为扩增前后比较的参考，以确认标记模式在扩增后未发生畸变。
6. 样品的预膨胀成像
注意：以下步骤取决于所使用的生物成像设备，可能需要根据仪器的具体要求进行调整。请遵循当地实验室或生物成像平台的规定。此处的步骤 6.1–6.13 在激光扫描共聚焦显微镜上执行。
- 打开显微镜，确保光源（激光器）已预热。启动生物成像采集软件。
- 根据荧光染料选择相应的激光激发波长以创建通道（例如，405 nm 用于细胞核染色，488 nm 用于 AF488Alk 标记的唾液酸化聚糖，546 nm 用于免疫荧光标记）。相应地激活激光器。
- 将直径为 32 mm 的盖玻片（厚度 130–170 µm）放入适配于显微镜的支架中并固定。
- 将步骤 5.3.9 中制备的样品细胞面朝下放置在 32 mm 盖玻片上。滴加一滴去离子水以防止样品干燥。
- 选择合适的物镜，此处为 63 倍油浸物镜，数值孔径为 1.4 或同等规格。
注意：较高的数值孔径可提供更佳的分辨率。使用油浸物镜时，需在物镜与盖玻片之间滴加一滴镜油。 - 将支架放置在显微镜载物台上，位于物镜上方。
- 使用明场或低激光强度荧光模式定位样品中的感兴趣区域。
- 调节焦距。
- 在软件中以实时荧光模式观察细胞。为每个通道设置激光强度。从低激光功率开始，以避免光漂白。逐步增加激光功率，并根据需要调节探测器增益和偏移，以在不引入过多噪声的前提下增强信号，确保荧光清晰可见且不过曝。
注意：应调整参数以最小化背景噪声并避免信号饱和。在一系列实验中，包括阴性对照在内的所有样品必须保持设置一致。 - 根据需要设置图像参数，如针孔大小（例如，1 阿贝单位）、扫描速度（例如，8）、缩放倍数（例如，1）、亮度范围值（例如，16 位）和平均次数（例如.，2）、模式（例如，线扫描）及方法（例如，均值），以达到理想的观察效果。
注意：这些参数依赖于系统和样品，应在采集前进行优化。针孔大小取决于数值孔径、放大倍数和波长：减小针孔可提高分辨率，但会降低信噪比。建议将扫描速度设为较快值（对应每个像素的停留时间较短），以避免光漂白。 - 开始图像采集，并以所需格式保存数据，附带适当的元数据以供后续参考。
- 采集完成后，用镊子夹取样品并滴加少量去离子水，将其放回 6 孔板中。
注意：仅当需要对此特定样品进行扩增时才执行步骤 6.12。否则，应丢弃该样品，并使用其他重复样品进行后续步骤。
7. 扩展显微镜技术方案
注意：尽可能避免光照样品，以防止光漂白。固定和凝胶化步骤在通风橱中进行。
- 锚定
- 将样品与浓度为 3.2 mg/mL 的 N-丙烯酰基琥珀酰亚胺（NAS）在 PBS 中于室温下于机械摇床上孵育 1 小时。每孔加入 500 µL 溶液，需配制足量溶液（储备液：16 mg/mL NAS 溶于 DMSO）。
注意：NAS 可与蛋白质的赖氨酸残基及 N-末端反应，接枝丙烯酰基团，从而在后续步骤中使蛋白质锚定于水凝胶中。 - 用 1 mL PBS 洗涤 3 次。
- 将样品与浓度为 3.2 mg/mL 的 N-丙烯酰基琥珀酰亚胺（NAS）在 PBS 中于室温下于机械摇床上孵育 1 小时。每孔加入 500 µL 溶液，需配制足量溶液（储备液：16 mg/mL NAS 溶于 DMSO）。
- 凝胶化
- 配制单体溶液：在 50 mL 1× PBS（pH 7.4）中加入 5.843 g NaCl、1.25 g 丙烯酰胺、0.075 g 双丙烯酰胺和 4.313 g 丙烯酸钠。每张盖玻片需添加 70 µL 溶液，因此需配制足量溶液。在凝胶化前至少 24 小时将 1 mL 分装液冷冻保存。
警告：单体具有毒性，必须在通风橱内佩戴适当的防护装备进行操作和称量。 - 在一片 Parafilm 上放置 70 µL 单体溶液液滴，随后加入 1.4 µL 10%（v/v）N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TMEDA），再加入 1.4 µL 10%（w/v）过硫酸铵（APS），并将试剂混入液滴中。
注意：交联试剂必须按此特定顺序添加，先加 TMEDA，再加 APS。 - 迅速而小心地将细胞面向下的盖玻片覆盖在溶液上。
- 在湿润环境中室温下静置 1 小时，使溶液完成聚合。
- 配制单体溶液：在 50 mL 1× PBS（pH 7.4）中加入 5.843 g NaCl、1.25 g 丙烯酰胺、0.075 g 双丙烯酰胺和 4.313 g 丙烯酸钠。每张盖玻片需添加 70 µL 溶液，因此需配制足量溶液。在凝胶化前至少 24 小时将 1 mL 分装液冷冻保存。
- 消化
- 配制消化缓冲液：包含 1× TAE 缓冲液、0.5%（v/v）Triton X-100、0.8 M 盐酸胍和 8 U/mL 蛋白酶 K。
注意：消化缓冲液必须新鲜配制，并在使用前于 37 °C 预孵育 30 分钟。 - 向第 7.2 步形成的水凝胶中加入 1 mL 消化缓冲液。在机械摇床上 37 °C 条件下进行消化反应 3 小时。
- 移除消化缓冲液，并用 2 mL 去离子水轻柔洗涤凝胶 3 次。
注意：水凝胶会轻微膨胀并从盖玻片上脱离。
- 配制消化缓冲液：包含 1× TAE 缓冲液、0.5%（v/v）Triton X-100、0.8 M 盐酸胍和 8 U/mL 蛋白酶 K。
- 扩张
- 将水凝胶置于 3 mL 去离子水中膨胀 2 小时，每隔 30 分钟更换一次水。
8. 样品扩增后成像
- 放置一个直径为 32 mm 的盖玻片（厚度 130–170 µm），并将其固定在持载器上。
- 切下一小块 hydrogel 并将其置于盖玻片上，确保细胞位于凝胶底部。
注意：切下的凝胶块应足够大，以提供充足的观察表面积，但不宜过大，以免操作困难并增加断裂风险（推荐尺寸：5 至 8 mm）。放置足够多的 hydrogel 块以覆盖盖玻片的整个表面，这有助于固定凝胶块并防止成像过程中发生漂移。若出现漂移问题，预先用多聚-L-赖氨酸（poly-D-lysine）包被盖玻片可能更为有利6。 - 将持载器放置在显微镜物镜上方的载物台上。
- 使用油浸物镜在激光扫描共聚焦显微镜上进行图像采集，具体操作如步骤 6 所述。
9. 在 ImageJ 中计算膨胀因子（EF）
- 在 ImageJ 免费软件或同等软件中打开成像数据。
- 如果处理多通道图像，通过导航至以下位置将通道分离，并仅在细胞核通道上进行操作 选择图像 | 颜色 | 拆分通道.
- 测量 细胞核直径，通过点击确定阈值，突出显示对应于细胞核的信号 选择图像 | 调整 | 阈值…. 选择一种方法在 默认 下拉菜单中选择最符合图像的选项（例如.，Otsu），并调整 阈值 直到细胞核的轮廓从背景中清晰地显现出来。
注意：每幅图像均需调整阈值设置，因为单一设置可能不适用于所有图像或每个样本。 - 设置测量以确定 费雷特直径 通过点击 选择 分析 | 设置测量…从菜单中选择 费雷特直径 并调整 小数 如有必要。
- 开始图像分析时，点击 选择 分析 | 分析颗粒 确定颗粒的大小；对于 细胞核，选择 5-无穷大 µm² | 显示结果 | 添加到管理器 | 排除边缘区域 & 覆盖开始分析。
- 分析开始时，将出现多个窗口。在结果窗口中，查找 最大费雷特直径 每一项的 细胞核 在柱中 费雷特. 将原始数据复制粘贴到电子表格中并进行计算 平均细胞核大小 用于 预扩增 和 扩增的 样本。
注意：确保每个细胞核对应的感兴趣区域（ROIs）沿细胞核的整个周边完整勾画。 - 按如下方法计算扩增因子（EF）：
EF =
注意：EF 因子决定了样品的扩展倍数。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
下图展示了该方案在HeLa细胞（图3A）和MCF7细胞（图3B）中用于可视化唾液酸化糖蛋白的应用，未进行CQ处理（方案第2节）以及免疫荧光共定位染色（方案步骤5.3）。
图3：ExM实验前（左）与ExM实验后（右）唾液酸化标记模式的比较。（A）HeLa细胞和（B）MCF7细胞用500...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
目前的CuAAC标记方案在反应缓冲液中不包含氨基胍。由于该方案旨在可视化细胞内糖缀合物，因此在代谢标记步骤之后对细胞进行固定，再进行标记操作，以避免任何细胞毒性问题，并提高催化体系的摄取效率。通常建议在活细胞表面标记时使用氨基胍，以防止脱氢抗坏血酸与蛋白质中的精氨酸、组氨酸和赖氨酸残基发生副反应28。这些修饰可能影响蛋白质功能，并可能导致细胞功能紊乱或细胞毒性。关于CuAAC反应缓冲液的另一个重要考虑因素是，BTTAA对铜离子的络合虽然迅速，但并非瞬时完成。为了确保对修饰糖的有效标记，我们建议在开始标记前至少30分钟配制该溶液，以保证新手用户获得可重复的实验结果。
可使用任意共聚焦显微镜进行图像采集。随着样品的膨胀，可观测视野也随之扩大。为完整捕获整个细胞，建议对区域进行平铺扫描，图像间重叠10%。尽管可以同时进行平铺扫描和z轴层扫，但我们建议在此情况下采用较小的平铺扫描范围，因为该过程耗时较长且会产生大量原始数据，导致后续数据处理负担加重。建议将这两种方法分开进行，仅对感兴趣区域创建z轴层扫，其参数应与膨胀前的z轴层扫保持一致。由于...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
感谢TisBio设施和PLBS平台为我们完成此项工作提供了有利的技术环境。本研究得到了法国国家科学研究中心（CNRS）和法国高等教育与研究部的资助。我们感谢François Foulquier博士、Zoé Durin博士、Dorothée Vicogne女士和Céline Schulz女士提供的有益讨论，以及为我们提供成纤维细胞533T细胞系和GM130一抗抗体。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (+) L-抗坏血酸钠 | Sigma Aldrich | 11140 | |
| 12孔细胞培养板 | Corning | 3513 | |
| 丙烯酰胺 | Sigma Aldrich | A8887 | |
| N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯 | Sigma Aldrich | A8060 | |
| Alexa Fluor 488 炔烃 | Jena Bioscience | CLK-1277-5 | |
| Alexa Fluor 546 山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A11003 | |
| 过硫酸铵 | Sigma Aldrich | 9913 | |
| 双丙烯酰胺 | Sigma Aldrich | 146072 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich | A7906 | |
| BTTAA | Jena Bioscience | CLK-067-100 | |
| 2 mL 离心管 | EPPENDORF | 30120094 | |
| 磷酸氯喹二盐酸盐 | Sigma Aldrich | C6628 | |
| 15 mL 锥形管 | Falcon | 352097 | |
| 盖玻片 12 mm #1 | epredia | CB00120RA120MNZ0 | |
| 盖玻片 32 mm #1 | epredia | CB00320RA140MNZ0 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrich | 209198 | |
| DMEM 高糖培养基 | Dutscher | L0104-500 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS） | Dutscher | L0615-500 | |
| 胎牛血清 | biowest | S1810-500 | |
| 成纤维细胞 533T | - | - | 取自健康个体 |
| FIJI ImageJ 2.9.0 | - | - | |
| 明胶 | Bio-RAD | 170-6537 | |
| 盐酸胍 | Sigma Aldrich | 50950 | |
| HeLa 细胞 | ATCC | CCL-2 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Imaris 10.2 | - | - | |
| K2HPO4 | Euromedex | PB0447-B | 无水 |
| LSM 780 共聚焦显微镜 | Zeiss | - | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| N-乙酰甘露糖胺（ManNAc） | BIOSYNTH | MA05269 | |
| NaCl | Carlo Erba | 479687 | |
| N-叠氮乙酰甘露糖胺（ManNAz） | BIOSYNTH | MA46002 | |
| 物镜 "Plan-Apochromat" 63x/1.4 油镜 DIC M27 | Zeiss | 420782-9900-799 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）10x | Euromedex | ET330 | |
| 蛋白酶K | Sigma Aldrich | P2308 | 来源于 Tritirachium album |
| 纯化小鼠GM130抗体 | BD Bioscience | 610822 | 50 µg |
| 丙烯酸钠 | Sigma Aldrich | 408220 | |
| T75 培养瓶 | Corning | 430641 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Tris-乙酸-EDTA缓冲液（TAE）10x | Euromedex | EU0202-B | |
| 吐温X-100 | Sigma Aldrich | X-100 | |
| 台盼蓝 | Dutscher | 702630 | |
| 胰蛋白酶-EDTA 1x | Dutscher | L0930-100 |
参考文献
- De Souza, N. Light microscopy at the limit. Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).
- Tam, J., Merino, D. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods. J Neurochem. 135, 643-658 (2015).
- Jeong, S., Widengren, J., Lee, J. C. Fluorescent probes for STED optical nanoscopy. Nanomaterials. 12 (1), 21(2021).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543548(2015).
- Kang, S., et al. Expansion microscopy with a thermally adjustable expansion factor using thermoresponsive biospecimen-hydrogel hybrids. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (24), 2896228974(2021).
- Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nat Methods. 18 (1), 107113(2020).
- Dube, D., Bertozzi, C. Metabolic oligosaccharide engineering as a tool for glycobiology. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 616625(2003).
- Scache, J., et al. Switching azide and alkyne tags on bioorthogonal reporters in metabolic labeling of sialylated glycoconjugates: a comparative study. Sci Rep. 12 (1), 22129(2022).
- Holst, S., Wuhrer, M., Rombouts, Y. Glycosylation characteristics of colorectal cancer. Adv Cancer Res. 126, 203256(2015).
- Boyaval, F., et al. N-Glycomic signature of stage II colorectal cancer and its association with the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 20, 100057(2021).
- Ferreira, J. A., et al. Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics. Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).
- Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach. Microbiology. 168 (3), 001157(2022).
- Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
- Vanbeselaere, J., et al. Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG). Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).
- Gilormini, P. A., et al. Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells. J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).
- Rigolot, V., Biot, C., Lion, C. To view your biomolecule, click inside the cell. Angew Chem. 60 (43), 2308423105(2021).
- Qin, W., et al. Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic Glycan Labeling. Angew Chem. 130 (7), 1835-1838 (2018).
- Qin, K., Zhang, H., Zhao, Z., Chen, X. Protein S-glyco-modification through an elimination-addition mechanism. J Am Chem Soc. 142 (20), 9382-9388 (2020).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A. Stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. 41 (14), 25962599(2002).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126 (46), 15046-15047 (2004).
- Mbua, N. E., et al. Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 19121921(2011).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: Fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels-Alder reactivity. J Am Chem Soc. 130 (41), 1351813519(2008).
- Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: Application to pretargeted live cell imaging. Bioconjug Chem. 19 (12), 22972299(2008).
- Bird, R. E., et al. Bioorthogonal chemistry and its applications. Bioconjug Chem. 32 (12), 2457-2479 (2021).
- Slade, P. G., et al. Identifying the CHO secretome using mucin-type O-linked glycosylation and click-chemistry. J Proteome Res. 11 (12), 61756186(2012).
- Gambarotto, D., Hamel, V., Guichard, P. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM). Methods Cell Biol. 161, 5781(2021).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat. Methods. 16, 71-74 (2019).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
- Santiago, F., et al. Synthesis and swelling behaviour of poly(sodium acrylate)/sepiolite superabsorbent composites and nanocomposites. Polym Int. 55 (8), 843848(2006).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 78607867(2020).
- Wen, G., et al. Current progress in expansion microscopy: Chemical strategies and applications. Chem Rev. 123 (6), 32993323(2023).
- Drelich, L., et al. Toward high spatially resolved proteomics using expansion microscopy. Anal Chem. 93 (36), 12195-12203 (2021).
- Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
- Liu, J., et al. Expansion microscopy with multifunctional polymer dots. Adv Mater. 33 (25), 2007854(2021).
- Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
