方法文章

在重力和自制微型生物反应器下使用低粘附条件从各种软骨细胞生成球状体

DOI：

10.3791/67481

⸱

2025年1月31日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Translational Biomedicine, Cell Biology department,, Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

本文内容

摘要

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本研究描述了一种通过在低粘附条件下利用重力将细胞聚集成球状体，然后在微型生物反应器中培养所得球状体来生产软骨细胞球状体的方法。

摘要

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慢性关节疾病中的软骨修复需要先进的基于细胞的疗法来有效地再生受损组织。该方案提供了一种将诱导多能干细胞 （iPSC） 分化为基于软骨细胞的球体的分步方法，支持组织工程和细胞治疗应用。分化过程经过精心设计，以促进软骨形成谱系定型，从在特定培养基中培养的 iPSC 开始，依次引导细胞通过分化的关键阶段。最初，iPSC 扩增以达到最佳汇合度，然后使用一系列确定的培养基变化诱导至软骨形成谱系。到第 10 天，细胞转变为促进软骨形成的培养基，该培养基可增强表达成熟软骨细胞关键标志物的软骨细胞样细胞的形成。在 96 孔琼脂糖包被板中进一步聚集导致形成三维球状体，然后在定制的微型生物反应器中培养，该反应器旨在模拟促进细胞外基质 （ECM） 沉积的微环境。通过实现模拟天然软骨特征的软骨细胞球体的可扩展生产，这种方法为开发基于细胞的软骨缺损治疗方法提供了一种有前途的、可重复的解决方案，为肌肉骨骼再生医学的临床和研究应用提供了广泛的应用。

引言

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由于残疾患者数量的增加和与其护理相关的成本，关节病的流行导致了巨大的经济负担。透明软骨是一种再生潜力有限的结缔无血管组织1。长期使用某些非甾体抗炎药 （NSAID）、糖皮质激素以及化疗或放疗会进一步降低软骨的再生能力，几乎消除其愈合能力2。这使得获得用于细胞治疗的自体软骨细胞变得具有挑战性。

包括软骨细胞在内的三维 （3D） 细胞培养技术长期以来一直被认为是具有巨大潜力的新兴研究领域。这些 3D 结构正在基础生物学研究和再生医学中的应用。源自自体软骨细胞的球状体有望解决软骨组织退化问题，这种情况目前受到全球的广泛关注3。

源自从 iPSC 分化的软骨细胞的球状体代表了原代软骨细胞的有前途的替代品，为软骨修复提供了显着优势。iPSC 提供了几乎无限的自我更新能力，并具有广泛的分化潜力，这允许产生足够数量的软骨细胞用于临床应用，而无需侵入性细胞采集程序4。此外，从传统的二维 （2D） 软骨细胞培养过渡到 3D 培养系统（如软骨球），通过创造更具生理相关性的环境，进一步增强了这些细胞的活力和功能。研究表明，在 3D 球状体中培养的软骨细胞更好地维持其表型，表现出较低的去分....

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方案

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该研究由 LOPUKHIN FRCC PCM 伦理委员会审查和批准（2019 年 4 月 9 日第 2019/02 号协议）。所有供体样本均根据赫尔辛基宣言的原则获得。已获得所有参与者和/或其法定监护人的知情同意。

注意:在整个方案中保持无菌技术。将所有培养基和溶液加热至 37 °C，然后再将其应用于细胞或球状体。在 37 °C 的 CO2 培养箱中培养细胞，在 5% CO2 和 80% 湿度下。协议方案如图 1 所示。

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图 1:从 iPSC 系 IPSRG4S 生产软骨球的方案。 （A） 最初，iPSC 在多能干细胞培养基中培养，直至达到 80% 汇合。（B） 为了诱导向软骨细胞系分化，然后将 iPSC 在培养基 A 中培养 2 天。随后用缺乏 Chir 9....

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结果

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概述的协议如图 1 所示。该方法采用两种不同的培养基，在至少 1 个月的时间内驱动 iPSC 分化为软骨细胞球体（图 2）。当 iPSC 达到 75%-90% 汇合时，分化过程开始（图 1B）。在培养基 A 中培养的第 9-10 天左右出现软骨形成分化的早期指标，其特征是细胞采用软骨细胞的形态特征。在第 10 天，将细胞转移至培养基 B 中（图 1C）并培养直至第 19 天分化完成（图 3）。在这个阶段，99% 的细胞对软骨形成标志物 - 聚集蛋白聚糖 （ACAN）、I 型胶原蛋白 （COL1A2）、II 型胶原蛋白 （COL2A1）、SOX9 呈阳性，并且多能细胞标志物 TRA-1-81 和 OCT4 没有表达。值得注意的是，并非在所有情况下都观察到关键软骨细胞标志物的高水平.......

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讨论

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iPSC 代表了再生医学中的一种变革性工具，具有产生患者特异性软骨细胞用于软骨修复的潜力。目前的方案利用通过中胚层途径的定向分化，TGF-β 和 BMP-2 等关键信号分子促进软骨细胞谱系定型。这些方法旨在复制胚胎软骨发育，从而能够产生细胞外基质成分，例如 II 型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖，这对功能性软骨组织至关重要。3D 培养技术的进步，包括沉淀和悬浮培养，增强了维持稳定软骨细胞表型的能力，同时减少了去分化10,11。

与其他系统相比，生物反应器为培养软骨细胞球体提供了几个关键优势12。生物反应器通过模拟体内条件有效地促进 3D 球体的生长。它们能够发展空间分布的细胞-基质和细胞-细胞相互作用，这对软骨组织的功能特性至关重要。此外，生物反应器可以定制以提供受控的微环境，包括氧转移速率、营养物质流动和剪切应力等参数，这些参数对于维持软骨细胞分化和细胞外基.......

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披露

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作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

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该研究得到了俄罗斯科学基金会分配 #22-15-00250 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶溶液Thermo Fisher Scientific25300-062
0.25% 胰蛋白酶溶液Thermo Fisher Scientific25200-072
Advanced DMEM/F12 Eagle 培养基Thermo Fisher Scientific12634028
聚集蛋白聚糖单克隆抗体InvitrogenAHP0022宿主：小鼠;稀释度：1/500
抗坏血酸SigmaA454450 μg/mL
B-27 补充剂Thermo Fisher Scientific175040441x 或 2%
β-巯基乙醇Serva2862590 mM
BMP2Miltenyi biotec130-110-92210 ng/mL
Chir 99021Miltenyi biotec130-103-92610 μM
COL1A1 （E6A8E） 单克隆抗体CellSignalling39952宿主：兔;稀释度：1/800
COL2A1 （M2139） 单克隆抗体Santa Cruzsc-52658宿主：小鼠;稀释度：1/50
II 型胶原酶溶液 PanEcoP011-20.01%
DAPI（4'，6-二脒基-2-苯吲哚）Sigma-AldrichD9542-5MG1 &μ;
不含谷氨酰胺PanEco？420？
胎牛血清 Thermo Fisher Scientific1027010610%
Hanks 溶液 PanEco？020？
Hybris 8 培养基PanEco？780？/？780
胰岛素-转铁蛋白-硒溶液PanEco？0651x 溶液具有以下浓度： 胰岛素：10 &微量;克/毫升;转铁蛋白：5.5 µ克/毫升;硒 5 ng/mL
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 Thermo Fisher Scientific350500382
mM 基质胶基质BD354277300 &μ;g/mL
青霉素-链霉素溶液PanEco？063？100 U/mL
视黄酸Miltenyi biotec130-117-33910 nM
Rho 激酶抑制剂 Y27632Miltenyi biotec130-103-922 10 毫米
二抗山羊抗小鼠 IgG （H+L） 交叉吸附，Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific A21422宿主：山羊;稀释度：1/500
二抗山羊抗兔 IgG （H+L） 高度交叉吸附，Alexa Fluor Plus 555Thermo Fisher Scientific ？32732主机：山羊;稀释度：1/500
Sox9 （D8G8H） 单克隆抗体CellSignalling82630宿主：Rb;稀释度：1/400
TeSR-1 培养基STEMCELL 技术85850
TGF-β;1 Miltenyi biotec130-095-06710 纳克/毫升

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cieza, A., Causey, K., Kamenov, K., Hanson, S. W., Chatterji, S., Vos, T. Global estimates of the need for rehabilitation based on the Global Burden of Disease study 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 396, e10267(2021).
  2. Hua, C., Buttgereit, F., Combe, B.

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