利用重力条件和自制微型生物反应器在低黏附环境下由不同软骨细胞生成球状体

摘要

本研究描述了一种通过在低黏附条件下利用重力使细胞聚集形成软骨细胞球体，随后将所得球体在微型生物反应器中进行培养的方法。

摘要

慢性关节疾病中的软骨修复需要先进的细胞治疗策略，以有效再生受损组织。本实验方案提供了一种将诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为软骨细胞样球体的逐步操作方法，支持组织工程与细胞治疗的应用。该分化过程经过精心设计，以促进细胞向软骨谱系定向分化：起始阶段将iPSCs在特定培养基中培养，并通过一系列明确的培养基更换，引导细胞依次经历关键的分化阶段。首先扩增iPSCs至最佳汇合度，随后诱导其向软骨谱系分化。至第10天，细胞转入促进软骨形成的培养基，以增强表达成熟软骨细胞关键标志物的软骨样细胞的生成。接着，在96孔琼脂糖包被板中进行进一步聚集，形成三维球体结构，随后将球体转移至定制的微型生物反应器中培养，该反应器可模拟有利于细胞外基质（ECM）沉积的微环境。该方法能够规模化生产具有天然软骨特征的软骨细胞球体，为软骨缺损的细胞治疗提供了具有前景且可重复的技术路径，在肌肉骨骼系统再生医学的临床与科研应用中具有广泛价值。

引言

关节疾病的高发率导致了巨大的经济负担，原因是残疾患者人数不断增加，以及与其护理相关的成本上升。透明软骨是一种无血管的结缔组织，其再生能力有限¹。长期使用某些非甾体抗炎药（NSAIDs）、糖皮质激素以及化疗或放疗会进一步削弱软骨的再生能力，几乎使其丧失自我修复功能²。这使得获取自体软骨细胞用于细胞治疗变得十分困难。

三维（3D）细胞培养技术，包括软骨细胞的三维培养，长期以来被视为具有重要潜力的新兴研究领域。这些3D结构正在被广泛研究，以应用于基础生物学研究和再生医学。源自自体软骨细胞的球状体在治疗软骨组织退行性病变方面具有治疗前景，这一病症目前正受到全球广泛关注³。

由诱导多能干细胞（iPSCs）分化而来的软骨细胞所形成的球状体，为原代软骨细胞提供了一种极具前景的替代方案，在软骨修复中具有显著优势。iPSCs具有近乎无限的自我更新能力以及广泛的分化潜能，能够生成足量的软骨细胞以满足临床应用需求，且无需通过侵入性操作获取细胞⁴。此外，从传统的二维（2D）软骨细胞培养转向三维（3D）培养系统（如软骨球）可进一步提高这些细胞的存活率和功能活性，因其构建了更接近生理状态的微环境。研究表明，在3D球状体中培养的软骨细胞能更好地维持其表型，去分化....

方案

本研究经 LOPUKHIN FRCC PCM 伦理委员会审查并批准（2019 年 4 月 9 日第 2019/02 号协议）。所有供体样本的获取均遵循《赫尔辛基宣言》的原则。已从所有参与者和/或其法定监护人处获得知情同意。

注意：整个实验过程中需保持无菌操作。所有培养基和溶液在使用前应预热至 37 °C。细胞培养条件为 37 °C、5% CO₂、相对湿度 80% 的 CO₂ 培养箱。实验流程示意图见图 1。

图1：从iPSC细胞系IPSRG4S生成软骨球的实验方案。（A）首先，将iPSC在多能干细胞培养基中培养，直至细胞融合度达到80%。（B....

结果

所述方案如图1所示。该方法采用两种不同的培养基，将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为软骨细胞球状体，整个过程至少持续1个月（图2）。当iPSCs达到75%–90%融合度时，启动分化过程（图1B）。在A培养基中培养约第9–10天时，可观察到软骨细胞分化的早期迹象，表现为细胞形态逐渐呈现软骨细胞的典型特征。第10天时，将细胞转移至B培养基（图1C），继续培养至第19天完成分化（图3）。在此阶段，99%的细胞对软骨细胞特异性标志物——聚集蛋白聚糖（Aggrecan, ACAN）、I型胶原（COL1A2）、II型胶原（COL2A1）和SOX9呈阳性，且不表达多能性细胞标志物TRA-1-81和OCT4。值得注意的是，并非在所有情况下均能观察到关键软骨细胞标志物的高水平表达。若软骨球中至少.......

讨论

诱导多能干细胞（iPSCs）是再生医学中的一种变革性工具，具有生成患者特异性软骨细胞以用于软骨修复的潜力。目前的方案利用通过中胚层途径的定向分化，关键信号分子如TGF-β和BMP-2可促进软骨细胞谱系的定向分化。这些方法旨在模拟胚胎期软骨发育过程，从而产生功能性的软骨组织所必需的细胞外基质成分，如II型胶原和聚集蛋白聚糖。三维培养技术的进步，包括团聚培养和悬浮培养，已增强了维持稳定软骨细胞表型的能力，同时减少了去分化现象^10,11。

与其它培养系统相比，生物反应器在培养软骨细胞球体方面具有多项关键优势¹²。生物反应器通过模拟体内环境，有效促进三维球体的生长，能够形成空间分布的细胞-基质和细胞-细胞相互作用，而这些相互作用对于软骨组织的功能特性至关重要。此外，生物反应器可被定制以提供可控的微环境，包括氧气传递速率、营养物流动和剪切应力等参数，这些因素对于维持软骨细胞的分化能力及细胞外基质的生成至关重要

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶溶液	Thermo Fisher Scientific	25300-062
0.25% 胰蛋白酶溶液	Thermo Fisher Scientific	25200-072
Advanced DMEM/F12 Eagle 培养基	Thermo Fisher Scientific	12634028
聚集蛋白聚糖单克隆抗体	Invitrogen	AHP0022	宿主：小鼠；稀释比例：1/500
抗坏血酸	Sigma	A4544	50 μg/mL
B-27 添加剂	Thermo Fisher Scientific	17504044	1x 或 2%
β-巯基乙醇	Serva	28625	90 mM
BMP2	Miltenyi biotec	130-110-922	10 ng/mL
Chir 99021	Miltenyi biotec	130-103-926	10 μM
COL1A1 (E6A8E) 单克隆抗体	CellSignalling	39952	宿主：兔；稀释比例：1/800
COL2A1 (M2139) 单克隆抗体	Santa Cruz	sc-52658	宿主：小鼠；稀释比例：1/50
II 型胶原酶溶液	PanEco	P011-2	0.01%
DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚)	Sigma-Aldrich	D9542-5MG	1 μg/mL
不含谷氨酰胺的 DMEM 培养基	PanEco	?420?
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10270106	10%
Hanks 溶液	PanEco	?020?
Hybris 8 培养基	PanEco	?780?/?780
胰岛素-转铁蛋白-硒溶液	PanEco	?065	1x 溶液的浓度如下：胰岛素：10 µg/mL；转铁蛋白：5.5 µg/mL；硒：5 ng/mL
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	35050038	2 mM
Matrigel 基质	BD	354277	300 μg/mL
青霉素-链霉素溶液	PanEco	?063?	100 U/mL
维甲酸	Miltenyi biotec	130-117-339	10 nM
Rho 激酶抑制剂 Y27632	Miltenyi biotec	130-103-922	10 mM
二抗 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附，Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21422	宿主：山羊；稀释比例：1/500
二抗 山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附，Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher Scientific	?32732	宿主：山羊；稀释比例：1/500
Sox9 (D8G8H) 单克隆抗体	CellSignalling	82630	宿主：兔；稀释比例：1/400
TeSR-1 培养基	STEMCELL technologies	85850
TGF-β1	Miltenyi biotec	130-095-067	10 ng/mL