本研究描述了一种通过在低黏附条件下利用重力使细胞聚集形成软骨细胞球体，随后将所得球体在微型生物反应器中进行培养的方法。
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摘要
摘要
慢性关节疾病中的软骨修复需要先进的细胞治疗策略，以有效再生受损组织。本实验方案提供了一种将诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为软骨细胞样球体的逐步操作方法，支持组织工程与细胞治疗的应用。该分化过程经过精心设计，以促进细胞向软骨谱系定向分化：起始阶段将iPSCs在特定培养基中培养，并通过一系列明确的培养基更换，引导细胞依次经历关键的分化阶段。首先扩增iPSCs至最佳汇合度，随后诱导其向软骨谱系分化。至第10天，细胞转入促进软骨形成的培养基，以增强表达成熟软骨细胞关键标志物的软骨样细胞的生成。接着，在96孔琼脂糖包被板中进行进一步聚集，形成三维球体结构，随后将球体转移至定制的微型生物反应器中培养，该反应器可模拟有利于细胞外基质（ECM）沉积的微环境。该方法能够规模化生产具有天然软骨特征的软骨细胞球体，为软骨缺损的细胞治疗提供了具有前景且可重复的技术路径，在肌肉骨骼系统再生医学的临床与科研应用中具有广泛价值。
引言
关节疾病的高发率导致了巨大的经济负担，原因是残疾患者人数不断增加，以及与其护理相关的成本上升。透明软骨是一种无血管的结缔组织，其再生能力有限1。长期使用某些非甾体抗炎药（NSAIDs）、糖皮质激素以及化疗或放疗会进一步削弱软骨的再生能力，几乎使其丧失自我修复功能2。这使得获取自体软骨细胞用于细胞治疗变得十分困难。
三维（3D）细胞培养技术，包括软骨细胞的三维培养，长期以来被视为具有重要潜力的新兴研究领域。这些3D结构正在被广泛研究，以应用于基础生物学研究和再生医学。源自自体软骨细胞的球状体在治疗软骨组织退行性病变方面具有治疗前景，这一病症目前正受到全球广泛关注3。
由诱导多能干细胞（iPSCs）分化而来的软骨细胞所形成的球状体，为原代软骨细胞提供了一种极具前景的替代方案，在软骨修复中具有显著优势。iPSCs具有近乎无限的自我更新能力以及广泛的分化潜能，能够生成足量的软骨细胞以满足临床应用需求，且无需通过侵入性操作获取细胞4。此外，从传统的二维（2D）软骨细胞培养转向三维（3D）培养系统（如软骨球）可进一步提高这些细胞的存活率和功能活性，因其构建了更接近生理状态的微环境。研究表明，在3D球状体中培养的软骨细胞能更好地维持其表型，去分化程度更低，并且对关键透明软骨标志物（如II型胶原和聚集蛋白聚糖）的表达水平更高5。
尽管iPSC来源的软骨球具有潜在应用价值，但目前仍缺乏标准化的高质量软骨球制备方案。不同研究间的方案差异常导致软骨细胞质量和细胞外基质成分不一致，从而影响其治疗效果6。本文提出了一种优化后的方案，利用价格低廉、自制的微型生物反应器，标准化地从iPSC来源的软骨细胞生成球状体。微型生物反应器培养阶段至关重要，因其提供了一个可控的低黏附环境，有利于营养物质分布、细胞外基质成熟以及球体致密化7。该阶段可促进关键软骨细胞标志物（包括II型胶原、聚集蛋白聚糖和SOX9）的稳定表达，同时形成与天然软骨高度相似的细胞外基质成分。定期更换培养基并严格控制环境条件——温度、CO2浓度和旋转速度——进一步确保了软骨细胞球体的存活率与成熟度。本方案经过优化，能够以经济高效且可放大的方式制备出高表达透明软骨标志物的高质量软骨球，适用于软骨修复领域的科研与临床应用。
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方案
本研究经 LOPUKHIN FRCC PCM 伦理委员会审查并批准（2019 年 4 月 9 日第 2019/02 号协议）。所有供体样本的获取均遵循《赫尔辛基宣言》的原则。已从所有参与者和/或其法定监护人处获得知情同意。
注意：整个实验过程中需保持无菌操作。所有培养基和溶液在使用前应预热至 37 °C。细胞培养条件为 37 °C、5% CO2、相对湿度 80% 的 CO2 培养箱。实验流程示意图见图 1。
图1：从iPSC细胞系IPSRG4S生成软骨球的实验方案。（A）首先，将iPSC在多能干细胞培养基中培养，直至细胞融合度达到80%。（B）为诱导向软骨细胞谱系分化，将iPSC转入培养基A中培养2天。随后更换为不含Chir 99021和Rho激酶抑制剂的培养基配方，并继续培养6天，每2天更换一次培养基。（C）接着将细胞转入培养基B中，以促进接下来10天内的软骨形成。（D）当获得足够数量的细胞后，进入球状体生成阶段。（E）在低黏附条件下，通过重力作用使细胞聚集形成球状体。（F）将所获得的球状体置于微型生物反应器中，并使用培养基B进行培养。请点击此处查看该图的放大版本。
1. 将培养皿转化为微型生物反应器
注意：详见之前的文章5。
- 使用无菌高压灭菌剪刀（灭菌条件：121 °C（250 °F），15 psi，30 分钟，灭菌后干燥 20 分钟）将离心管切成 7–8 mm 高的环状。
- 将低吸附性、未处理或微生物用培养皿压碎成小碎片。将约 1 g 塑料颗粒溶于 10 mL 氯仿中，过夜溶解，以制备液态塑料溶液。该操作应在通风橱中进行。
- 确认液态塑料具有足够的黏稠度以便移液。确保液滴保持球形，而非在表面铺展。若溶液过稀，可加入更多塑料颗粒，通常需 1–3 g；若过稠，则添加额外氯仿，通常最多需 5 mL。
- 在无菌超低吸附性 60 mm 培养皿中心制备塑料凸起，可采用以下两种有效方法之一：
- 方法一：将高压灭菌后的塑料环置于培养皿中心，然后将液态塑料注入环内；每个液滴约需 100–200 µL 液态塑料。
- 方法二：不使用塑料环，直接将相同数量的液态塑料滴加至培养皿中心。
- 将培养皿在超净台中敞口干燥 2–3 小时。干燥后，用紫外线照射 20–30 分钟。
2. 培养皿的明胶处理
- 通过将明胶粉末溶于蒸馏水中，在 95 °C 下配制 0.1% 明胶溶液。将溶液依次通过 0.45 µm 和 0.25 µm 的膜滤器过滤，然后将滤液在 4 °C 下保存。
- 在软骨细胞重接种前立即向 25 cm2 培养瓶中加入 3 mL 明胶溶液（建议每 T25 培养瓶使用不超过 15 g 软骨组织）。在室温（RT）孵育 30 分钟，去除明胶，用 PBS 洗涤两次，然后进行细胞接种。
3. 软骨细胞的分离与培养
注意：软骨细胞取自接受全膝关节置换术患者的非负重区软骨组织。所有标本均需在无菌条件下采集，并储存于含有200 U/mL青霉素/链霉素溶液的DMEM培养基的无菌试管中。软骨组织应置于2-8 °C冰箱中保存。
- 在软骨采集后2天内开始酶处理。使用60 mm培养皿用Hanks'溶液清洗软骨组织，然后用灭菌剪刀将软骨切成直径约1-2 mm的碎片。
- 将软骨组织转移至15 mL离心管中，加入DMEM中含0.01% II型胶原酶的消化液（每1 g软骨约1 mL），在37 °C、5% CO2、100%湿度的CO2培养箱中，于150–200 rpm的旋转摇床上持续振荡消化8–12小时。
- 消化完成后，向15 mL离心管中加入DMEM清洗软骨碎片，然后在300 × g条件下离心10分钟。将沉淀物重悬于软骨细胞培养基（补充表1）中，并接种至预先用0.1%明胶溶液包被的贴壁T25培养瓶中。
- 当软骨细胞达到80%融合密度时进行传代。
- 传代时，先用Hanks'溶液洗涤软骨细胞，然后加入0.25%胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育5分钟。
- 加入等体积含10%胎牛血清（FBS）的DMEM以终止胰酶消化。将软骨细胞重悬于新鲜培养基中，按1:3比例传代，每1 cm2接种20,000–30,000个细胞。
- 将培养瓶置于37 °C、5% CO2、100%湿度的培养箱中培养。
4. 多能干细胞的培养
注意：在芬兰库奥皮奥东芬兰大学神经生物学系分子脑研究组干细胞实验室的合作下，此前一项研究已成功构建了iPSCs细胞系IPSRG4S8。
- 在含有细胞外蛋白的基质包被的6孔板中培养iPSCs（图1A）。使用多能干细胞培养基（补充表1）。
- 当细胞融合度达到80%时进行传代，维持1:4的传代比例（每1 cm2接种50,000–75,000个细胞）。在消化前约2–3小时，将iPSCs转移至含有Rho激酶抑制剂Y27632（终浓度1 µM）的多能干细胞培养基中，处理1天。
- 用Hanks'溶液洗涤iPSCs，随后在37 °C下用0.05%胰蛋白酶溶液孵育。为终止胰酶消化，加入等体积的DMEM + 10% FBS。将细胞悬液在15 mL离心管中以200 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞重悬于新鲜的多能干细胞培养基中。为提高细胞存活率，在培养基中加入Rho激酶抑制剂Y27632，终浓度为1 µM，持续1天。将培养板置于CO2培养箱中，设置条件为37 °C、5% CO2及100%湿度。
5. iPSCs 的软骨形成分化
- 通过在A培养基中培养细胞，启动向软骨细胞谱系的分化补充表1）前2天。第3天时，将培养基A更换为不含Chir 99021和Rho激酶抑制剂的溶液，其余成分保持不变。从第3天至第9天，每2天更换一次培养基（图1B).
- 第10天，将软骨细胞样细胞转移至培养基B（补充表1)，旨在促进软骨形成。每2天更换一次培养基，持续10天（图1C).
- 提前准备96孔细胞悬浮培养板，每孔用1.5%琼脂糖水溶液包被。将琼脂糖置于微波炉中加热至沸腾（700 W下约60–90秒）使其熔化。琼脂糖完全液化后，加入 75 µL 向每个孔中加入琼脂糖，并在室温下静置使其凝固（约15分钟）。
- 添加 150 µL 向每个孔中加入 DMEM 培养基，并将培养板置于 CO₂ 培养箱中孵育2 孵育器中孵育至少12小时。
注意：制备好的平板可在 CO₂ 培养箱中保存长达 1 个月2 孵育箱在 37 °C 如果每个孔中的培养基被补充以补偿蒸发损失。 - 第12天，在观察到与软骨形成相关的表型变化后，利用所获得的类软骨细胞启动类球体的形成。
注意：在此阶段，建议使用免疫细胞化学（ICC）和定量聚合酶链式反应（qPCR）分析关键软骨细胞标志物的表达，可利用第2代-ΔΔCT 方法9 以确认iPSCs成功进行软骨细胞分化。在从6孔板传代至75 cm²培养瓶的过程中2 细胞培养瓶中，可将少量细胞接种至48孔板，孔数与待分析的标记物数量相对应。对这些样品进行免疫细胞化学分析，以验证基因表达。
6. 由软骨细胞样iPSC来源细胞形成球状体
- 获得软骨细胞样衍生物后，在细胞融合度达到80%时进行传代。使用0.05%胰蛋白酶溶液从6孔板中消化细胞。为灭活胰蛋白酶，加入等体积的DMEM + 10% FBS，然后将细胞转移至15 mL离心管中，在200 × g 条件下离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞重悬于1 mL Medium B中，并转移至预先用0.1%明胶溶液包被的75 cm2细胞培养瓶中（图1D）。当细胞以单层形式生长至80%融合度时，再次用胰蛋白酶消化并按上述方法重悬于Medium B中。
- 将细胞以每孔100,000个细胞的密度接种至经1.5%琼脂糖包被的96孔板中。在Medium B中培养，每孔加入150 µL完全培养基（图1D，3A）。
- 将细胞维持在经1.5%琼脂糖包被的96孔板中，至少1天，最多3天，直至形成球状体（图2B）。使用剪去末端的1 mL移液枪头将球状体从孔中转移至15 mL离心管中。静置2–3分钟使球状体沉降，然后弃去上清液。
- 将球状体浸入新鲜解冻、未稀释的基底膜基质溶液中，操作过程中保持溶液温度为4 °C。30分钟后，通过在15 mL离心管中自然沉降或在100 × g 条件下轻柔离心1分钟收集球状体。
注意：基质溶液应在2–8 °C冰箱中冰上过夜解冻。首次解冻后，应将基质分装为单次使用的小份，避免反复冻融。使用聚丙烯或其他耐冷冻管保存，并储存在-70 °C或-20 °C。注意观察批次/批号的有效期，自生产日期起有效期为2年。 - 将球状体转移至微型生物反应器中，并加入6 mL Medium B。将微型生物反应器置于CO2培养箱内的轨道摇床上，设置温度为37 °C，CO2浓度为5%，湿度为100%，振荡速度为70–75 rpm（图1F）。
- 根据培养基消耗情况或酸碱指示剂颜色变化，每周或按需更换培养基。操作时，将球状体在15 mL离心管中静置沉降，小心吸除上清液。向离心管中加入新鲜Medium B，再将球状体重新转移回微型生物反应器中。
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结果
所述方案如图1所示。该方法采用两种不同的培养基，将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为软骨细胞球状体，整个过程至少持续1个月（图2）。当iPSCs达到75%–90%融合度时，启动分化过程（图1B）。在A培养基中培养约第9–10天时，可观察到软骨细胞分化的早期迹象，表现为细胞形态逐渐呈现软骨细胞的典型特征。第10天时，将细胞转移至B培养基（图1C），继续培养至第19天完成分化（图3）。在此阶段，99%的细胞对软骨细胞特异性标志物——聚集蛋白聚糖（Aggrecan, ACAN）、I型胶原（COL1A2）、II型胶原（COL2A1）和SOX9呈阳性，且不表达多能性细胞标志物TRA-1-81和OCT4。值得注意的是，并非在所有情况下均能观察到关键软骨细胞标志物的高水平表达。若软骨球中至少...
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讨论
诱导多能干细胞（iPSCs）是再生医学中的一种变革性工具，具有生成患者特异性软骨细胞以用于软骨修复的潜力。目前的方案利用通过中胚层途径的定向分化，关键信号分子如TGF-β和BMP-2可促进软骨细胞谱系的定向分化。这些方法旨在模拟胚胎期软骨发育过程，从而产生功能性的软骨组织所必需的细胞外基质成分，如II型胶原和聚集蛋白聚糖。三维培养技术的进步，包括团聚培养和悬浮培养，已增强了维持稳定软骨细胞表型的能力，同时减少了去分化现象10,11。
与其它培养系统相比，生物反应器在培养软骨细胞球体方面具有多项关键优势12。生物反应器通过模拟体内环境，有效促进三维球体的生长，能够形成空间分布的细胞-基质和细胞-细胞相互作用，而这些相互作用对于软骨组织的功能特性至关重要。此外，生物反应器可被定制以提供可控的微环境，包括氧气传递速率、营养物流动和剪切应力等参数，这些因素对于维持软骨细胞的分化能力及细胞外基质的生成至关重要
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本研究由俄罗斯科学基金会资助，项目编号 #22-15-00250。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶溶液 | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 | |
| 0.25% 胰蛋白酶溶液 | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Advanced DMEM/F12 Eagle 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| 聚集蛋白聚糖单克隆抗体 | Invitrogen | AHP0022 | 宿主：小鼠；稀释比例：1/500 |
| 抗坏血酸 | Sigma | A4544 | 50 μg/mL |
| B-27 添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | 1x 或 2% |
| β-巯基乙醇 | Serva | 28625 | 90 mM |
| BMP2 | Miltenyi biotec | 130-110-922 | 10 ng/mL |
| Chir 99021 | Miltenyi biotec | 130-103-926 | 10 μM |
| COL1A1 (E6A8E) 单克隆抗体 | CellSignalling | 39952 | 宿主：兔；稀释比例：1/800 |
| COL2A1 (M2139) 单克隆抗体 | Santa Cruz | sc-52658 | 宿主：小鼠；稀释比例：1/50 |
| II 型胶原酶溶液 | PanEco | P011-2 | 0.01% |
| DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | 1 μg/mL |
| 不含谷氨酰胺的 DMEM 培养基 | PanEco | ?420? | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | 10% |
| Hanks 溶液 | PanEco | ?020? | |
| Hybris 8 培养基 | PanEco | ?780?/?780 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒溶液 | PanEco | ?065 | 1x 溶液的浓度如下：胰岛素：10 µg/mL；转铁蛋白：5.5 µg/mL；硒：5 ng/mL |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | 2 mM |
| Matrigel 基质 | BD | 354277 | 300 μg/mL |
| 青霉素-链霉素溶液 | PanEco | ?063? | 100 U/mL |
| 维甲酸 | Miltenyi biotec | 130-117-339 | 10 nM |
| Rho 激酶抑制剂 Y27632 | Miltenyi biotec | 130-103-922 | 10 mM |
| 二抗 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附，Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | 宿主：山羊；稀释比例：1/500 |
| 二抗 山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附，Alexa Fluor Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | ?32732 | 宿主：山羊；稀释比例：1/500 |
| Sox9 (D8G8H) 单克隆抗体 | CellSignalling | 82630 | 宿主：兔；稀释比例：1/400 |
| TeSR-1 培养基 | STEMCELL technologies | 85850 | |
| TGF-β1 | Miltenyi biotec | 130-095-067 | 10 ng/mL |
参考文献
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